地塞米松納米膠束的制備及體外抗腫瘤作用研究Δ

侯杰榮，侯思奎，楊 欣，姚小東（西南醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生科，四川瀘州 646000）

地塞米松納米膠束的制備及體外抗腫瘤作用研究Δ

侯杰榮＊，侯思奎，楊 欣，姚小東#（西南醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生科，四川瀘州 646000）

目的：制備地塞米松（Dex）納米膠束（簡(jiǎn)稱Dex膠束），并研究其體外抗腫瘤作用。方法：以γ-聚谷氨酸（γ-PGA）為載體、二甲基亞砜為有機(jī)溶劑，采用透析法制備Dex膠束；觀察并檢測(cè)其形態(tài)、粒徑、Zeta電位、多分散系數(shù)（PDI）、臨界膠束濃度（CMC）、載藥量、包封率；比較pH 5.5、7.4條件下Dex膠束和Dex的體外釋藥情況；比較0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 μmol/ml的Dex、γ-PGA、Dex膠束和潑尼松龍（陽性對(duì)照）對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞存活率的影響，比較A549細(xì)胞在4、37℃下對(duì)0.5 μmol/ml的Dex膠束和Dex的攝取量。結(jié)果：所制備Dex膠束呈圓球形、形態(tài)規(guī)則，粒徑為（76.25±3.74）nm，Zeta電位為5.0 mV，PDI為0.163± 0.38，CMC為7.609 μg/ml，載藥量為（9.56±0.92）%，包封率為（89.25±1.36）%；與Dex比較，Dex膠束在pH 5.5、7.4條件下釋藥時(shí)間延長(zhǎng)；在0.05～0.2 μmol/ml范圍內(nèi)，游離Dex、γ-PGA、Dex膠束和潑尼松龍對(duì)細(xì)胞存活率的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在0.5、1.0 μmol/ml時(shí)，Dex膠束作用下細(xì)胞存活率明顯低于游離Dex或潑尼松龍作用（P＜0.05）。4℃下，細(xì)胞對(duì)Dex膠束和Dex的攝取量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；37℃下，細(xì)胞對(duì)Dex膠束的攝取量明顯高于游離Dex和4℃下的游離Dex、Dex膠束（P＜0.05）。結(jié)論：所制備的Dex膠束能延長(zhǎng)Dex的釋藥時(shí)間，降低A549細(xì)胞的存活率和細(xì)胞的攝取效率。

地塞米松；γ-聚谷氨酸；納米膠束；制備；抗腫瘤

地塞米松（Dexamethasone，Dex）是臨床最常用的糖皮質(zhì)激素，主要適應(yīng)證包括過敏性與自身免疫性炎癥性疾?。ㄈ缃Y(jié)締組織病，嚴(yán)重的支氣管哮喘、皮炎等過敏性疾病）、潰瘍性結(jié)腸炎、急性白血病、肺腺癌和惡性淋巴瘤等[1-2]，但因其半衰期短，需要反復(fù)給藥，且在局部病變部位的滯留時(shí)間短，療效較差[3-4]，所以患者依從性較差[5]。為了延長(zhǎng)Dex的半衰期，延緩釋放速率，增強(qiáng)療效，目前的研究熱點(diǎn)主要是將糖皮質(zhì)激素類藥物制備成前體藥物、各種緩控釋制劑或者其他長(zhǎng)效制劑如膠束[6]、脂質(zhì)體[7]和納米粒[8]等。相比較普通劑型而言，這些長(zhǎng)效劑型不僅可以延緩藥物的釋放[9]，而且可以增加其在病變部位的蓄積，增強(qiáng)療效[10-11]。

γ-聚谷氨酸（γ-PGA）是一種由D，L-谷氨酸單體經(jīng)過γ-酰胺鍵結(jié)合而形成的多聚氨基酸，其具有良好的生物相容性、水溶性和可降解性[12-13]，并且其側(cè)鏈上存在大量游離羧基，其有利于進(jìn)行化學(xué)修飾和攜帶生物活性基團(tuán)[14-15]，因此備受廣大國(guó)內(nèi)外研究者的關(guān)注，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景[16-17]。

