血清磷酸化肽的分離富集和質(zhì)譜定量及其作為潛在腫瘤標(biāo)志物的評價(jià)

翟貴金, 吳 魁, 汪福意,3*

(1. 中國科學(xué)院化學(xué)研究所, 中國科學(xué)院活體分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100190; 2. 天津市醫(yī)學(xué)表觀遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系, 天津 300070; 3. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

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血清磷酸化肽的分離富集和質(zhì)譜定量及其作為潛在腫瘤標(biāo)志物的評價(jià)

翟貴金1,2, 吳 魁1, 汪福意1,3*

(1. 中國科學(xué)院化學(xué)研究所, 中國科學(xué)院活體分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100190; 2. 天津市醫(yī)學(xué)表觀遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系, 天津 300070; 3. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

血清中磷酸化肽種類和濃度的變化既能反映人體內(nèi)蛋白質(zhì)水解酶活性的變化,又能反映蛋白質(zhì)翻譯后磷酸化的水平,業(yè)已成為腫瘤標(biāo)志物尋找和發(fā)現(xiàn)的重要目標(biāo)。因而,血清中磷酸化肽的鑒定及其定量分析在具有臨床應(yīng)用價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物的篩選與發(fā)現(xiàn)中起著重要作用。由于血清中的內(nèi)源性磷酸化肽豐度極低,在質(zhì)譜分析中的離子化效率不高,且受到來自高豐度非磷酸化肽和蛋白質(zhì)的信號抑制及干擾,血清中磷酸化肽的質(zhì)譜定量分析是分析化學(xué)研究中的一個巨大挑戰(zhàn)。文章對血清磷酸化肽的分離富集、質(zhì)譜定量分析及其作為腫瘤標(biāo)志物的篩選和評價(jià)等3個方面的研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)、評述,并展望該領(lǐng)域的未來研究趨勢和應(yīng)用前景。

磷酸化肽;分離富集;質(zhì)譜定量;腫瘤標(biāo)志物;血清;綜述

蛋白質(zhì)的磷酸化是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的中心事件,幾乎調(diào)節(jié)著包括細(xì)胞增殖、分化、代謝、凋亡以及侵襲等過程在內(nèi)的所有生命活動[1-5]。蛋白質(zhì)磷酸化的異?？梢l(fā)和促進(jìn)癌癥等重大疾病的發(fā)生和發(fā)展[6]。血清中的磷酸化肽是血液蛋白質(zhì)組的重要組成部分,一般源自細(xì)胞分泌和磷酸化蛋白質(zhì)水解或者降解產(chǎn)生的肽段[7]。因而,血清中磷酸化肽種類和豐度的變化既能反映人體內(nèi)蛋白質(zhì)水解酶活性的變化,又能反映蛋白質(zhì)翻譯后磷酸化的水平,業(yè)已成為腫瘤標(biāo)志物(tumor markers, TMs)尋找和發(fā)現(xiàn)的重要目標(biāo)[8-10]。所以,對血清中磷酸化肽進(jìn)行鑒定以及定量分析對具有臨床應(yīng)用價(jià)值和前景的腫瘤標(biāo)志物的篩選與發(fā)現(xiàn)具有重要意義。

目前,分析技術(shù)尤其是質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展,使得磷酸化蛋白質(zhì)和磷酸化肽的發(fā)現(xiàn)與鑒定成為可能。質(zhì)譜技術(shù)在復(fù)雜生物樣品(如血清)中磷酸化肽段的定性與定量研究中的出色表現(xiàn)為發(fā)展用于腫瘤診斷的新技術(shù)提供了很好的機(jī)會[11]。但是,由于血清中內(nèi)源性磷酸化肽豐度極低,在質(zhì)譜分析中的離子化效率不高,且受到來自高豐度非磷酸肽和蛋白質(zhì)的信號抑制及干擾[12-15],因而,血清中磷酸化肽的質(zhì)譜定量分析是分析化學(xué)研究面臨的一個巨大挑戰(zhàn)。為解決磷酸化肽質(zhì)譜定量分析中的這些突出問題,分析化學(xué)家們致力于發(fā)展對磷酸化肽具有特異性作用的高效分離富集材料,為磷酸化肽的質(zhì)譜定量分析奠定了基礎(chǔ),同時(shí)也為血清磷酸化肽作為腫瘤標(biāo)志物的篩選和評價(jià)提供了方法學(xué)保證。作為潛在腫瘤標(biāo)志物的血清磷酸化肽的分析流程主要包括:(1)血清樣品中磷酸化肽的高效分離富集;(2)磷酸化肽的質(zhì)譜定性和定量分析;(3)基于大量臨床樣本定量分析數(shù)據(jù)的生物統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,評價(jià)血清磷酸化肽作為腫瘤標(biāo)志物的特異性和靈敏度。本文將對近年來在血清磷酸化肽分離富集、質(zhì)譜定量分析以及其作為潛在腫瘤標(biāo)志物的篩選和評價(jià)3個方面的研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)和評述,并分析該領(lǐng)域存在的問題,展望其未來的發(fā)展趨勢。

