無核紅江橙的無核成因探討

王 平，馬培恰，唐小浪，陳杰忠，吳 文，黃永敬，鐘秀娟

（1. 廣東省農(nóng)科院果樹研究所，廣東 廣州 510640；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東 廣州 510642；3. 海南省農(nóng)墾科學(xué)院，海南 ?？?570206）

無核紅江橙的無核成因探討

王 平1，2，3，馬培恰1，唐小浪1，陳杰忠2，吳 文1，黃永敬1，鐘秀娟1

（1. 廣東省農(nóng)科院果樹研究所，廣東 廣州 510640；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東 廣州 510642；3. 海南省農(nóng)墾科學(xué)院，海南 海口 570206）

以無核紅江橙和普通有核紅江橙為試驗(yàn)材料，對(duì)其花粉育性、成熟胚囊結(jié)構(gòu)以及胚胎發(fā)育進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：（1）無核紅江橙花粉出現(xiàn)敗育的現(xiàn)象，花粉的生活力和發(fā)芽率顯著降低，花粉的畸形率顯著升高，花粉育性屬于低育型。（2）無核紅江橙胚囊發(fā)育是正常的，具有1個(gè)卵細(xì)胞、2個(gè)助細(xì)胞、3個(gè)反足細(xì)胞和1個(gè)中央細(xì)胞。（3）無核紅江橙胚胎發(fā)育也出現(xiàn)敗育的現(xiàn)象，授粉后4周胚體開始退化，授粉后6周胚乳出現(xiàn)退化，授粉后7周胚胎完全退化消失，最終形成無核果實(shí)。綜合分析，花粉敗育和胚胎敗育是無核紅江橙無核的主要原因。

無核紅江橙；花粉育性；成熟胚囊；胚胎發(fā)育

紅江橙因源于廣東省廉江市紅江農(nóng)場(chǎng)而得名，具有早結(jié)、豐產(chǎn)、品質(zhì)優(yōu)良等特點(diǎn)，是我國(guó)與國(guó)外甜橙相媲美的橙類品種之一，深受國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)歡迎，但是由于種子較多降低了經(jīng)濟(jì)價(jià)值［1］。無核柑橘具有無核（或少核）、可食率高、口感好等多個(gè)優(yōu)點(diǎn)［2］，國(guó)內(nèi)外許多柑橘育種專家已將無核性狀作為選育柑橘新品種的重要目標(biāo)，近年來也選育出一些品質(zhì)優(yōu)良的無核（或少核）柑橘品種（系）［3-5］。目前，無核柑橘的獲得途徑是多樣的，主要包括輻射誘變、芽變、雜交育種等方法，如通過芽變選種、實(shí)生選種、輻射育種、生物技術(shù)育種等不同方法均可獲得無核椪柑［6］。按照有性生殖一般過程，引起柑橘無核的主要成因可以分為雄性不育、雌性器官不育、不親和性、單性結(jié)實(shí)、胚胎早期敗育及染色體數(shù)目等方面［7］，如張青閃等［4］研究表明花粉母細(xì)胞（PMc）減數(shù)分裂過程中染色體異常配對(duì)和分離導(dǎo)致了花粉出現(xiàn)敗育，這是造成9個(gè)紅江橙無核（少核）選系無核或少核的主要原因。本試驗(yàn)以廣東省農(nóng)科院果樹研究所通過60Co-γ輻射所得到的無核紅江橙［3，8］和普通有核紅江橙為試驗(yàn)材料，從其花粉育性、胚囊結(jié)構(gòu)、胚胎發(fā)育狀況等方面進(jìn)行研究，旨在探討無核紅江橙無核化的主要成因，并為其生產(chǎn)應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取廣東省廉江市新民鎮(zhèn)黎村柑橘園，生長(zhǎng)健壯、生長(zhǎng)勢(shì)一致的無核紅江橙〔Citrus sinensis（L.） Osbeck var. Seedless Hongjiangcheng〕和普通有核紅江橙〔Citrus sinensis（L.） Osbeck var. Seedy Hongjiangcheng〕為試材，7年生，砧木為江西紅橘，各選3株。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花粉生活力和發(fā)芽率測(cè)定 在無核紅江橙和有核紅江橙的盛花期，采集新鮮含苞待放的花蕾，放在干燥器中讓其自然干燥。利用醋酸洋紅染色法檢測(cè)花粉生活力；利用培養(yǎng)基（1%瓊脂+0.01%硼酸+10%蔗糖）鏡檢花粉發(fā)芽率。采用SASS8.1軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，光學(xué)顯微鏡