本研究將γ-PGA與Dex通過透析法制備成Dex納米膠束（簡(jiǎn)稱Dex膠束），并對(duì)其進(jìn)行性質(zhì)表征和抗腫瘤作用研究，以期為進(jìn)一步的體內(nèi)研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀，包括P680A四元低壓梯度泵（美國(guó)戴安公司）；Zeta Sizer-Nano ZS90納米粒度儀（英國(guó)馬爾文公司）；SP-752紫外-可見分光光度計(jì)（上海奧析科學(xué)儀器有限公司）；RF-5301PC熒光分光光度計(jì)（日本島津公司）；Tecnai G2F-20透射電鏡（上海費(fèi)爾伯恩實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；DG5031酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（上海珂淮儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

Dex對(duì)照品（成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：201305，純度：＞99%）；γ-PGA（湖北興縱晨科技有限公司，批號(hào)：201402，純度：＞95%）；乙腈為色譜純；水為超純水；其余試劑為分析純。

1.3 細(xì)胞

人肺腺癌A549細(xì)胞由上海博谷生物科技有限公司提供，以含10%小牛血清、100 u/ml青霉素和100 u/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每隔1 d換1次培養(yǎng)基。

1.4 其他

透析袋（美國(guó)Sigma公司，截留分子質(zhì)量：5 000 Da）。

2 方法

2.1 Dex膠束的制備與性質(zhì)表征

采用透析法制備Dex膠束。首先將適量γ-PGA固體溶于2.0 ml 0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）中，攪拌30 min，加入3.0 ml有機(jī)溶劑二甲基亞砜（DMSO），繼續(xù)攪拌1 h后，緩慢滴入適量Dex溶液，使得Dex與γ-PGA的比例為1∶10，再繼續(xù)攪拌30 min后，置于4℃去離子水中透析24 h，獲得Dex膠束溶液。將制得的Dex膠束溶液用水稀釋至1 mg/ml，用Zeta Sizer-Nano ZS90納米粒度儀測(cè)定其粒徑、多分散系數(shù)（PDI）、Zeta電位，再取適量于透射電鏡下觀察Dex膠束形態(tài)。

2.2 臨界膠束濃度（CMC）的測(cè)定

采用芘熒光探針法測(cè)定Dex膠束的CMC。按“2.1”項(xiàng)下方法制備1～10－4mg/ml的Dex膠束溶液，使其每個(gè)質(zhì)量濃度溶液中芘的終濃度為1.0×10－7mol/L，超聲0.5 h，室溫下避光放置24 h。測(cè)定各溶液372 nm波長(zhǎng)處的峰（I372）與383 nm波長(zhǎng)處的峰（I383），其中激發(fā)波長(zhǎng)（Ex）390 nm，Ex狹縫3 nm，發(fā)射波長(zhǎng)（Em）狹縫3 nm，計(jì)算I383/I372。以I383/I372（y）為縱坐標(biāo)、膠束濃度對(duì)數(shù)值（lgc，x）為橫坐標(biāo)，用Origin 8.0軟件按照Boltzmann公式[18]進(jìn)行曲線擬合。

2.3 Dex的含量測(cè)定方法

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（60∶40，V/V），流速：1 ml/min；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm；進(jìn)樣量：20 μl。

2.3.2 專屬性試驗(yàn) 分別取空白乙腈溶液、Dex溶液、Dex膠束溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取Dex 10 g，加乙腈溶液溶解并定容制成1 g/ml貯備液。精密量取上述貯備液適量，用乙腈溶液稀釋至質(zhì)量濃度1、5、10、25、50、100、150、200 mg/ml后按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積（A）對(duì)質(zhì)量濃度（c）進(jìn)行線性回歸分析。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 取質(zhì)量濃度55 mg/ml的Dex溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣6次，考察精密度。

2.3.5 回收率試驗(yàn) 精密吸取不同濃度的Dex溶液于量瓶中，按“2.1”項(xiàng)下方法制備成5、50、200 mg/ml的Dex膠束溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率和RSD。

2.4 載藥量和包封率的測(cè)定

固定γ-PGA的量，將Dex與γ-PGA以1∶5和1∶10投料，溶于適量的DMSO中制得Dex膠束溶液，然后加入3倍量的乙腈溶液，13 500 r/min（離心半徑25 cm）離心10 min，取上清液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定游離Dex含量。計(jì)算載藥量（DL）和包封率（EE），DL（%）＝（Dex投入量－游離Dex的量）/ Dex膠束的量×100%，EE（%）＝（Dex投入量－游離Dex的量）/Dex投入量×100%。

