綠原酸對大鼠阻塞性黃疸導致的肝纖維化的治療作用

吳多虎， 鮑傳裕， 李龍鶴， 鄒永平， 袁 巍， 王德森， 謝晉元， 宮曉光

(海南省人民醫(yī)院急診科，?？?570311; *通訊作者，E-mail: wdhhx@126.com)

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綠原酸對大鼠阻塞性黃疸導致的肝纖維化的治療作用

吳多虎， 鮑傳裕， 李龍鶴， 鄒永平， 袁 巍， 王德森， 謝晉元， 宮曉光*

(海南省人民醫(yī)院急診科，海口 570311;*通訊作者，E-mail: wdhhx@126.com)

目的 探索綠原酸(CA)對阻塞性黃疸導致的肝纖維化模型大鼠治療作用及其作用機制。 方法 Wistar大鼠行膽總管結(jié)扎手術(shù)復制阻塞性黃疸肝纖維化模型，隨機分為模型組、水飛薊賓組(Sil，50 mg/kg)、綠原酸低、中和高劑量組(37.5，75，150 mg/kg)，同時設假手術(shù)對照組。除模型組和對照組外，其他各組大鼠均按10 ml/kg體重灌胃相應劑量藥物，持續(xù)4周。實驗結(jié)束后計算肝臟指數(shù)，HE觀察肝臟損傷及Masson觀察纖維化程度，RT-PCR技術(shù)檢測肝臟Ⅰ和Ⅲ型膠原、VEGF、TGF-β1的mRNA水平，免疫印跡法檢測α-SMA蛋白的表達水平。 結(jié)果 膽總管結(jié)扎術(shù)誘導模型大鼠肝臟指數(shù)明顯增加，肝組織出現(xiàn)明顯病理改變，并伴有纖維化發(fā)生；與模型組相比，綠原酸中高劑量組肝臟指數(shù)明顯降低，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，炎癥細胞浸潤減少，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞緩解，同時Ⅰ、Collagen Ⅲ、TGF-β1、VEGF mRNA水平，α-SMA蛋白的表達顯著降低(P<0.05)。 結(jié)論 綠原酸在可通過抑制TGF-β1、VEGF和α-SMA的表達從而降低膽總管結(jié)扎誘導的肝纖維化病變的風險。

綠原酸； 阻塞性黃疸； 肝纖維化

膽總管結(jié)扎手術(shù)是制備肝纖維化動物模型的方法之一，該模型在評估藥物對肝臟的潛在保護作用研究方面具有重要的意義[1]。肝纖維化發(fā)生與肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)的活化密不可分，活化的HSC可過量表達α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，誘導大量細胞外基質(zhì)如膠原等沉積，從而導致肝纖維化[2]。綠原酸(chlorogenic acid，CA)是植物在有氧呼吸過程中產(chǎn)生的一類苯丙類化合物，屬于酚類抗氧化劑。大量文獻報道，綠原酸對四氯化碳(CCl4)導致的肝損傷和肝纖維化有明顯的抑制作用，高劑量的綠原酸治療效果最明顯[3,4]。在大鼠阻塞性黃疸導致的肝纖維化研究中發(fā)現(xiàn)，綠原酸在阻塞性黃疸早、中期可促進HSC凋亡，抑制纖維化肝組織膠原的產(chǎn)生與沉積減輕肝纖維化，降低肝臟損傷程度[5]。另外，綠原酸還能有效地保護對脂多糖誘導小鼠急性肝損傷[6]。最近的一項研究表明，綠原酸對治療乙酰氨基酚引起的小鼠肝損傷有明顯的解毒作用[7]。

本實驗通過建立阻塞性黃疸大鼠模型，應用不同劑量的綠原酸進行干預，檢測大鼠肝纖維化程度、纖維化相關(guān)因子mRNA水平，旨在研究綠原酸對大鼠肝纖維化的治療效果及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級Wistar大鼠，雌雄各半，體重(250±15)g，由中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供，合格證號SCXK(京)2004-0004。飼養(yǎng)在室溫(22±2)℃、相對濕度55%±5%的動物房，明暗交替各12 h。

1.2 藥物和主要試劑

綠原酸，純度>99%，美國Sigma公司提供。水飛薊賓(Silibinin，Sil)由天津天士力制藥股份有限公司提供。三磷酸脫氧核苷(dNTP)混合液、逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)、DNA聚合酶(Taq)由寶生物工程有限公司提供；寡核苷酸引物Oligo(dT)16、PCR擴增引物由美國Invitrogen公司合成。兔抗α-SMA、羊抗β-actin、α-SMA-鼠抗兔IgG和β-actin-兔抗羊IgG均由美國Sigma公司提供。