1 血清磷酸化肽的分離富集

血清是一個非常復(fù)雜的生物體系,其中含有大量的蛋白質(zhì),其濃度范圍可達(dá)10個數(shù)量級,并且90%的總蛋白質(zhì)由20多個高豐度的蛋白質(zhì)組成[16]。血清中蛋白質(zhì)與肽段等的復(fù)雜性以及高豐度蛋白質(zhì)的影響使得基于質(zhì)譜的血清磷酸化肽的分析表征變得異常困難。為了克服血清的復(fù)雜性以及來自非磷酸化蛋白質(zhì)(肽段)的離子抑制效應(yīng),高效選擇性地分離、富集磷酸化肽顯得十分必要[17-19]。為此,分析化學(xué)家們發(fā)展了一系列的方法分離富集復(fù)雜體系中的磷酸化肽。其中最為常用的就是固定金屬離子親和色譜(immobilized metal affinity chromatography, IMAC)和金屬氧化物親和色譜(metal oxide affinity chromatography, MOAC)[4,20]。

1.1 固定金屬離子親和色譜

固定金屬離子親和色譜(IMAC)是目前廣泛應(yīng)用的磷酸化肽段富集方法。其原理為帶正電的金屬離子(如Fe3+、Al3+、Ga3+和Zr3+等)與帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)產(chǎn)生靜電相互作用而結(jié)合,這種結(jié)合能力受到pH值、離子強(qiáng)度以及溶液中有機(jī)相比例的影響。在低pH條件下,金屬離子與磷酸基團(tuán)穩(wěn)定結(jié)合,將磷酸化肽從復(fù)雜體系中分離出來;在高pH值條件下,金屬離子與磷酸基團(tuán)間的結(jié)合被破壞,磷酸化肽被洗脫釋放出來,經(jīng)過必要的濃縮處理再進(jìn)行質(zhì)譜分析[21-23]。富集緩沖液中三氟乙酸(TFA)的濃度也會影響金屬離子與磷酸化肽的結(jié)合。從理論上講,如果TFA濃度過低，則不能有效地將非磷酸化肽段中所含氨基酸上的羧基質(zhì)子化,但TFA濃度過高又會導(dǎo)致磷酸化肽中磷酸基團(tuán)負(fù)電荷的減少。因而,針對不同的分析對象,需要對TFA的使用濃度進(jìn)行優(yōu)化。此外,在富集緩沖液中加入乙腈等有機(jī)相可以有效消除非磷酸化肽的非特異性吸附,但乙腈含量過高或過低,都會影響磷酸化肽的質(zhì)譜檢測信號強(qiáng)度,乙腈等有機(jī)相的用量同樣需要仔細(xì)的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化[24]。

目前,IMAC技術(shù)不僅廣泛用于磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究中,也已成為血清中磷酸化肽分離富集的有力工具。Cirulli等[25]應(yīng)用改進(jìn)的固定金屬離子親和色譜法從人血清中成功富集并利用質(zhì)譜鑒定了4條內(nèi)源性磷酸化肽段。Li等[26]在Fe3O4@SiO2磁性硅球表面鍵合上螯合金屬離子的官能團(tuán),然后采用IMAC原理,首次將Ce4+固定在磁球表面并應(yīng)用于實(shí)際血樣中磷酸化肽的富集。最近,Li等[27]利用一種磁性介孔硅將Ti4+嫁接在磁球上,制備了一種新的IMAC材料——Fe3O4@Ti-mSiO2磁性微球,并將其應(yīng)用于脫脂牛奶以及人血清中內(nèi)源性磷酸化肽的富集與分離。Lin等[18]將聚多巴胺覆蓋在磁性石墨烯表面,將Hf4+固定在石墨烯上,合成了一種新的IMAC材料(magG@PDA-Hf4+),這種新型材料集成了石墨烯的大比表面積、多巴胺的親水性和生物相容性以及Fe3O4的超順磁性等特點(diǎn),對磷酸化肽表現(xiàn)出良好的選擇性和靈敏性。

但是,IMAC技術(shù)也有其局限性,其中最突出的問題是復(fù)雜肽段混合物中高豐度非磷酸化肽段的非特異性吸附。一些含有多個酸性氨基酸殘基的非磷酸化肽段可以與磷酸化肽段一起吸附在材料上,從而造成對磷酸化肽段富集分離的選擇性降低。鄒漢法課題組發(fā)現(xiàn)了磷酸酯鋯(鈦)與磷酸化肽之間的高特異性相互作用,并利用這一相互作用建立了以磷酸基團(tuán)為螯合配體的新一代固定化金屬離子親和色譜技術(shù)[19,28-30]。研究表明該新型IMAC材料對磷酸化肽富集的特異性高,可以有效地避免酸性非磷酸化肽段的非特異性吸附。與傳統(tǒng)的IMAC材料相比,其對磷酸化肽的富集能力提高了3～10倍,大大提高了磷酸化蛋白質(zhì)(肽段)的檢測靈敏度和鑒定覆蓋率(見圖1)[31]。最近,馮鈺琦課題組[32]合成了一種類似的新型IMAC材料——磁性砷酸酯鋯納米顆粒。應(yīng)用這種納米顆粒分離富集磷酸化肽,有效減少了非磷酸化肽的干擾,富集血清磷酸化肽的特異性和后續(xù)質(zhì)譜檢測的靈敏度都得到大幅度的提升。