2.5 體外釋放特性的考察

取Dex適量，加入DMSO-生理鹽水（3∶8）溶液制成1 mg/ml的Dex溶液。取Dex溶液和“2.1”項(xiàng)下制備的Dex膠束溶液各0.5 ml，分別置于透析袋中，密封后，放入裝有25 ml pH 5.5或7.4的PBS釋放介質(zhì)的圓底燒瓶中，于37℃下100 r/min恒溫水浴振蕩孵育，于1、2、4、8、16、32、48、60、72 h時(shí)吸出各燒瓶中釋放介質(zhì)300 μl，同時(shí)補(bǔ)加等量新鮮釋放介質(zhì)至燒瓶中。按照“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定釋放介質(zhì)中Dex的含量并作圖。

2.6 細(xì)胞存活率的測(cè)定

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的A549細(xì)胞，采用0.25%胰酶消化后，再用相應(yīng)的培養(yǎng)基制成單個(gè)細(xì)胞懸液，調(diào)整密度為1×104個(gè)/ml，接種于96孔板，每孔體積為200 μl，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%左右時(shí)再進(jìn)行MTT試驗(yàn)。分別用無血清無雙抗培養(yǎng)基制備陽性對(duì)照溶液（含0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 μmol/ml的潑尼松龍）、游離Dex溶液（0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 μmol/ml）、γ-PGA溶液（0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 μmol/ml）和Dex膠束溶液（0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 μmol/ml），并用0.22 μm濾膜過濾除菌。然后分別加入至接種有A549細(xì)胞的96孔板中，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，另設(shè)陰性對(duì)照孔（加入培養(yǎng)基和細(xì)胞，不加藥物）和空白孔（只加培養(yǎng)基，不加細(xì)胞和藥物），置于37℃、5%CO2下培養(yǎng)24 h。吸出孔內(nèi)液體，PBS洗滌3次，加入180 μl培養(yǎng)基和20 μl MTT液（5 mg/ml），再繼續(xù)培養(yǎng)4 h。取出培養(yǎng)板并吸出上清液，再加入DMSO 150 μl，最后將培養(yǎng)板置于37℃下振搖15 min，使結(jié)晶物甲瓚充分溶解后，于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（A），計(jì)算細(xì)胞存活率[（A加藥孔－A空白孔）/（A陰性對(duì)照孔－A空白孔）×100%][19]。

2.7 細(xì)胞攝取量的測(cè)定

將1×104個(gè)/ml的A549細(xì)胞接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁80%左右時(shí)進(jìn)行細(xì)胞攝取試驗(yàn)。吸出培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，加入4℃或37℃預(yù)熱的含相同濃度（0.5 μmol/ml）的Dex膠束溶液或Dex溶液，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別于4℃或37℃孵育1 h。吸出含有Dex膠束或游離Dex的培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次，用0.25%胰酶消化細(xì)胞后，吸取細(xì)胞懸液入1.5 ml的EP管中，5 000 r/min（離心半徑15 cm）離心10 min，收集細(xì)胞沉淀，并用0.5 ml的RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞15 min，取20 μl用二喹啉甲酸（BCA）法測(cè)定蛋白含量。然后再取其中500 μl，加入乙腈沉淀蛋白，13 500 r/min（離心半徑25 cm）離心10 min，取上清液20 μl進(jìn)樣，測(cè)定Dex含量。

3 結(jié)果

3.1 Dex膠束的粒徑、PDI、Zeta電位

所制備的Dex膠束呈圓球形、形態(tài)規(guī)則，粒徑為（76.25± 3.74）nm，PDI為0.163±0.38，Zeta電位為5.0 mV。Dex膠束的透射電鏡圖見圖1，粒徑和Zeta電位分布見圖2。

3.2 Dex膠束的CMC

I383/I372-lgc的曲線圖見圖3。

由圖3可知，曲線方程為y＝（A1－A2）/[1+e（x－x0）/dx]+A2，式中，A1為低濃度下的I383/I372（1.926 4），A2為高濃度下的I383/I372（1.037 8），x0是曲線突變中點(diǎn)（－2.118 4），dχ＝0.525 8。由于χ0/dχ＜10，χ0就是CMC的對(duì)數(shù)值[20]，即CMC＝10－2.1184mg/ml＝0.007 609 mg/ml＝7.609 μg/ml。

