滄州市結(jié)核分枝桿菌間隔區(qū)寡核苷酸分型研究

曹新瑞，李雅楠，高會霞，張志，戴二黑△

滄州市結(jié)核分枝桿菌間隔區(qū)寡核苷酸分型研究

曹新瑞1，李雅楠2，高會霞2，張志2，戴二黑2△

目的初步了解滄州市結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的基因多態(tài)性和分子流行病學(xué)特征，探討各基因型與表型耐藥之間的關(guān)系。方法收集結(jié)核病患者經(jīng)臨床分離培養(yǎng)得到的結(jié)核分枝桿菌菌株及相應(yīng)病例信息，提取菌株DNA，采用間隔區(qū)寡核苷酸基因分型法進(jìn)行基因分型研究，采用BACTECTMMGITTM960液體培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行一線抗結(jié)核藥物敏感試驗(yàn)。運(yùn)用BioNumerics 5.0軟件進(jìn)行聚類分析，運(yùn)用Graphpad Prism 5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果154例患者中男109例，女45例；初治121例，復(fù)治33例；34例有吸煙史，12例合并糖尿病。48株（31.2%）至少對鏈霉素、異煙肼、利福平、乙胺丁醇中的1種藥物耐藥。復(fù)治患者的耐藥率（63.6%）顯著高于初治患者耐藥率（22.3%）。典型北京型菌株占所有菌株的91.6%，非典型北京型菌株占8.4%。典型北京型與非典型北京型在患者性別、治療情況、吸煙史、糖尿病史及耐藥分布上的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論滄州市結(jié)核分枝桿菌呈現(xiàn)明顯的基因多態(tài)性。典型北京型菌株是該地區(qū)的優(yōu)勢菌株，且基因型與耐藥性無關(guān)。

分枝桿菌，結(jié)核；微生物敏感性試驗(yàn)；流行病學(xué),分子；聚類分析；基因分型；間隔區(qū)寡核苷酸分型

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的呼吸道傳染性疾病。分子流行病學(xué)研究能夠從病原分子水平監(jiān)測傳染病的暴發(fā)、追蹤傳染源并揭示感染傳播機(jī)制。本研究擬通過間隔區(qū)寡核苷酸分型技術(shù)對滄州市MTB臨床分離株進(jìn)行基因分型研究，以初步了解該市MTB的基因分型特征和分子流行病學(xué)特征，并采用BACTECTMMGITTM960液體培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行一線抗結(jié)核藥物敏感試驗(yàn)，探討各基因型與表型耐藥之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 菌株來源在2014年3月—10月共收集到結(jié)核分枝桿菌臨床分離株154株。所有菌株來源于此期間在滄州市傳染病醫(yī)院就診的結(jié)核病患者的痰標(biāo)本，經(jīng)臨床分離培養(yǎng)獲得，并經(jīng)硝基苯甲酸-噻吩羧酸肼（PNB/TCH）鑒別培養(yǎng)基鑒定的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株。其中，男109例，初治81例，復(fù)治28例；女45例，初治40例，復(fù)治5例。34例有吸煙史，12例患者合并糖尿病。

1.2 主要試劑異煙肼、利福平、乙胺丁醇和鏈霉素含藥培養(yǎng)基購自美國BD公司。DNA提取試劑盒購自美國Qiagen公司，2×Taq Master Mix購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。PCR引物和標(biāo)記探針由北京天一輝遠(yuǎn)生物公司合成。

1.3 藥敏試驗(yàn)采用BACTECTMMGITTM960液體培養(yǎng)技術(shù)，按照《結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊》的液體培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作步驟進(jìn)行［1］。

1.4 DNA提取將菌落從羅氏培養(yǎng)基上刮下，置于200 μL細(xì)菌裂解液中，置于渦流機(jī)充分震蕩。金屬浴100℃，10 min后拿出，置于室溫2 min。13 000×g離心5 min。取上清液移至1.5 mL離心管中。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 間隔區(qū)寡核苷酸分型按照Kamerbeek等［2］建立的spoligotyping標(biāo)準(zhǔn)化程序進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。引物序列DRa:5′-GGTTITGGGTCTGACGAC-3′，5′端用生物素標(biāo)記；DRb:5′-CCGAGAGGGGACG GAAAC-3′。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法運(yùn)用BioNumerics 5.0軟件進(jìn)行聚類分析，使用Graphpad Prism 5.0軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果154株中106株對4種一線抗結(jié)核藥均敏感，48株（31.2%）至少對1種藥物耐藥。其中，12株單耐鏈霉素，9株單耐異煙肼，6株對鏈霉素和異煙肼同時(shí)耐藥，5株對異煙肼和利福平同時(shí)耐藥，13株對鏈霉素、異煙肼和利福平同時(shí)耐藥，3株對4種藥均耐藥。耐多藥菌株有21株，占所有菌株的13.6%，占耐藥株的43.8%。復(fù)治患者的耐藥率顯著高于初治患者的耐藥率，見表1。