1.3 阻塞性黃疸大鼠模型的建立

術(shù)前禁食12 h，腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛(350 mg/kg)，深度麻醉后，取上腹部正中直切口，長約2 cm，逐層進腹，暴露十二指腸。找到膽總管和十二指腸，靠近十二指腸處用絲線兩端結(jié)扎，依次關(guān)腹。對照組僅游離膽總管不予結(jié)扎，其他各組均采用膽總管結(jié)扎的方法。膽總管結(jié)扎第4周后，運用病理組織學方法檢測模型組，肝纖維化程度為100%，視為建模成功。

1.4 實驗動物分組及處理

模型大鼠隨機分為模型組(n=12)、綠原酸低、中、高劑量組(37.5，75，150 mg/kg，各組n=11)、Sil組(50 mg/kg，n=11)，同時設置假手術(shù)對照組(n=10)。除對照組和模型組大鼠灌胃蒸餾水外，綠原酸低、中、高劑量組和Sli組給予不同劑量的相應藥物，灌胃體積按10 ml/kg體重計算，每日一次，持續(xù)4周。

1.5 肝臟指數(shù)檢測

末次給藥后2 h，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，仰臥位摘取全部肝臟，稱取肝臟濕重。按照公式：肝臟指數(shù)=肝臟質(zhì)量/體重×100%，計算每組大鼠的肝臟指數(shù)。

1.6 肝臟組織病理學觀察

取大鼠肝臟大葉同一部分組織，用多聚甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、透化、石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚約5 μm，經(jīng)脫蠟復水后。分別用HE染色和Masson染色，光學顯微鏡觀察病理變化。

1.7 RT-PCR檢測

利用Trizol試劑提取肝組織細胞的總RNA。將1 μl提取的總RNA(1 μg/μl)和1.0 μl Oligo(dT)16溶于6.0 μl DEPC的滅菌雙蒸水中，制備模板RNA。取模板RNA6 μl加入到反轉(zhuǎn)錄反應體系中，內(nèi)含5×M-MLV buffer 2 μl、dNTP Mixture(各10 μmol/L)0.5 μl、RNase inhibitor(40 U/μl)0.25 μl、RTase M-MLV，即RNase H-(200 U/μl)0.5 μl和RNase free dH2O 10 μl。42 ℃保溫1 h，70 ℃保溫15 min，冰上冷卻，得到的cDNA溶液直接用于PCR。利用Primer Premier 6.0軟件設計Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TGF-β1、VEGF 基因PCR擴增引物，并同時設計內(nèi)參GAPDH基因擴增引物，引物序列見表1。用1.5%瓊脂凝膠電泳檢測Collagen Ⅰ，Collagen Ⅲ，TGF-β1和VEGF的mRNA表達水平，并采用Gle-pro分析系統(tǒng)對DNA條帶進行半定量分析。目的基因與內(nèi)參mRNA的比值表示目的基因的mRNA表達情況。

表1 目標基因和內(nèi)參基因的引物序列

Table 1 Primer sequences of target genes and internal gene

基因名稱引物序列VEGFFP:5'-CTGCTGTACCTCCACCAT-3'RP:5'-ACAGGACGGCTTGAAGAT-3'TGF-β1FP:5'-GCAACAACGCCATCTATG-3'RP:5'-CAAGGTAACGCCAGGAAT-3'CollagenⅠFP:5'-CAGAGTGGAAGAGCGATTA-3'RP:5'-CAAGGACAGTGTAGGTGAA-3'CollagenⅢFP:5'-GTCCACAGCCTTCTACAC-3'RP:5'-TTCCTGACTCTCCATCCTT-3'GAPDHFP:5'-TCTCCTGCGACTTCAACA-3'RP:5'-TGTAGCCGTATTCATTGTCA-3'

1.8 α-SMA蛋白印跡分析

取肝組織加入含50 mmol/L Trise-HCl(pH 7.5)、150 mmol/L氯化鈉、1%NP-40、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L EGTA和1 mmol/L PMSF的裂解液，冰上裂解10 min，15 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清液。SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜，3%BSA封閉，兔抗α-SMA(1∶1 000)和羊抗β-actin(1∶1 000)4 ℃過夜，二抗α-SMA-鼠抗兔IgG(1∶5 000)；β-actin-兔抗羊IgG(1∶5 000)室溫孵育1 h。通過光密度定量分析α-SMA蛋白譜帶的相對強度。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 肝臟指數(shù)檢測結(jié)果