圖 1 以磷酸基團(tuán)為螯合配體的IMAC材料吸附 磷酸化肽段的機(jī)理Fig. 1 Mechanism of the phosphonate based-immobilized metal affinity chromatography (IMAC) adsorbents for phosphopeptide enrichment

IMAC材料的發(fā)展和改進(jìn)顯著提升了富集分離磷酸化肽的選擇性,大大減少了非磷酸化肽的干擾,提高了磷酸化肽的富集效率。但是,IMAC材料從血清中富集的磷酸化肽的數(shù)量還是相對較少。最近,Zhu等[33]綜合利用Ti (IV)-MCM-41[34]的分子排阻和富集功能、二維液相色譜分離以及集成碰撞誘導(dǎo)裂解(CID)-電子轉(zhuǎn)移解離(ETD)的新型檢索策略,從人血清中總共鑒定了143條可靠性較高的內(nèi)源性磷酸化肽(涵蓋133個磷酸化位點(diǎn)),大大提高了血清內(nèi)源性磷酸化肽的鑒定效率。

1.2 金屬氧化物親和色譜

與IMAC相比,金屬氧化物親和色譜(MOAC)對磷酸化肽具有更高的富集能力以及更好的選擇性,是近年來受到廣泛關(guān)注的新型磷酸化蛋白/肽段富集技術(shù)。二氧化鈦、二氧化鋯以及三氧化二鎵等材料都已經(jīng)廣泛應(yīng)用于磷酸化肽的分離富集[26,35-37]。其中TiO2富集法是目前最為成熟的金屬氧化物富集方法。TiO2在不同的pH值條件下,表現(xiàn)為路易斯酸或路易斯堿特性,在酸性條件下,鈦原子帶正電表現(xiàn)為路易斯酸,可以與陰離子結(jié)合;在堿性條件下,則表現(xiàn)為路易斯堿,可以與陽離子結(jié)合。這樣磷酸化肽段的磷酸基在酸性條件下與之結(jié)合,在堿性條件下洗脫從而達(dá)到富集分離磷酸化肽的目的。馮鈺琦課題組[37]構(gòu)建了一種TiO2涂層的磁性空心多孔硅球(TiO2/MHMSS)材料,實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜肽段混合物中磷酸化肽的高效分離富集。我們[35]應(yīng)用這種TiO2/MHMSS材料從表皮生長因子受體(EGFR)介導(dǎo)的磷酸化反應(yīng)混合物中分離富集痕量的磷酸化底物,發(fā)展了一種高效、低成本的EGFR抑制劑篩選方法。

MOAC材料一個突出的問題是金屬氧化物(TiO2、ZrO2等)親水性較差,導(dǎo)致其磷酸化肽富集效率降低。為解決這一問題,朱俊杰等[38]合成了一種Fe3O4-石墨烯-ZrO2三元復(fù)合網(wǎng)狀材料,借助石墨烯網(wǎng)格結(jié)構(gòu)提升ZrO2與溶液中磷酸化肽的接觸,提高M(jìn)OAC材料對磷酸化肽的富集能力。另一種克服金屬氧化物親水性差的方法是以納米尺度的金屬氧化物構(gòu)建MOAC材料,通過納米材料較大的比表面積增加金屬氧化物與磷酸化肽的接觸。如馮鈺琦等[39]采用液相沉積(LPD)技術(shù)制備了一種TiO2納米顆粒涂層的毛細(xì)管柱,顯著提高了MOAC材料分離富集磷酸化肽的效率,還實(shí)現(xiàn)了磷酸化肽分離富集和質(zhì)譜分析的在線聯(lián)用。我們課題組[40]將這種TiO2納米顆粒涂層的毛細(xì)管應(yīng)用于基于質(zhì)譜分析的蛋白激酶抑制劑篩選,大大提高了篩選通量。最近,Liu等[41]將1,6-己二胺修飾在TiO2納米顆粒表面,構(gòu)建了一種親和型TiO2雜交材料(NH2@TiO2),并作為一種生物功能吸附劑用于血清磷酸化肽的選擇性富集,磷酸基團(tuán)與氨基基團(tuán)之間的作用大大提高了磷酸化肽的富集效率。另外,從血清等復(fù)雜生物樣品中分離富集磷酸化肽時(shí),TiO2納米顆粒的富集能力容易受到其他高豐度蛋白質(zhì)的影響;為此,Yao等[42]基于介孔硅的分子排阻特性,構(gòu)建了一種TiO2雜交材料(G@TiO2@mSiO2)。該材料用于血清內(nèi)源性磷酸化肽富集分析時(shí),表現(xiàn)出了很好的靈敏度、選擇性以及分子排阻效應(yīng),為生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)以及臨床診斷應(yīng)用提供了有效的分析平臺。