Tab.1Association between drug resistance phenotypes and clinical information of patients表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果與患者臨床資料之間的關(guān)系

2.2 間隔區(qū)寡核苷酸分型將指紋圖譜與spoligotyping國際標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫SpolDB 4.0進(jìn)行比對，141株（91.6%）表現(xiàn)為1～34位點(diǎn)雜交呈陰性，為典型北京家族基因型。其中133株（86.4%）在35～43位點(diǎn)均呈雜交陽性，為典型北京家族基因型；而另外8株（5.2%）在35～43位點(diǎn)存在1或2位點(diǎn)雜交陰性，為非典型北京家族基因型。其余13株（8.4%）在1～34位點(diǎn)存在雜交陽性，為非典型北京家族基因型，其中包括6株T1型、4株T2型、2株H3型和1株MANU2型，見圖1。典型北京和非典型北京基因型菌株在不同性別、治療史、吸煙史、糖尿病史中的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

2.3 典型北京型與非北京基因型菌株的耐藥分布特征典型北京與非典型北京基因型菌株在耐藥性分布上的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

Fig.1Fingerprintings of spoligotypes圖1 spoligotyping基因型指紋圖譜

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，滄州市結(jié)核分枝桿菌的總耐藥率為31.2%，略低于2010年全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果（36.8%）［3］。滄州市的初治耐藥率為22.3%，低于北京市的初治耐藥率（30.68%），但獲得性耐藥率為63.6%，高于北京市的獲得性耐藥率（56.14%）［4］。統(tǒng)計(jì)分析顯示，復(fù)治患者的耐藥率顯著高于初治患者，提示抗生素治療是造成菌株耐藥的一個(gè)重要因素。因此臨床上應(yīng)規(guī)范使用抗結(jié)核藥物，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果及時(shí)調(diào)整治療方案，同時(shí)應(yīng)提高患者用藥依從性，從源頭上降低耐藥性的產(chǎn)生。

Tab.2Association between spoligotypes and clinical information of patients表2 spoligotyping基因型與臨床資料之間的關(guān)系

Tab.3Drug resistance characterization of the Beijing and non-Beijing family isolates表3 典型和非典型北京型菌株的耐藥分布特征例（%）

近年來，由于結(jié)核分枝桿菌耐藥株的廣泛傳播使得全球結(jié)核病疫情明顯加劇，其主要原因之一就是結(jié)核分枝桿菌的變異。因此從分子水平研究結(jié)核分枝桿菌的基因特征并進(jìn)行分型鑒定，明確主要流行菌型，以更準(zhǔn)確地預(yù)測和判斷結(jié)核病的暴發(fā)流行及傳播方式，對結(jié)核病的有效防治具有重要意義。

滄州市優(yōu)勢流行菌株為典型北京型菌株，占所有菌株的91.6%，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了T1、T2、MANU2、H3等非典型北京家族基因型。在我國北方地區(qū)典型北京型檢出率達(dá)76.5%［5］，內(nèi)蒙古為93.26%［6］，天津市為93.63%［7］。有研究報(bào)道，典型北京型菌株的耐藥率明顯高于非典型北京型菌株［8］。然而，本研究顯示，典型北京型與非典型北京型的耐藥率無明顯差異，并且在性別、治療史、吸煙史、糖尿病史上的差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，本研究并不支持典型北京型菌株毒力更強(qiáng)、傳播性更廣的觀點(diǎn)。由于本文所收集的菌株數(shù)量不夠大，且時(shí)間相對集中，因此，不能全面、準(zhǔn)確反映滄州市結(jié)核分枝桿菌的基因型分布狀況以及基因型的臨床意義，有待今后收集更多菌株深入研究。

［1］Wang LX.Standard operating procedures and quality assurance manual of drug susceptibility testing on mycobacterium tuberculosis［M］.Beijing：People’s Medical Publishing House，2013：1-40.［王黎霞.結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2013：1-40］.

［2］Kamerbeek J，Schouls L，Kolk A，et al.Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology［J］.J Clin Microbiol，1997，35（4）：907-914.

［3］Technical Guidance Group of the Fifth National TB Epidemiological Survey,the Office of the Fifth National TB Epidemiological Survey. The fifth national tuberculosis epidemiological survey in 2010［J］. Chinese Journal of Antituberculosis，2012，34（8）：485-508.［全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組、全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查辦公室.2010年全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告［J］.中國防癆雜志，2012，34（8）：485-508］.