與對照組比較,模型組大鼠肝臟指數(shù)顯著升高(P<0.001)；低劑量綠原酸組(37.5 mg/kg)大鼠肝臟指數(shù)組與模型組比較無明顯差異(P>0.05)，而中、高綠原酸劑量及水飛薊賓可以明顯降低肝臟指數(shù)(P<0.01，見圖1)。

2.2 肝組織病理學變化

對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索排列整齊，以中央靜脈為中心呈放射狀，肝細胞正常，匯管區(qū)無炎性細胞浸潤，肝血竇正常無充血(見圖2)；模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂不清，肝索解離，可見匯管區(qū)炎細胞浸潤逐漸加重(見圖2)，提示梗阻性黃疸肝損傷模型建立成功。綠原酸給藥組大鼠肝組織浸潤炎癥細胞減少，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞現(xiàn)象緩解，尤其以高劑量組最為明顯(見圖2)。

A.對照組；B.模型組；C.CA 37.5 mg/kg組；D.CA 75 mg/kg組；E.CA 150 mg/kg組；F.水飛薊賓組;與對照組比較，#P<0.001；與模型組比較，**P<0.01圖1 綠原酸對膽總管結(jié)扎手術(shù)模型大鼠肝臟指數(shù)的影響Figure 1 Effect of chlorogenic acid(CA) on liver index in bile duct ligation-induced rats

A.對照組；B.模型組；C.CA37.5 mg/kg組；D.CA75 mg/kg組；E.CA150 mg/kg組；F.水飛薊賓組圖2 綠原酸對膽總管結(jié)扎手術(shù)模型大鼠肝臟形態(tài)學的影響 (×100)Figure 2 Effects of chlorogenic acid(CA) on liver histological changes of bile duct ligation-induced rats (×100)

2.3 肝纖維化評價

對照組大鼠肝臟無明顯纖維化結(jié)構(gòu)；模型組大鼠具有明顯的纖維化橋接，大量的膠原沉積物環(huán)繞在匯管區(qū)，纖維化區(qū)域蔓延連接并將肝臟分為大量單獨的假小葉；隨著綠原酸劑量的增加，纖維化程度明顯改善(見圖3)。

2.4 肝組織中纖維化相關(guān)因子表達分析

肝纖維化相關(guān)因子Ⅰ型和Ⅲ型膠原、TGF-β1及VEGF基因在正常大鼠肝組織中處于低表達水平，而膽總管結(jié)扎模型大鼠各因子基因均明顯上調(diào)；而各治療組纖維化相關(guān)因子均出現(xiàn)不同程度下調(diào)，尤其以150 mg/kg綠原酸組降低最為顯著(P<0.05, 見圖2)。

2.5 肝組織中α-SMA表達分析

正常大鼠肝組織中α-SMA蛋白處于低表達水平，而膽總管結(jié)扎模型大鼠肝組織α-SMA表達顯著增加(P<0.001)；各治療組大鼠肝組織α-SMA表達均不同程度降低，綠原酸可劑量依賴性降低其表達，尤其以高劑量(150 mg/kg)降低最為顯著(P<0.01，見圖5)。

A.對照組；B.模型組；C.CA 37.5 mg/kg組；D.CA 75 mg/kg組；E.CA 150 mg/kg組；F. 水飛薊賓組圖3 綠原酸對膽總管結(jié)扎手術(shù)模型大鼠肝纖維化的影響 (×100)Figure 3 Effects of chlorogenic acid(CA) on liver fibrosis of bile duct ligation-induced rats (×100)

與對照組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05圖4 綠原酸對膽總管結(jié)扎模型大鼠肝臟Ⅰ和Ⅲ型膠原、TGF-β1及VEGF基因表達影響Figure 4 Effects of chlorogenic acid(CA) on collagen Ⅰ,collagen Ⅲ,TGF-β1, and VEGF mRNA in the liver of BDL rats

3 討論

本研究表明綠原酸能對膽總管結(jié)扎導致的肝纖

與對照組比較，#P<0.001；與模型組比較，**P<0.01圖5 綠原酸對膽總管結(jié)扎模型大鼠肝臟α-SMA蛋白表達的影響Figure 5 Effects of chlorogenic acid(CA) on α-SMA protein expression in the liver of BDL rats