最近,馮鈺琦課題組[43]發(fā)展了一種新型的磷酸化肽段分離富集技術(shù):陰離子交換色譜法(anion-exchange chromatography, AEX)。他們設(shè)計(jì)、合成了一種磁性石墨氮化碳材料,由于該材料表面含有大量氮以及堿性功能基團(tuán),可以在較低pH條件下保持對磷酸化肽段的較強(qiáng)吸附特性。他們應(yīng)用該方法成功實(shí)現(xiàn)了人血清以及兔腦中磷酸化肽的分離富集。

血清磷酸化肽分離富集原理和流程與磷酸化肽(或蛋白質(zhì))類似:在低pH條件下磷酸化肽與富集材料特異性結(jié)合,然后在高pH條件下實(shí)現(xiàn)所富集磷酸化肽的洗脫。但在血清磷酸化肽富集材料的設(shè)計(jì)上,引入了分子排阻的理念并結(jié)合具有較小孔徑的多孔硅材料,以去除血清中大量高豐度蛋白質(zhì)的非特異性吸附干擾[34];而對磷酸化蛋白質(zhì)的分離富集往往很少直接利用IMAC或者M(jìn)OAC,因?yàn)榍逑催^程中會出現(xiàn)大量低吸附磷酸化蛋白質(zhì)的丟失,從而導(dǎo)致磷酸化蛋白質(zhì)富集效率的降低。因此,在磷酸化蛋白質(zhì)富集材料的制備方面,常常引入介孔納米材料(具有可控的納米孔徑),以提高材料的比表面積和親水性,降低非特異性吸附,達(dá)到提高磷酸化蛋白質(zhì)分離富集效率的目的[44]。

圖 2 定量蛋白質(zhì)組學(xué)常用的分析方法Fig. 2 Strategies of quantitative proteomic analysis

2 血清磷酸化肽的質(zhì)譜定量分析

隨著分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及腫瘤生物學(xué)等生命學(xué)科的快速發(fā)展,人們認(rèn)識到生物體內(nèi)磷酸化蛋白質(zhì)/肽段豐度變化更能反映生命活動過程或疾病的發(fā)生、發(fā)展的狀態(tài),表達(dá)量或豐度發(fā)生顯著變化的磷酸化蛋白質(zhì)/肽段有可能成為藥物靶標(biāo)或者疾病診斷的生物標(biāo)志物。因此,分析化學(xué)家們發(fā)展了很多用于蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)翻譯后修飾定量研究方法,以期深入探索蛋白質(zhì)磷酸化以及磷酸化多肽水平的動態(tài)變化與癌癥等重大疾病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。圖2列出了定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析中常用的方法。

2.1 相對質(zhì)譜定量

穩(wěn)定同位素標(biāo)記方法與質(zhì)譜技術(shù)的結(jié)合廣泛應(yīng)用于定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域,這些方法主要包括同位素代謝標(biāo)記(如stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC[45])、基于化學(xué)反應(yīng)的同位素標(biāo)記方法(如isotope coded affinity tag[46](ICAT)、isobaric tags for relative and absolute quantification[47](iTRAQ)和tandem mass tags[48](TMT)等)以及無同位素標(biāo)記的相對定量法等。在這些方法中,同位素代謝標(biāo)記技術(shù)或許是最精確的質(zhì)譜定量方法。但是,該方法通常比較昂貴。Hu等[34]利用iTRAQ對分離富集獲得的磷酸化肽進(jìn)行了標(biāo)記,并利用MALDI-TOF MS進(jìn)行定量分析。

相反,化學(xué)標(biāo)記通常簡便、高效并且經(jīng)濟(jì),在定量蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用更為廣泛。其中一種化學(xué)標(biāo)記策略是利用甲醛反應(yīng)在肽段的N端和賴氨酸側(cè)鏈引入兩個甲基,反應(yīng)完成后,輕標(biāo)試劑可以在肽段N端引入兩個CH3,而中/重標(biāo)分別引入CHD2和13CD3。最后3組(輕、中、重)肽段之間均有4 Da的質(zhì)量差異[49-51]。最近,Chen等[52]利用此化學(xué)標(biāo)記策略對從血清中分離富集的磷酸化肽進(jìn)行原位標(biāo)記,實(shí)現(xiàn)了白血病患者與正常個體血清樣品中磷酸化肽的質(zhì)譜定量分析。