［4］Zheng CX，Cui ZL.Prevalence survey and analysis of drug-resistant tuberculosis［J］.Laboratory Medicine and Clinic，2014，11（9）：1156-1158.［鄭春秀，崔振玲.耐藥結(jié)核病流行狀況調(diào)查分析［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2014，11（9）：1156-1158］.doi:10.3969/j. issn.1672-9455.2014.09.002.

［5］Pang Y，Xia H，Jiang GL，et al.Genotyping and drug resistance analysis of Mycobacterium tuberculosis from China［J］.Chinese Journal of Laboratory Medicine，2011，34（11）：1023-1028.［逄宇，夏輝，姜廣路，等.中國結(jié)核分枝桿菌寡核苷酸基因分型及其耐藥性分析［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，34（11）：1023-1028］. doi:10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2011.11.014.

［6］Yu Q，Su Y，Lu B，et al.Genetic diversity of Mycobacterium tuberculosis isolates from Inner Mongolia，China［J］.PLoS One 2013，8（5）：e57660.doi:10.1371/journal.pone.0057660.

［7］Xie T，Ju HF，Wang CH，et al.Ancient Mycobacterium tuberculosis Beijinggenotypeclinicalisolatesareassociatedwithdrug resistanceinTianjin，China［J］.ChineseJournalof Antituberculosis，2015，37（9）：928-932.［謝彤，巨韓芳，王春花，等.結(jié)核分枝桿菌北京基因型亞型的流行及與耐藥性的關(guān)系研究［J］.中國防癆雜志，2015，37（9）：928-932］.doi:10.3969/j. issn.1000-6621.2015.09.003.

［8］Lisdawati V，Puspandari N，Rif'ati L，et al.Molecular epidemiology study of Mycobacterium tuberculosis and its susceptibility to antituberculosis drugs in Indonesia［J］.BMC Infect Dis，2015，15：366.doi:10.1186/s12879-015-1101-y.

（2016-02-23收稿2016-08-04修回）

（本文編輯魏杰）

Characterization of Mycobacterium tuberculosis isolates from Cangzhou by spoligotyping

CAO Xinrui1,LI Yanan2,GAO Huixia2,ZHANG Zhi2,DAI Erhei2△
1 Department of Laboratory Medicine,Cangzhou Infectious Disease Hospital,Cangzhou 061000,China; 2 Department of Laboratory Medicine,the Fifth Hospital of Shijiazhuang△

ObjectiveTo identify the genetic polymorphism and molecular epidemiological characteristics of Mycobacterium tuberculosis(TB)clinical isolates in Cangzhou,and explore the association between genotypes and drug resistance phenotypes.MethodsMycobacterium tuberculosis isolates were collected from TB patients treated in the Cangzhou Infectious Disease Hospital,and corresponding clinical data were also collected.The genomic DNA was extracted. Spacer oligonucleotide typing(spoligotyping)was applied to genotype the isolates.Drug susceptibility testing of first-line anti-TB drugs(streptomycin,isoniazid,rifampin,ethambutol)was performed using the BACTECTMMGITTM960 liquid medium.Cluster analysis was done by BioNumerics 5.0.Data was analyzed by Graphpad Prism 5.0 software.ResultsOf the 154 patients,109 were male and 45 were female.And 121 patients were treated for the first time,33 were retreatment,34 had smoking history,12 were complicated with diabetes mellitus.Fourty-eight strains(31.2%)were resistant to at least one of streptomycin,inoniazid,rifampicin and ethambutol.Initial drug resistance rate was 22.3%and acquired drug resistance rate was 63.6%.The drug resistance rate was significantly higher in retreatment patients than that of new cases.The Beijing family strain accounted for 91.6%of all isolates and the non-Beijing family strain accounted for 8.4%.There were no significant differences in gender,treatment history,smoking history and diabetes history between patients with the Beijing genotype and patients with non-Beijing genotype.ConclusionMycobacterium tuberculosis in Cangzhou exhibits high genetic diversity.The Beijing genotype is the predominant no association with drug resistance.

mycobacterium tuberculosis;microbial sensitivity tests;epidemiology,molecular;cluster analysis; genotyping;spoligotyping

R378.91+1

A

10.11958/20160071

滄州市科技局攻關(guān)項(xiàng)目（14130204）

1河北省滄州市傳染病醫(yī)院檢驗(yàn)科（061000）；2河北省石家莊市第五醫(yī)院檢驗(yàn)科

曹新瑞（1969），女，副主任檢驗(yàn)師，學(xué)士，主要從事微生物學(xué)檢驗(yàn)研究

△通訊作者E-mail:daieh2008@126.com