維化大鼠模型具有保護作用。中劑量和高劑量綠原酸可顯著降低大鼠肝臟指數(shù)，提示綠原酸可緩解膽總管結(jié)扎導致引發(fā)的肝腫大。HE染色和Masson染色病理結(jié)果顯示，綠原酸可顯著抑制肝臟內(nèi)炎癥反應和纖維化程度。低劑量的綠原酸(37.5 mg/kg)對治療肝纖維化效果不明顯，而高劑量的綠原酸(75-150 mg/kg劑量范圍)可顯著改善肝纖維化程度。這與高劑量的綠原酸(70-140 mg/kg劑量范圍)對四氯化碳(CCl4)導致的肝纖維化有明顯的抑制作用相一致[8]。此外，本研究表明高劑量綠原酸能導致α-SMA蛋白表達降低。α-SMA蛋白的表達是HSC激活的標志，活化的HSC高表達α-SMA與其自身獲得收縮能力有關(guān)[9]。抑制α-SMA蛋白的表達可直接或間接抑制HSC的激活或誘導其凋亡，進而抑制肝纖維化發(fā)展[10]。已有文獻報道，活化的HSC細胞凋亡與肝纖維化的緩解有關(guān)[11]。肝損傷后能激活枯否細胞(Kupffer cell，KC)分泌TGF-β等細胞因子，活化HSC細胞，使HSC細胞增殖，轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細胞，并且合成大量的Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和纖維連接蛋白等細胞外基質(zhì)(ECM)成分，導致肝纖維化[12,13]。1998年Schuppan等[14]曾報道，TGF-β抗體靜脈注射治療結(jié)扎膽總管造成的大鼠肝纖維化獲得較好的效果。TGF-β被眾多的研究認為是最主要的致肝纖維化介質(zhì)，TGF-β能刺激Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維連接蛋白的合成[15,16]。在本實驗中，綠原酸治療組的Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TGF-β1、VEGF基因的表達低于模型組，表明綠原酸能夠改善肝纖維化程度，其作用機制可能與綠原酸能夠抑制肝纖維化相關(guān)因子表達有關(guān)。

綠原酸可以促進HSC細胞的凋亡，抑制纖維化肝組織膠原的產(chǎn)生與沉積減輕肝纖維化，降低肝臟損傷程度。促進活化的HSC細胞的凋亡一直被認為是治療肝纖維化的有效措施[17]。細胞凋亡的發(fā)生是由基因調(diào)控的，Bax和Bcl-2以及Bcl-xl和Bcl-xs是兩對能促進和抑制細胞凋亡的代表基因[18]。Novo等[19]的研究認為肝組織中Bax/Bcl-2比值決定著 HSC凋亡的調(diào)控方向，當Bax/Bcl-2 比值較高(>23/29)時，誘導HSC凋亡；比值較低(<23/29)時，HSC的凋亡受到抑制。因此，下一步應探究在阻塞性黃疸大鼠中，綠原酸是否影響這些基因的表達從而影響HSC細胞的凋亡。

本研究結(jié)果表明綠原酸能抑制總膽管結(jié)扎引起的肝損傷，盡管尚未完全明確其作用機制，但該研究表明綠原酸能通過抑制TGF-β1、VEGF和α-SMA的表達從而改善肝纖維化。因此，綠原酸可作為治療肝纖維化的潛在藥物。

[1] Chen Y,Zong C,Guo Y,etal.Hydrogen-rich saline may be an effective and specific novel treatment for osteoradionecrosis of the jaw[J].Ther Clin Risk Manag,2015,11:1581-1585.

[2] Ghatak S,Biswas A,Dhali GK,etal.Oxidative stress and hepatic stellate cell activation are key events in arsenic induced liver fibrosis in mice[J].Toxicol Appl Pharmacol,2011,251(1):59-69.

[3] Lu HT,Jiang Y,Chen F.Application of preparative high-speed counter-current chromatography for separation of chlorogenic acid from Flos Lonicerae[J].J Chromatogr A,2004,1026(1/2):185-190.

[4] 戚曉淵,史秀靈,高銀輝,等.綠原酸抗肝纖維化作用的研究[J].中國實驗方劑學雜志,2011,17(15):139-143.

[5] 黃偉煒,陳一明,宮曉光,等.綠原酸對阻塞性黃疸大鼠肝纖維化的治療作用及其機制[J].環(huán)球中醫(yī)藥,2012,5(8):561-565.

[6] Xu Y,Chen J,Yu X,etal.Protective effects of chlorogenic acid on acute hepatotoxicity induced by lipopolysaccharide in mice[J].Inflamm Res,2010,59(10):871-877.

[7] Zheng Z,Sheng Y,Lu B,etal.The therapeutic detoxification of chlorogenic acid against acetaminophen-induced liver injury by ameliorating hepatic inflammation[J].Chem Biol Interact,2015,238:93-101.