（OLYMPUS BH-2）鏡檢，數(shù)碼顯微照相系統(tǒng)（OLYMPUS DP70）拍照。

1.2.2 花粉粒電鏡掃描觀察 采集無核紅江橙和有核紅江橙的新鮮花蕾置于干燥器中，讓其自然散粉，用甘油凍膠封片以供光學(xué)顯微鏡觀察，在掃描電子顯微鏡（FEI-XL，工作電壓15 kV）下觀察花粉形態(tài)結(jié)構(gòu)、極軸長(zhǎng)（P）和赤道軸長(zhǎng)（E），計(jì)算花粉P/E值和畸形率。

1.2.3 成熟胚囊觀察 取無核紅江橙即將開放的花蕾，將其雌蕊固定于卡諾固定液Ⅰ（無水乙醇∶冰醋酸＝3∶1）中，置于70%乙醇中低溫（4℃）保存?zhèn)溆?。胚囊結(jié)構(gòu)觀察參照薛妙男等［9］的方法并作了改進(jìn)。主要步驟如下：2%丙酸乙醇媒染2 d，2%丙酸乙醇+愛氏蘇木精（1∶1）整染5～6 d，沖水返藍(lán)，2.5%纖維素酶和2.5%果膠酶混合液（pH 5.5）37℃下酶解6～7 h，蒸餾水漂洗，乳酚甘油透明，光學(xué)顯微鏡觀察，數(shù)碼顯微照相系統(tǒng)（OLYMPUS DP70）拍照。

1.2.4 胚胎發(fā)育觀察 授粉后1、2、3、4、5、6、7、8周分別取幼果，置于卡諾固定液Ⅰ（無水乙醇∶冰醋酸＝3∶1）中固定24 h，浸洗后放在70%乙醇中保存?zhèn)溆谩２捎贸Ｒ?guī)石蠟切片法進(jìn)行觀察。旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)（AO820）切片，切片厚度8 μm，光學(xué)顯微鏡鏡檢，數(shù)碼顯微照相系統(tǒng)（OLYMPUS IX70）拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 無核紅江橙和有核紅江橙的花粉育性觀察2.1.1 花粉生活力和發(fā)芽率 對(duì)花粉生活力和發(fā)芽率的測(cè)定結(jié)果表明，有核紅江橙的花粉生活力為80.59%、花粉發(fā)芽率為25.96%，屬于高育型，而無核紅江橙的花粉生活力僅為23.45%、花粉發(fā)芽率僅為3.20%，屬于低育型（表1）。通過t檢驗(yàn)表明，花粉生活力和發(fā)芽率差異性均達(dá)極顯著水平。表明無核紅江橙的雄配子絕大多數(shù)已經(jīng)發(fā)生敗育現(xiàn)象。

2.1.2 花粉粒形態(tài) 利用電鏡對(duì)無核紅江橙和有核紅江橙的花粉粒進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無核紅江橙和有核紅江橙的花粉粒群體形態(tài)差異較大，無核紅江橙的絕大多數(shù)花粉粒發(fā)生了敗育現(xiàn)象，花粉溝皺縮，整個(gè)花粉粒出現(xiàn)空癟現(xiàn)象（圖1）。通過無核紅江橙和有核紅江橙的正常花粉粒（P/E）和花粉畸形率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)兩者正常花粉粒的P/E值t檢驗(yàn)P＞0.05，表明無核紅江橙中正常發(fā)育的花粉粒的形態(tài)結(jié)構(gòu)完整；無核紅江橙和有核紅江橙的花粉畸形率分別為68.00%和19.67%，差異達(dá)到達(dá)極顯著水平。可見，無核紅江橙絕大多數(shù)花粉粒出現(xiàn)畸形敗育現(xiàn)象，這與兩者花粉生活力和發(fā)芽率的比較結(jié)果是一致的（表2）。

表1 無核紅江橙和有核紅江橙的花粉生活力和發(fā)芽率比較

圖1 紅江橙花粉粒群體形態(tài)

