腺嘌呤誘導幼鼠慢性腎功能衰竭模型建立的實驗研究

李秀花， 趙麗君， 李 娜， 馮 杏， 賈曉靜， 崔建軍

(1山西醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學教研室，太原 030001； 2山西省兒童醫(yī)院腎內(nèi)科； 3山西醫(yī)科大學兒科醫(yī)學系； *通訊作者，E-mail：yks5046@126.com)

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腺嘌呤誘導幼鼠慢性腎功能衰竭模型建立的實驗研究

李秀花1*， 趙麗君2， 李 娜3， 馮 杏3， 賈曉靜3， 崔建軍2

(1山西醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學教研室，太原 030001；2山西省兒童醫(yī)院腎內(nèi)科；3山西醫(yī)科大學兒科醫(yī)學系；*通訊作者，E-mail：yks5046@126.com)

目的 探討腺嘌呤灌胃法制作幼鼠慢性腎功能衰竭模型的效果。 方法 4周齡雄性Wistar大鼠24只，隨機分為正常組和模型組，每組12只。模型組按200 mg/(kg·d)劑量灌胃給予2%腺嘌呤混懸液,誘導幼鼠慢性腎功能衰竭模型。測定血清尿素氮、肌酐及24 h尿蛋白含量，取腎組織進行HE、PAS、Masson染色，并用JG12免疫組化觀察腎小球毛細血管的變化，評價模型的制作效果。 結果 腺嘌呤灌胃后32 d，模型組大鼠血清尿素氮、肌酐、24 h尿蛋白含量較正常組明顯增高[BUN:15.22±4.25vs4.52±0.94,P<0.01;SCr:198.22±84.16vs42.81±9.07,P<0.01;24 h尿蛋白:73.37±31.08vs11.61±1.04,P<0.05]。腎臟病理染色結果發(fā)現(xiàn)部分腎小球硬化，腎小管萎縮、壞死、脫落，腎間質纖維化，JG12染色結果顯示腎小球毛細血管細胞數(shù)目減少。 結論 成功建立幼鼠慢性腎功能衰竭模型，血生化指標及腎臟病理損傷符合慢性腎功能衰竭病理生理學特點。

腺嘌呤； 慢性腎衰竭； 慢性腎疾病

小兒慢性腎功能衰竭(chronic renal failure, CRF)是腎單位受到破壞而減少，導致腎臟的內(nèi)分泌代謝功能及排泄調(diào)節(jié)功能發(fā)生一系列的病理生理改變，造成機體內(nèi)環(huán)境紊亂的臨床綜合征[1]。近年來國內(nèi)外許多研究者對CRF的實驗動物模型進行了研究并取得了很大的進展[2]。腺嘌呤作為一種藥物學造模方法，已證實可以建立接近臨床實際的CRF動物模型[3]，但關于幼鼠CRF模型的研究報道很少。因此，建立理想的，且適用廣泛、簡便、穩(wěn)定、可控的幼鼠CRF模型，對研究探討小兒CRF的病因、發(fā)病機制、血生化變化及病理學改變尤為重要。本研究采用腺嘌呤灌胃法制作幼鼠CRF模型，旨在為幼鼠CRF模型制作方法提供新的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性近交系的Wistar大鼠24只，4周齡，體重(90±10)g，購自中國軍事醫(yī)學科學院動物中心，動物質量合格證號：SCXK-(軍)-2015-004。所有動物在山西醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學教研室動物室內(nèi)飼養(yǎng)，室溫環(huán)境可控：溫度(22±3)℃；相對濕度(55±5)%；12 h光暗交替，自由攝取標準飼料及飲水。