圖1 Dex膠束的透射電鏡圖Fig 1 TEM of Dex micelles

圖2 Dex膠束的粒徑和Zeta電位分布Fig 2 Particle size and Zeta potential of Dex micelles

圖3 I383/I372-lgc的曲線圖Fig 3 Curves for I383/I372-lgc

3.3 Dex的含量

在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下，Dex溶液和Dex膠束溶液的出峰時(shí)間一致，均為5.0 min，且空白乙腈溶液不干擾Dex的含量測(cè)定。Dex檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為1～200 mg/ml，回歸方程為A＝7.549c+25.676（r＝0.999 7）；精密度試驗(yàn)的RSD＝0.82%（n＝6）；平均回收率為98.42%（RSD＝0.93%，n＝9）。色譜圖見圖4。

圖4 高效液相色譜圖Fig 4 HPLC chromatograms

3.4 Dex膠束的DL和EE

不同Dex和γ-PGA投料比對(duì)DL無顯著影響，但對(duì)EE的影響較大。當(dāng)投料比例從1∶5減小到1∶10時(shí)，EE從35%增大到89.25%，因此選擇Dex和γ-PGA的投料比為1∶10。按此比例制備的3批Dex膠束的DL為（9.56±0.92）%，EE為（89.25± 1.36）%。

3.5 體外釋藥特性

Dex在pH 5.5、7.4的PBS中48 h內(nèi)的累積釋放度均達(dá)到100%；Dex膠束在pH 5.5的PBS中48 h內(nèi)的累積釋放度僅為87.65%，而在pH 7.4的PBS中48 h的累積釋放度為85.19%，在兩種PBS中72 h內(nèi)的累積釋放度才達(dá)到100%。由此可見，在相同的時(shí)間點(diǎn)Dex膠束在兩種釋放介質(zhì)中的累積釋放度均低于Dex的累積釋放度，說明以γ-PGA包載Dex并制備成膠束后，可延長(zhǎng)Dex的釋藥時(shí)間。Dex和Dex膠束在pH 5.5、7.4的介質(zhì)中的釋放曲線見圖5。

圖5 Dex和Dex膠束在pH 5.5、7.4的介質(zhì)中的釋放曲線（n＝3）Fig 5 Release curves of Dex and Dex micelles under pH 5.5 and 7.4（n＝3）

3.6 細(xì)胞存活率

游離Dex、γ-PGA、Dex膠束和潑尼松龍?jiān)?.05～0.2 μmol/ ml濃度范圍內(nèi)對(duì)A549細(xì)胞的存活率均無明顯影響（P＞0.05）。在0.5、1.0 μmol/ml時(shí)，Dex膠束作用下細(xì)胞存活率明顯低于游離Dex或潑尼松龍（P＜0.05）。不同濃度游離Dex、γ-PGA、Dex膠束和潑尼松龍對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響見圖6。

圖6 不同濃度游離Dex、γ-PGA、Dex膠束和潑尼松龍對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響（n＝5）Fig 6 Effects of different concentrations of free Dex，γ-PGA，Dex micelles and prednisolone on survival rate ofA549 cells（n＝5）

3.7 細(xì)胞攝取量

4℃下，A549細(xì)胞對(duì)Dex膠束和游離Dex的攝取量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；37℃下，A549細(xì)胞對(duì)游離Dex膠束的攝取量明顯高于游離Dex和4℃下的游離Dex、Dex膠束（P＜0.05）。A549細(xì)胞對(duì)游離Dex和Dex膠束的攝取結(jié)果見圖7。

圖7 A549細(xì)胞對(duì)游離Dex和Dex膠束的攝取結(jié)果（n＝3）Fig 7 Uptake of A549 cells to free Dex and Dex micelles（n＝3）