表2 無核紅江橙和有核紅江橙花粉粒形態(tài)比較

2.2 無核紅江橙成熟胚囊結(jié)構(gòu)觀察

利用酶解法對(duì)無核紅江橙成熟胚囊進(jìn)行了觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無核紅江橙雌蕊中胚囊具有“八核七胞”結(jié)構(gòu)（圖2，封二），合點(diǎn)端有3個(gè)反足細(xì)胞，中間是含2個(gè)極核的中央細(xì)胞，珠孔端有1個(gè)卵細(xì)胞、2個(gè)助細(xì)胞，表明無核紅江橙的成熟胚囊發(fā)育是正常的。

2.3 無核紅江橙雌配子體及胚胎發(fā)育觀察

利用石蠟切片法對(duì)無核紅江橙雌配子和胚胎發(fā)育進(jìn)行觀察，結(jié)果表明無核紅江橙的雌配子體發(fā)育是正常的，通常有9～10室，子房上位，每室有1個(gè)或多個(gè)倒生的胚珠。授粉后前3周，無核紅江橙和有核紅江橙的胚胎發(fā)育是正常的，初期兩者的胚胎發(fā)育進(jìn)入球形胚時(shí)期，隨后由球形胚開始向心形胚轉(zhuǎn)化。但至授粉后4周，無核紅江橙胚胎開始出現(xiàn)敗育現(xiàn)象，胚乳發(fā)育正常，形成中空結(jié)構(gòu)，少數(shù)還可以看到剩余殘?。▓D3A，封二）；而有核紅江橙胚胎發(fā)育正常，進(jìn)入心形胚發(fā)育期（圖3B，封二）。授粉后5周，無核紅江橙隨著細(xì)胞的增大和成熟，中空

結(jié)構(gòu)繼續(xù)增大；有核紅江橙則從心形胚開始向魚雷胚轉(zhuǎn)化。授粉后6周，無核紅江橙的胚乳出現(xiàn)退化，少部分發(fā)育快的珠被和珠柄已退化消失（圖3C，封二）；而有核紅江橙已進(jìn)入子葉胚發(fā)育期（圖3D，封二）。授粉后7、8周，無核紅江橙已沒有種子的痕跡，剩下大量汁囊；而有核紅江橙子葉胚開始向成熟胚轉(zhuǎn)化。綜上所述，無核紅江橙授粉后前3周胚胎發(fā)育是正常的，但到授粉后4周，胚胎出現(xiàn)敗育現(xiàn)象，最終發(fā)育成無核果實(shí)。

3 結(jié)論與討論

胚囊育性下降、花粉敗育、胚胎敗育是柑橘無核的三大誘因，近年來很多研究者從以上3個(gè)方面對(duì)不同柑橘品種進(jìn)行了深入研究，并取得很多可喜的進(jìn)展。本試驗(yàn)亦對(duì)無核紅江橙的胚囊育性、花粉育性和胚胎發(fā)育狀況進(jìn)行觀察和比較，發(fā)現(xiàn)無核紅江橙的花粉育性和胚胎發(fā)育方面發(fā)生明顯的變化。

植物胚囊育性降低會(huì)導(dǎo)致無核果實(shí)，常表現(xiàn)在卵細(xì)胞、極核、助細(xì)胞和反足細(xì)胞在不同時(shí)期出現(xiàn)退化。周心智等［10］研究發(fā)現(xiàn)特晚熟紅桔JZT（P）-1胚珠中的胚囊原始細(xì)胞、孢原細(xì)胞等基本上敗育，最終形成無核果實(shí)。Chen等［11］對(duì)廣西桂林良豐無核椪柑的胚囊發(fā)育過程進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)在胚囊形成前后時(shí)期出現(xiàn)大量退化，這是導(dǎo)致良豐無核椪柑無核的主要成因。本試驗(yàn)結(jié)果表明，無核紅江橙的成熟胚囊結(jié)構(gòu)發(fā)育是正常的，在合點(diǎn)端有3個(gè)反足細(xì)胞，在中間有1個(gè)中央細(xì)胞（含2個(gè)極核），在珠孔端有1個(gè)卵細(xì)胞和2個(gè)助細(xì)胞，表明胚囊育性下降并不是無核紅江橙無核的成因。