1.2 主要試劑

腺嘌呤(adenine,Sigma,USA)配制成2%混懸液備用，血尿素氮(BUN)測試盒(二乙酰肟法，南京建成生物工程研究所，貨號C013-1)、肌酐(Cr)測試盒(苦味酸比色法，南京建成生物工程研究所，貨號C011-1)、尿蛋白定量測試盒(CBB法，南京建成生物工程研究所，貨號C035-2)、氨肽酶P(aminopeptidase P,JG12)小鼠抗大鼠單克隆抗體(Santa Cruz,USA)、SP-9002二步法免疫組化試劑盒(北京中衫金橋生物技術有限公司)。

1.3 模型制備及方法

大鼠適應性喂養(yǎng)1周，按體重隨機分為2組，每組12只。模型組大鼠按200 mg/(kg·d )劑量，每日早晨灌胃給予2%腺嘌呤混懸液[4]。正常組大鼠每日一次灌胃給予蒸餾水10 ml/(kg·d )。兩組大鼠連續(xù)灌胃32 d。所有大鼠每周稱體重1次，每日觀察大鼠飲食、飲水、精神狀態(tài)、毛發(fā)及尿量等。

1.4 大鼠腎功能參數(shù)的檢測

腺嘌呤灌胃第32天，將所有大鼠置于代謝籠收集24 h尿液，采用考馬斯亮藍法檢測24 h尿蛋白含量；頸靜脈采血，室溫靜置30 min，3 000×g離心10 min，取血清，二乙酰肟法檢測血清尿素氮含量，苦味酸比色法檢測肌酐的含量。處死各組大鼠，取雙側腎臟，剔除包膜，稱重并測量腎臟的大小。

1.5 大鼠腎組織病理學的檢測

腎組織經(jīng)10%中性甲醛固定過夜，石蠟包埋后切片(4 μm)，常規(guī)脫蠟至水后進行HE、PAS、Masson染色，顯微鏡下觀察其病理學變化。

腎組織經(jīng)10%中性甲醛固定過夜，石蠟包埋后切片(4 μm)，常規(guī)脫蠟至水，浸于檸檬酸鹽緩沖液中高壓熱修復抗原3 min。自然冷卻后，3% H2O2封閉10 min，PBS沖洗3次，每次5 min。滴加JG12一抗(1∶50，Santa Cruz)，4 ℃孵育過夜。PBS浸洗，加入二抗，37 ℃孵育30 min。DAB顯色，鏡下觀察染色情況。根據(jù)JG12的染色結果，觀察腎小球毛細血管的變化。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 大鼠一般情況的變化

腺嘌呤灌胃后，模型組大鼠表現(xiàn)為進食量減少，飲水量增加，體重增長緩慢，24 h尿量(ml)較正常組明顯增多(40.75±3.19vs9.58±1.93,P<0.001)，活動量減少，精神萎靡，蜷縮弓背，豎毛，鼠毛缺少光澤并有脫毛現(xiàn)象。正常組大鼠，活動、鼠毛、體重增長正常(見圖1)。實驗期間模型組死亡2只，正常組無死亡。

圖1 正常組和模型組大鼠不同時間點的體重變化Figure 1 Changes of body weight at different time points in two groups

2.2 血清生化指標的變化

腺嘌呤灌胃32 d后，檢測各組大鼠的腎功能，結果顯示模型組大鼠血清BUN、SCr和24 h尿蛋白均較正常對照組升高，差異有統(tǒng)計學意義(見表1)。

組別尿素氮(mmol/L)肌酐(μmol/L)尿蛋白(mg/24h)正常組4.52±0.94 42.81±9.07 11.61±1.04模型組15.22±4.25**198.22±84.16** 73.37±31.08*

與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.3 腎外觀的變化

腺嘌呤灌胃32 d，模型組大鼠腎臟體積明顯增大，灰白色，表面凹凸不平呈細顆粒狀，類似人類的“大白腎”，切面觀察腎皮髓質界限不清，部分可見髓質壞死。而正常組大鼠腎臟形態(tài)正常，如蠶豆大小，呈紅褐色，表面有光澤，切面觀察腎皮髓質分界清楚(見圖2)。