[8] 葉霖財,肖智勇,周文霞,等.四氯化碳致肝纖維化動物模型實驗條件的優(yōu)化[J].軍事醫(yī)學科學院院刊,2010,34(4):340-344.

[9] Friedman SL.Hepatic stellate cells:protean,multifunctional,and enigmatic cells of the liver[J].Physiol Rev,2008,88(1):125-172.

[10] Ramirez AM,Wongtrakool C,Welch T,etal.Vitamin D inhibition of pro-fibrotic effects of transforming growth factor β1 in lung fibroblasts and epithelial cells[J].J Steroid Biochem Mol Biol,2010,118(3):142-150.

[11] Iredale JP.Hepatic stellate cell behavior during resolution of liver injury[J].Semin liver Dis,2001,21(3):427-436.

[12] 黃艷,黃成,李俊.肝纖維化病程中Kupffer細胞分泌的細胞因子對肝星狀細胞活化增殖,凋亡的調(diào)控[J].中國藥理學通報,2010,26(1):9-13.

[13] Issa R,Zhou X,Constandinou CM,etal.Spontaneous recovery from micronodular cirrhosis:evidence for incomplete resolution associated with matrix cross-linking[J].Gastroenterology,2004,126(7):1795-1808.

[14] Schuppan D,Strobel D,Hahn EG.Hepatic fibrosis-therapeutic strategies[J].Digestion,1998,59(4):385-390.

[15] Dooley S,Delvoux B,Lahme B,etal.Modulation of transforming growth factor b response and signaling during transdifferentiation of rat hepatic stellate cells to myofibroblasts[J].Hepatology,2000,31(5):1094-1106.

[16] Seong J,Kim SH,Chung EJ,etal.Early alteration in TGF-β mRNA expression in irradiated rat liver[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys,2000,46(3):639-643.

[17] Li D,Friedman SL.Liver fibrogenesis and the role of hepatic stellate cells:new insights and prospects for therapy[J].J Gastroenterol Hepatol,1999,14(7):618-633.

[18] Bataller R,Brenner DA.Hepatic stellate cells as a target for the treatment of liver fibrosis[J].Semin Liver Dis,2001,21(3):437-451.

[19] Novo E,Marra F,Zamara E,etal.Overexpression of Bcl-2 by activated human hepatic stellate cells:resistance to apoptosis as a mechanism of progressive hepatic fibrogenesis in humans[J].Gut,2006,55(8):1174-1182.

Effects of chlorogenic acid on hepatic fibrosis in the rats with obstructive jaundice

WU Duohu, BAO Chuanyu, LI Longhe, ZOU Yongping, YUAN Wei, WANG Desen, XIE Jinyuan, GONG Xiaoguang*

(DepartmentofEmergency,HainanGeneralHospital,Haikou570311，China;*Correspondingauthor,E-mail:wdhhx@126.com)

ObjectiveTo explore the protective effects of chlorogenic acid(CA) on hepatic fibrosis in rats with obstructive jaundice.MethodsA total of 66 rats were randomly divided into sham group, model group, silibinin group, low, moderate and high CA groups. The hepatic fibrosis models were established by bile duct ligation(BDL). The rats in silibinin group were treated with 50 mg/kg silibinin and the rats in CA groups were treated with 37.5, 75 mg/kg and 150 mg/kg CA for 4 weeks, respectively. In order to assess the effect of CA on liver damage and fibrosis, the liver index, HE and Masson staining were observed. Moreover, the mRNA levels of collagen Ⅰ, Ⅲ, VEGF and TGF-β1 were detected by RT-PCR, and the level of α-SMA was detected by Western blot.ResultsThe liver index in model group increased highly compared to sham group(P<0.001), and there was obvious pathological changes in liver tissues and hepatic fibrosis. The liver index in moderate and high dose groups significantly deceased compared to model group(P<0.01), and the inflammatory cell infiltration and the damage of lobuli hepatic was reduced. The expression of collagen Ⅰ, collagen Ⅲ, VEGF and TGF-β1 mRNA, and α-SMA protein were decreased in high dose group(P<0.01).ConclusionThe results suggest that CA may exhibit a therapeutic potential for liver fibrosis by inhibiting the production of TGF-β1, VEGF and α-SMA.

chlorogenic acid; hepatic fibrosis; collagen Ⅰ

2014年海南省應用技術(shù)研發(fā)與示范推廣專項(ZDXM2014066)

吳多虎,男，1972-12生，本科，副主任醫(yī)師

2016-07-06

R575

A

1007-6611(2016)11-0963-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.11.001