另外一個化學(xué)反應(yīng)標(biāo)記試劑,N-乙酸基琥珀酰亞胺(NAS),能夠特異性地與肽段N端和賴氨酸殘基側(cè)鏈反應(yīng)而引入乙?；鶎﹄亩芜M(jìn)行標(biāo)記。此策略簡單、經(jīng)濟(jì),在蛋白質(zhì)組學(xué)定量研究方面有著廣闊的應(yīng)用前景[53-58]。我們在利用NAS對人血清中的磷酸化肽進(jìn)行標(biāo)記時(shí)發(fā)現(xiàn),當(dāng)標(biāo)記只發(fā)生在肽段N端時(shí),因其輕重同位素標(biāo)簽僅有3 Da的差別,質(zhì)譜分析時(shí)輕重標(biāo)記肽段的質(zhì)譜峰存在重疊,給定量工作帶來了一定的困難,必須結(jié)合同位素峰模擬去除重疊部分予以校正處理[59]。

2.2 絕對質(zhì)譜定量

絕對質(zhì)譜定量的基本原理就是在待測樣品中加入已知量的穩(wěn)定同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo),類似于同位素稀釋分析法。因?yàn)榱姿峄牡南鄬Χ糠治霾⒉荒芡耆从成锘w狀態(tài)或者對外界刺激的響應(yīng)程度,所以特定位點(diǎn)磷酸化的絕對定量分析是必要的。磷酸化肽的絕對定量分析可以實(shí)現(xiàn)不同條件下,目標(biāo)肽段上多個磷酸化位點(diǎn)的定量分析。近年來,分析化學(xué)家們也發(fā)展了多種絕對定量的分析方法。其中最為常用的當(dāng)屬Gygi課題組發(fā)展的AQUA(the absolute quantification)方法[60]。該方法直接將合成的同位素標(biāo)記肽加入到樣品中,基于內(nèi)源性目標(biāo)肽段與同位素標(biāo)記肽段的色譜峰面積比率來進(jìn)行絕對定量分析。盡管該方法非常直接簡便,但其依據(jù)單點(diǎn)校正,容易引起分析誤差,尤其是在不同樣品之間內(nèi)源性肽段動態(tài)范圍較寬或者肽段濃度不在線性響應(yīng)之內(nèi)的情況下。我們基于化學(xué)標(biāo)記策略,利用合成的磷酸化肽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)建立了多點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線,實(shí)現(xiàn)了血清中內(nèi)源性磷酸化肽的絕對定量分析,提高了質(zhì)譜絕對定量分析的準(zhǔn)確性[59]。最近,我們在合成磷酸化肽標(biāo)準(zhǔn)物時(shí),直接在肽段中引入兩個輕、重同位素標(biāo)記的甘氨酸殘基,既避免了肽段化學(xué)標(biāo)記反應(yīng)不完全可能導(dǎo)致的誤差,也避免了單一N-端化學(xué)標(biāo)記時(shí)輕重肽段同位素質(zhì)譜峰的重疊[59],進(jìn)一步提高了血清磷酸化肽質(zhì)譜絕對定量分析的準(zhǔn)確性。

目前,血清中磷酸化肽的質(zhì)譜定量工作,主要針對其中源于磷酸化蛋白原(fibrinogen)的4條磷酸化肽段,對其他139條[33]已經(jīng)被明確鑒定的磷酸化肽段幾乎沒有涉及。這主要是因?yàn)檠逯薪^大部分磷酸化肽的豐度極低，富集后的質(zhì)譜分析仍然不能給出超低豐度磷酸化肽的定量結(jié)果,從一個側(cè)面給磷酸化肽的分離富集提出了更高的要求。另一方面,當(dāng)前的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)主要集中于對蛋白質(zhì)翻譯后磷酸化過程、磷酸化位點(diǎn)及其生物學(xué)意義的研究,血清磷酸化肽作為潛在腫瘤標(biāo)志物的篩選和評價(jià)研究還處于起始階段,缺乏大規(guī)模臨床樣品分析數(shù)據(jù),這為我們在這一領(lǐng)域更深入的研究提供了機(jī)遇。

3 血清磷酸化肽作為腫瘤標(biāo)志物的篩選

腫瘤標(biāo)志物是一類在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中由腫瘤細(xì)胞所產(chǎn)生、分泌并釋放到血液、體液及組織中,能反映腫瘤存在和生長的一類物質(zhì)[61,62]。過去50年來,通過科研工作者們的不斷努力,許多腫瘤標(biāo)志物得以應(yīng)用于臨床診斷。如前列腺特異性抗原(PSA)用于診斷前列腺癌,甲胎蛋白(AFP)用于診斷肝癌,癌抗原CA-125用于診斷卵巢癌,癌胚抗原(CEA)和癌抗原CA19-9用于診斷結(jié)直腸癌及胃癌等。但是,它們在應(yīng)用于癌癥早期臨床診斷時(shí)都缺乏足夠高的特異性與靈敏度。因此,為更有效地篩查和診斷癌癥,尋找新的具有更高臨床診斷特異性與靈敏度的生物標(biāo)志物已經(jīng)迫在眉睫。