4 討論

本研究中體外釋放結(jié)果顯示，γ-PGA與Dex形成膠束后，增加了Dex的水溶性，而且延緩了Dex的釋放，增強(qiáng)了其在局部細(xì)胞的滯留時(shí)間。在進(jìn)一步的MTT試驗(yàn)中，證明在低劑量時(shí)，游離Dex和Dex膠束對(duì)A549細(xì)胞均無顯著抑制作用（P＞0.05）；而在高劑量時(shí)游離Dex和Dex膠束均表現(xiàn)出對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用和毒性，Dex膠束的抑制作用顯著強(qiáng)于游離Dex（P＜0.05）。這說明利用γ-PGA作為游離Dex的一種新型載體材料制備納米膠束，能夠顯著增強(qiáng)對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用。這與體外釋放試驗(yàn)結(jié)果一致，說明Dex膠束對(duì)A549細(xì)胞的顯著抑制作用是通過增強(qiáng)在細(xì)胞局部的滯留時(shí)間而實(shí)現(xiàn)的。

在體外細(xì)胞攝取試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，37℃時(shí)Dex膠束在A549細(xì)胞中的攝取量顯著高于4℃時(shí)的攝取量，而且也顯著高于37℃和4℃時(shí)游離Dex在A549細(xì)胞中的攝取量。該結(jié)果表明，Dex膠束在A549細(xì)胞中的攝取具有溫度依賴性，所以其進(jìn)入細(xì)胞是依靠能量依賴性的主動(dòng)靶向作用；而游離Dex的攝取不具有溫度依賴性，是被動(dòng)靶向進(jìn)入細(xì)胞的。

以上研究均證明，γ-PGA作為Dex的一種新型載體，可以增強(qiáng)Dex對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用，提高細(xì)胞對(duì)Dex的攝取量，從而有希望發(fā)展為其他糖皮質(zhì)激素類藥物的載體，為增加糖皮質(zhì)激素類藥物在疾病部位的滯留作用、提高其治療效果提供研究思路。

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Preparation of Dexamethasone Nano-micelles and Study on Its in vitro Anti-tumor Effect

HOU Jierong，HOU Sikui，YANG Xin，YAO Xiaodong（Dept.of Health，Southwest Medical University，Sichuan Luzhou 646000，China）

OBJECTIVE：To prepare Dexamethasone（Dex）nano-micelles（called Dex micelles for short），and to study its in vitro anti-tumor effect.METHODS：Using γ-PGA as carrier，DMSO as organic solvent，Dex micelles were prepared by dialysis method.The morphology，particle size，Zeta potential，PDI，CMC，drug-loading amount and entrapment efficiency（EE）of micelle were observed and detected.Drug release of Dex micelles and Dex were compared under pH 5.5，7.4.The effects of free Dex，γ-PGA，Dex micelles and prednisolone（positive control）（0.05，0.1，0.2，0.5，1.0 μmol/ml）on the survival rate of human lung adenocarcinoma A549 cells were compared.The uptake amount of A549 cells to 0.5 μmol/ml Dex micelles and free Dex were compared at 4，37℃.RESULTS：Prepared Dex micelles were spheroidal and completely round with particle size of（76.25±3.74）nm，Zeta potential of 5.0 mV，PDI of 0.163±0.38，CMC of 7.609 μg/ml，drug-loading amount of（9.56±0.92）%and EE of（89.25±1.36）%.Compared with free Dex，the duration of drug release for Dex micelles prolonged under pH 5.5，7.4.When the concentration ranged 0.05-0.2 μmol/ml，the effects of free Dex，γ-PGA，Dex micelles and prednisolone on cellular survival rate had no statistically significant difference（P＞0.05）.When the concentration was 0.5，1.0 μmol/ml，survival rate of A549 cells treated with Dex micelles was significantly lower than that treated with free Dex or prednisolone（P＜0.05）.At 4℃，the uptake amount of A549 cells to Dex micelles and free Dex had no statistically significant difference（P＞0.05）.At 37℃，the uptake amount of A549 cells to Dex micelles was significantly higher than that of cells to free Dex，and that of A549 cells to Dex micelles and free Dex at 4℃.CONCLUSIONS：Prepared Dex micelles can prolong the duration of drug release of Dex，and decrease the survival rate of A549 cells and cellular uptake efficacy.

Dexamethasone；γ-glutamic acid；Nano-micelles；Preparation；Anti-tumor

R943

A

1001-0408（2016）31-4425-04

2016-01-29

2016-09-20）

（編輯：鄒麗娟）

四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（No.12ZB245）

＊主管中藥師，碩士。研究方向：藥物制劑工藝。E-mail：2632892465@qq.com

#通信作者：助理研究員，碩士。研究方向：醫(yī)院制劑。E-mail：114408231@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.31.31