2.4 腎臟病理損傷情況

光鏡觀察：正常組大鼠腎小球結構及數(shù)目正常，腎小球囊腔無擴張，球囊無粘連，腎小球毛細血管袢開放良好，基底膜無增厚，未見明顯的系膜細胞及系膜基質增生。腎小管結構正常，管腔無萎縮，無管腔擴張，未見腎小管上皮細胞壞死，未見蛋白管型。腎間質未見明顯的纖維組織增生，偶見少許炎細胞浸潤。腺嘌呤灌胃后，大鼠腎組織的病理改變比較明顯。模型組大鼠腎小球毛細血管數(shù)目減少較正常組明顯的減少(33.21±2.08vs66.93±3.98,P<0.001)，部分毛細血管袢分布不均、管腔閉合，腎小球囊腔縮小，球囊粘連、萎縮，可見少許球性硬化的腎小球，基底膜普遍增厚，系膜基質增生。腎小管上皮細胞空泡變性、壞死、刷毛緣脫落，部分腎小管管腔代償性擴張，腎小管內(nèi)可見大量褐色結晶物沉著，部分可見蛋白管型。腎間質有大量炎細胞浸潤，間質纖維化明顯，可見部分腎小動脈管壁增厚，玻璃樣變性(見圖3，4)。模型組腎小球硬化指數(shù)為2.69±0.24，正常組為0.30±0.01，兩組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。模型組腎小管間質纖維化面積(%)為77.39±2.31，正常組為2.60±0.31，兩組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖2 正常組和模型組腎臟外觀的比較Figure 2 The appearance of the renal in CRF rats

A-C.分別為正常組HE、PAS、Masson染色；D-F分別為模型組HE、PAS、Masson染色圖3 正常組和模型組腎臟病理變化 (×200)Figure 3 Pathological changes of kidney in CRF rats and normal rats (×200)

3 討論

慢性腎衰竭的幼鼠模型是研究探討兒童CRF的病因、發(fā)病機制、治療干預措施的一種重要工具?，F(xiàn)階段手術方法制備幼鼠CRF模型存在一定的局限性，包括手術操作技巧的要求，術后護理實驗動物設施的需求以及高病死率，這促使我們開發(fā)一種基于腺嘌呤攝取引起腎功能衰竭的非手術模型。該方法已成功應用于成年大鼠，但關于幼鼠的研究報道比較少見。

本實驗采用按體重灌胃給藥，讓每只動物盡可能獲取同種程度的腎損害，使CRF動物模型標準化。根據(jù)腺嘌呤劑量的大小和喂養(yǎng)時間的長短制作成輕、中、重度的腎衰模型，病程穩(wěn)定，適宜長期給藥，成功率高[5]。研究者報道，高濃度的腺嘌呤通過黃嘌呤氧化酶的作用生成2,8-二羥基腺嘌呤，后者堵塞腎小管管腔，影響氮質化合物的排除，導致血清尿素氮、肌酐、尿酸顯著上升；尿酸在血中呈過飽和狀態(tài)形成結晶，沉積于腎小球、腎小管及腎間質部位，刺激局部引起異物肉芽腫性炎癥，腎單位的大量喪失，最終導致腎功能衰竭[6]。這種由代謝改變復制的慢性腎疾病(chronic kidney disease，CKD)模型，以腎小管和腎間質結晶沉積，異物肉芽腫形成，腎間質纖維化為特征的小管間質性疾病，通常發(fā)生在許多CKD的患兒[7]。

圖4 正常組和模型組腎小球毛細血管變化 (×200)Figure 4 The changes of glomerular capillary in CRF rats and normal rats (×200)