血清中磷酸化肽段同時(shí)包含了蛋白質(zhì)磷酸化修飾水平和蛋白酶活性動態(tài)變化的信息,為腫瘤標(biāo)志物研究提供了一種全新的視角。但是,關(guān)于血清磷酸化肽作為腫瘤標(biāo)志物的研究還較少。Hu等[34]利用磷酸鈦修飾的介孔硅顆粒對血清中的磷酸化肽進(jìn)行分離富集,并結(jié)合iTRAQ標(biāo)記,對12位肝癌患者與12位健康志愿者血清中的磷酸化肽進(jìn)行了定量研究。與健康志愿者相比,其中兩條磷酸化肽在癌癥患者血清中的水平有顯著變化,反映了某些相關(guān)酶有可能成為肝癌檢測的生物標(biāo)志物。Qin等[63]發(fā)展了一種磷酸功能化的介孔硅納米材料,實(shí)現(xiàn)了血清中內(nèi)源性磷酸化肽段的原位富集與標(biāo)記,通過質(zhì)譜相對定量的方法對10個肝癌患者與10個健康者血清中的內(nèi)源性磷酸化肽進(jìn)行了比較分析,發(fā)現(xiàn)其中3條磷酸化肽段在兩組之間的豐度差異顯著。最近,Min等[64]利用TiO2納米管陣列與同位素標(biāo)記技術(shù)對7個卵巢癌與7個正常個體血清中磷酸化肽進(jìn)行了定量分析,發(fā)現(xiàn)其中兩條磷酸化肽的豐度有明顯變化;Chen等[52]合成了一種新型納米顆粒——Fe3O4-TiNbNS用于磷酸化肽的分離富集,并通過化學(xué)標(biāo)記結(jié)合質(zhì)譜定量分析對8個白血病患者與8個健康志愿者血清磷酸化肽水平進(jìn)行了表征。但是,上述研究都是基于質(zhì)譜相對定量分析進(jìn)行的,不適合生物標(biāo)志物篩選和發(fā)現(xiàn)研究中大規(guī)模、多樣品之間的比較分析。

我們發(fā)展了一種基于化學(xué)標(biāo)記的質(zhì)譜絕對定量分析方法,分析了20個胃癌患者與20個正常個體血清中磷酸化肽的絕對濃度[59]。我們發(fā)現(xiàn)其中一條磷酸化肽(F3)的豐度在兩組之間差異顯著(見圖3),有可能成為胃癌診斷的生物標(biāo)志物。但其在臨床診斷方面的應(yīng)用前景還需要通過對更多樣本、更具代表性人群的分析,對其診斷靈敏度與特異性進(jìn)行進(jìn)一步的系統(tǒng)驗(yàn)證。此外,鑒于血清中的磷酸化肽來自磷酸化蛋白質(zhì)酶解,其濃度水平反映了蛋白酶、外肽酶、激酶、磷酸酶等在體內(nèi)的水平和活力,是各種酶復(fù)雜作用的平衡結(jié)果,所以,磷酸化肽濃度的變化與腫瘤發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系以及更明確的分子機(jī)理還需要進(jìn)一步的研究。

圖 3 血清中磷酸化肽濃度散點(diǎn)分布圖Fig. 3 Scatter plots of the concentration distribution of the four endogenous phosphopeptides F1-F4 in serum samples

4 結(jié)論與展望

綜上所述,磷酸化肽在質(zhì)譜分析中容易受到高豐度非磷酸化肽等基體物質(zhì)的干擾和離子抑制,因此,在進(jìn)行質(zhì)譜分析前,需要對其進(jìn)行有效的分離富集。在過去的10多年中,磷酸化肽的分離富集新方法大量涌現(xiàn)。這些方法在磷酸化肽的富集效率、選擇性以及靈敏度等方面都有很大的提升,對復(fù)雜生物體系(如血清)中磷酸化肽的分析表征帶來了諸多益處,使得大規(guī)模磷酸化肽組的分析成為可能。

質(zhì)譜定量方法,特別是基于化學(xué)反應(yīng)標(biāo)記策略的質(zhì)譜定量分析法,在血清磷酸化肽的定量分析中應(yīng)用廣泛。另外,質(zhì)譜絕對定量分析方法的建立,使得大規(guī)模、多樣品之間的分析比較成為可能,為血清磷酸化肽作為腫瘤標(biāo)志物的篩選和評價(jià)提供了技術(shù)平臺。