植物雄性不育是指雄蕊無法形成正常功能的花粉，例如花粉敗育、花藥中無花粉和花藥不開裂等［12］。邱文明［13］對(duì)黔陽(yáng)無核椪柑的無核機(jī)理進(jìn)行研究，通過花粉掃描電鏡觀察、花粉染色、體外萌發(fā)以及人工授粉等試驗(yàn)，確定黔陽(yáng)無核椪柑無核的原因是雄性不育和雌蕊發(fā)育異常。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與有核紅江橙相比，無核紅江橙的花粉生活力和發(fā)芽率顯著降低，花粉畸形率顯著升高，三者的差異均達(dá)極顯著水平；無核紅江橙屬于低育型，而有核紅江橙屬于高育型；無核紅江橙的絕大多數(shù)花粉粒出現(xiàn)空癟敗育現(xiàn)象。綜合分析推斷，花粉敗育是造成無核紅江橙無核的一個(gè)重要原因，這與唐小浪等［3］的研究結(jié)果是一致的。

胚胎敗育主要表現(xiàn)在雌雄蕊是正常的，但發(fā)生了致死遺傳變異，胚胎退化消失產(chǎn)生無核果實(shí)；或是由于養(yǎng)分和激素的競(jìng)爭(zhēng)，或胚乳退化繼而誘發(fā)胚胎中途敗育最終導(dǎo)致無核。余楊等［14］對(duì)南豐蜜橘無核成因的研究表明，授粉4周后大部分合子胚發(fā)育停滯且出現(xiàn)敗育跡象；授粉8周后部分種子的胚乳開始瓦解，到授粉16周后退化形成癟籽。王平等［15］對(duì)無籽貢柑的無核機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)，胚胎早期發(fā)生中途敗育是造成無核的主要原因。本試驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，無核紅江橙雖屬于低育型，并不能排除極少量花粉與卵細(xì)胞受精發(fā)育成胚胎，這一點(diǎn)在胚胎早期發(fā)育過程觀察中得到印證。在無核紅江橙授粉后1～3周部分胚胎發(fā)育是正常的，可看到球形胚和心形胚時(shí)期。但到授粉后4周，心形胚開始出現(xiàn)敗育；授粉后6周胚乳退化消失；授粉后8周已經(jīng)沒有種子的痕跡，只剩下大量汁囊，最終形成無核果實(shí)。由此表明，胚胎敗育是無核紅江橙無核的另一個(gè)重要原因。目前對(duì)無核紅江橙胚胎敗育機(jī)理尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯 楊賢智）

Study on the seedless mechanism of seedless ‘Hongjiangcheng’

WANG Ping1，2，3，MA Pei-qia1，TANG Xiao-lang1，CHEN Jie-zhong2，WU Wen1，HUANG Yong-jing1，ZHONG Xiu-juan1
（1. Institute of Fruit Tree Research，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510640，China；2. College of Horticulture，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China；3. Hainan Agricultural Reclamation Academy of Sciences，Haikou 570206，China）

The seedless ‘Hongjiangcheng’〔Citrus sinensis（L.） Osbeck〕and seedy ‘Hongjiangcheng’ were used as materials of the experiment in the study. Their pollen viability and germinating viability，embryo sac fertility and embryonic development were studied. The results showed that，compared with the seedy ‘Hongjiangcheng’，the pollen sterility of seedless ‘Hongjiangcheng’ happened，the pollen viability and germinating viability significantly declined and rate of malformation significantly rised at the same time. The pollen viability and germinating viability of seedless ‘Hongjiangcheng’ belonged to the type of low development. The embryo sac of seedless ‘Hongjiangcheng’could fertilize normally. Mature embryo sac had one egg，two synergids，three antipodal cells and a big central cell which contained two polar nuclei. The embryonic development of seedless ‘Hongjiangcheng’ happened according to the study of a few different periods. The most embryos began to degenerate at the four weeks after pollination. The endosperms disappeared with development and maturity of cells in the six weeks after pollination. And in the seven weeks after pollination，the most embryos and endosperms disappeared and seedless fruits produced in the end. The degeneration of pollen and embryos was the mainly seedless reason for seedless ‘Hongjiangcheng’development compared with seedy ‘Hongjiangcheng’.

seedless ‘Hongjiangcheng’；pollen fertility；mature embryo sac；embryonic development

S666.4

A

1004-874X（2016）10-0064-05

2016-06-19

國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（nyhyzx07-023）

王平（1981-），男，碩士，農(nóng)藝師，E-mail：wping6419@163.com

陳杰忠（1958-），男，碩士，教授，E-mail：cjzlxb@scau.edu.cn

王平，馬培恰，唐小浪，等. 無核紅江橙的無核成因探討［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（10）：64-68.