CRF典型的病理學特征是微血管系統(tǒng)的受損缺失[8,9]，既往對腎組織血管的研究主要是通過免疫組化方法特異性染色內(nèi)皮細胞[10]，再進行半定量分析。以前常用的普通血管內(nèi)皮細胞標記物如CD34、CD31已被證實在淋巴管的內(nèi)皮細胞中也有表達，這易造成淋巴管增生導致的內(nèi)皮增生的假象。因此，本實驗選取氨肽酶P(JG12)—一種新的血管內(nèi)皮細胞標記物，較普通血管內(nèi)皮細胞標記物更具有特異性，在腎臟特異表達于腎間質和腎小球毛細血管[11]。本研究以JG12陽性細胞個數(shù)計數(shù)腎小球毛細血管內(nèi)皮細胞數(shù)目，發(fā)現(xiàn)腺嘌呤誘導的CRF大鼠腎小球毛細血管內(nèi)皮細胞數(shù)目明顯減少，毛細血管袢分布不均，部分毛細血管管腔閉合。這些與以前的實驗研究相符，即慢性腎疾病共同通路是腎臟微血管系統(tǒng)的進行性缺失或閉塞，進而引起腎組織纖維化、腎單位丟失。進一步觀察病理形態(tài)學變化，結果顯示：腎小管及腎間質有大量咖啡色結晶沉積，部分腎小管完全破壞，間質纖維組織增生明顯，部分腎小球出現(xiàn)節(jié)段性硬化，表明腺嘌呤造模是成功的。

腺嘌呤誘導的CRF模型簡單，可復性好，不需要侵入性干預，與兒童首發(fā)的CKD小管間質病變相似。需要進一步的研究這種幼鼠模型的特征。研究發(fā)現(xiàn)，腺嘌呤誘導的慢性腎疾病幼鼠存在生長發(fā)育遲緩及軟骨內(nèi)骨化異常[12]。本研究觀察到，腺嘌呤灌胃后，大鼠的體重增長緩慢，甚至出現(xiàn)體重下降。生長遲緩是兒童慢性腎疾病的主要表現(xiàn)。在臨床研究中，還很難評估影響CKD患兒生長發(fā)育的各種致病因素，這可能為將來研究CKD患兒生長發(fā)育提供一種新的實驗模型。

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Experimental study of juvenile rats with chronic renal failure induced by adeniene

LI Xiuhua1*, ZHAO Lijun2, LI Na3, FENG Xing3, JIA Xiaojing3, CUI Jianjun2

(1DepartmentofFoodNutritionandHygiene,SchoolofPublicHealth,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;2DepartmentofNephrology,ShanxiProvincialChildren’sHospital;3DepartmentofPediatrics,ShanxiMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:yks5046@126.com)

ObjectiveTo investigate the effect of adenine-induced chronic renal failure(CRF) model in juvenile rats.MethodsThe 4-week-old male Wistar rats were randomly divided into normal group(n=12) and CRF group(n=12). The 2% adenine suspension was gavaged to induce chronic renal failure in juvenile Wistar rats. The contents of urea nitrogen, creatinine in serum and 24 h urinary protein were determined. The renal tissue was taken to observe the histopathological changes by HE, PAS and Masson staining for evaluating the effect of the model.ResultsThe serum urea nitrogen, creatinine and 24 h urinary protein levels were significantly higher in rats with adenine-induced CRF than in normal rats[BUN: 15.22±4.25vs4.52±0.94,P<0.01;SCr:198.22±84.16vs42.81±9.07,P<0.01;24 h urinary protein:73.37±31.08vs11.61±1.04,P<0.05]. HE, PAS and Masson staining of kidney showed glomerular sclerosis, renal tubular atrophy,necrosis, abscission, and renal interstitial fibrosis.ConclusionThe model of chronic renal failure in juvenile rats by intragastric administration of adenine is successfully established. Blood biochemical indicators and renal pathological damage conform to pathological physiology of CRF.

adenine; chronic renal failure; chronic kidney diseases

山西省科技攻關基金資助項目(20100311102-1)

李秀花，女，1957-12生，大專，高級實驗師,E-mail:yks5046@126.com

2016-05-30

R692.5

A

1007-6611(2016)11-0978-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.11.004