從血清中篩選和發(fā)現(xiàn)有效的腫瘤生物標(biāo)志物,特別是對早期癌癥有高特異性與靈敏度的診斷標(biāo)志物,是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的工作。關(guān)于血清磷酸化肽作為腫瘤標(biāo)志物的篩選和評價(jià)的報(bào)道還較少,系統(tǒng)性的研究尤其缺乏。這也給血清磷酸化肽質(zhì)譜定量-腫瘤標(biāo)志物的篩選留下了進(jìn)一步的研究空間。未來重點(diǎn)應(yīng)在幾個方面予以開展:加大樣本量,使樣本更具代表性,包括增加良性腫瘤患者、炎癥患者、患有凝血方面疾病的患者的血清樣本等;目前的研究大多是推斷潛在磷酸化肽腫瘤標(biāo)志物濃度的變化與體內(nèi)酶活性變化有關(guān),但沒有對特定酶的活性進(jìn)行表征,還需要相關(guān)的實(shí)驗(yàn)去證實(shí);此外,檢測治療前后或手術(shù)前后患者血清中潛在磷酸化肽腫瘤標(biāo)志物濃度的變化,可以發(fā)現(xiàn)標(biāo)志物與臨床治療之間的關(guān)系,驗(yàn)證其作為一種腫瘤治療標(biāo)志物的可能性。我們相信,通過這些系統(tǒng)性的分析和驗(yàn)證,未來一定有高特異性與靈敏度的血清磷酸化肽被篩選出來用于腫瘤的臨床篩查與診斷。

[1] Hunter T. Cell, 2000, 100: 113

[2] Paradela A, Albar J P. J Proteome Res, 2008, 7: 1809

[3] Reinders J, Sickmann A. Proteomics, 2005, 5: 4052

[4] Thingholm T E, Jensen O N, Larsen M R. Proteomics, 2009, 9: 1451

[5] Zanivan S, Meves A, Behrendt K, et al. Cell Rep, 2013, 3: 552

[6] Zhang Y Y, Fonslow B R, Shan B, et al. Chem Rev, 2013, 113: 2343

[7] He K, Wen X Y, Li A L, et al. PLoS One, 2013, 8: e63724

[8] Villanueva J, Martorella A J, Lawlor K, et al. Mol Cell Proteomics, 2006, 5: 1840

[9] Liotta L A, Petricoin E F. J Clin Invest, 2006, 116: 26

[10] Lee H J, Na K, Kwon M S, et al. Proteomics, 2009, 9: 3395

[11] Jensen O N. Nat Rev Mol Cell Bio, 2006, 7: 391

[12] Zhou W D, Ross M M, Tessitore A, et al. J Proteome Res, 2009, 8: 5523

[13] Ficarro S B, McCleland M L, Stukenberg P T, et al. Nat Biotechnol, 2002, 20: 301

[14] Lu Z D, Duan J C, He L, et al. Anal Chem, 2010, 82: 7249

[15] Zou Y, Jiang W H, Zou L J, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2013, 31(4): 367

鄒瑤, 姜武輝, 鄒麗娟, 等. 色譜, 2013, 31(4): 367

[16] Anderson N L, Anderson N G. Mol Cell Proteomics, 2002, 1: 845

[17] Oda Y, Nagasu T, Chait B T. Nat Biotechnol, 2001, 19: 379

[18] Lin H Z, Deng C H. Talanta, 2016, 149: 91

[19] Zhou H J, Ye M L, Dong J, et al. J Proteome Res, 2008, 7: 3957

[20] Li X S, Yuan B F, Feng Y Q. TrAC-Trends Anal Chem, 2016, 78: 70

[21] Posewitz M C, Tempst P. Anal Chem, 1999, 71: 2883

[22] Trojer L, Stecher G, Feuerstein I, et al. J Chromatogr A, 2005, 1079: 197

[23] Zhao Y Y, Guo Z M, Li X L, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2013, 31(8): 763

趙艷艷, 郭志謀, 李秀玲, 等. 色譜, 2013, 31(8): 763

[24] Kokubu M, Ishihama Y, Sato T, et al. Anal Chem, 2005, 77: 5144

[25] Cirulli C, Chiappetta G, Marino G, et al. Anal Bioanal Chem, 2008, 392: 147

[26] Li Y, Lin H Q, Deng C H, et al. Proteomics, 2008, 8: 238

[27] Li X S, Pan Y N, Zhao Y, et al. J Chromatogr A, 2013, 1315: 61

[28] Zhou H J, Xu S Y, Ye M L, et al. J Proteome Res, 2006, 5: 2431

[29] Feng S, Ye M L, Zhou H J, et al. Mol Cell Proteomics, 2007, 6: 1656

[30] Yu Z Y, Han G H, Sun S T, et al. Anal Chim Acta, 2009, 636: 34

[31] Zhou H J, Ye M L, Dong J, et al. Nat Protoc, 2013, 8: 461

[32] Li X S, Xu L D, Zhu G T, et al. Analyst, 2012, 137: 959

[33] Zhu J, Wang F J, Cheng K, et al. J Proteomics, 2013, 78: 389

[34] Hu L H, Zhou H J, Li Y H, et al. Anal Chem, 2009, 81: 94

[35] Ji L Y, Wu J H, Luo Q, et al. Anal Chem, 2012, 84: 2284

[36] Kweon H K, Hakansson K. Anal Chem, 2006, 78: 1743

[37] Wu J H, Li X S, Zhao Y, et al. Chem Commun, 2010, 46: 9031

[38] Min Q H, Zhang X X, Zhang H Y, et al. Chem Commun, 2011, 47: 11709

[39] Lin B, Li T, Zhao Y, et al. J Chromatogr A, 2008, 1192: 95

[40] Lu S, Luo Q, Li X C, et al. Analyst, 2010, 135: 2858

[41] Liu H L, Yang T Y, Dai J Y, et al. Analyst, 2015, 140: 6652

[42] Yao J, Sun N, Deng C, et al. Talanta, 2016, 150: 296

[43] Zhu G T, He X M, Chen X, et al. J Chromatogr A, 2016, 1437: 137

[44] Lu Z D, Ye M M, Li N, et al. Angew Chem Int Edit, 2010, 49: 1862

[45] Ong S E, Blagoev B, Kratchmarova I, et al. Mol Cell Proteomics, 2002, 1: 376

[46] Gygi S P, Rist B, Gerber S A, et al. Nat Biotechnol, 1999, 17: 994

[47] Ross P L, Huang Y L N, Marchese J N, et al. Mol Cell Proteomics, 2004, 3: 1154

[48] Thompson A, Schafer J, Kuhn K, et al. Anal Chem, 2003, 75: 1895

[49] Boersema P J, Foong L Y, Ding V M Y, et al. Mol Cell Proteomics, 2010, 9: 84

[50] Hsu J L, Huang S Y, Chow N H, et al. Anal Chem, 2003, 75: 6843

[51] Wu C J, Chen Y W, Tai J H, et al. J Proteome Res, 2011, 10: 1088

[52] Chen X Q, Li S Y, Zhang X X, et al. Nanoscale, 2015, 7: 5815

[53] Chakraborty A, Regnier F E. J Chromatogr A, 2002, 949: 173

[54] Ji J Y, Chakraborty A, Geng M, et al. J Chromatogr B, 2000, 745: 197

[55] Zhang R J, Sioma C S, Wang S H, et al. Anal Chem, 2001, 73: 5142

[56] Kindy J M, Taraszka J A, Regnier F E, et al. Anal Chem, 2002, 74: 950

[57] Xun Z Y, Sowell R A, Kaufman T C, et al. Mol Cell Proteomics, 2008, 7: 1191

[58] Du Z F, Luo Q, Yang L P, et al. J Am Chem Soc, 2014, 136: 2948

[59] Zhai G J, Wu X Y, Luo Q, et al. Talanta, 2014, 125: 411

[60] Gerber S A, Rush J, Stemman O, et al. P Natl Acad Sci USA, 2003, 100: 6940

[61] Zhang X W, Li L, Wei D, et al. Trends Biotechnol, 2007, 25: 166

[62] Diamandis E P. J Natl Cancer I, 2010, 102: 1462

[63] Qin H Q, Wang F J, Wang P Y, et al. Chem Commun, 2012, 48: 961

[64] Min Q H, Chen X Q, Zhang X X, et al. Lab Chip, 2013, 13: 3853

Separation, enrichment, mass spectrometric quantification and evaluation of serum phosphopeptides as potential tumor biomarkers

ZHAI Guijin1,2, WU Kui1, WANG Fuyi1,3*

(1.CASKeyLaboratoryofAnalyticalChemistryforLivingBiosystems,InstituteofChemistry,ChineseAcademyofSciences,Beijing100190,China; 2.TianjinKeyLaboratoryofMedicalEpigenetics,DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China;3.UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China)

Serum phosphopeptides has been a vital objective for the discovery of tumor biomarkers as their levels can reflect the changes in the activities of both endo- and exo-proteases, and the level of protein phosphorylation. Comprehensive analysis of serum phosphopeptides may lead to discovery of novel tumor biomarkers for clinical diagnosis. However, the extremely low abundance of serum phosphopeptides as well as high background level of highly abundant non-phosphoproteins/peptides makes the mass spectrometry (MS)-based phosphopeptide profiling a great challenge. In this review, we will summarize and review update advances in the separation, enrichment and MS quantification of phosphopeptides as well as the evaluation of serum phosphopeptides as potential tumor biomarkers. We will also prospect the future tendency and applications of this multi-disciplinary research field.

phosphopeptides; separation and enrichment; mass spectrometric quantification; tumor biomarkers; serum; review

10.3724/SP.J.1123.2016.08037

2016-08-30

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21135006,21127901,21275148,21575145,21321003);國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013CB531805).

Foundation item: National Natural Science Foundation of China (Nos. 21135006, 21127901, 21275148, 21575145, 21321003); National Program on Key Basic Research Project of China (“973” Program) (No. 2013CB531805).

O658

A

1000-8713(2016)12-1192-07

鄒漢法研究員紀(jì)念專輯(上)·專論與綜述

* 通訊聯(lián)系人.Tel:(010)62529069,E-mail:fuyi.wang@iccas.ac.cn.