婦科千金片對(duì)盆腔炎大鼠TLR2/4-NF-κB信號(hào)通路影響的研究

袁建菱，李萍，文琦琪，劉麗，陳小麗，王艷

(湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南長(zhǎng)沙410208)

婦科千金片對(duì)盆腔炎大鼠TLR2/4-NF-κB信號(hào)通路影響的研究

袁建菱，李萍，文琦琪，劉麗，陳小麗，王艷

(湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南長(zhǎng)沙410208)

目的觀察婦科千金片對(duì)盆腔炎大鼠子宮Toll樣受體2（TLR2）、Toll樣受體4（TLR4）、核轉(zhuǎn)錄因子kappaB（NF-κB）mRNA表達(dá)的影響,探討婦科千金片調(diào)控TLR2/4-NF-κB信號(hào)通路對(duì)盆腔炎大鼠的抗炎機(jī)制。方法通過(guò)子宮注射混合菌液建立盆腔炎大鼠模型，將60只雌性SD大鼠隨機(jī)分為5組,每組12只,即:空白組、假手術(shù)組、模型組、婦科千金片組、羅紅霉素組，分別予以相應(yīng)藥物干預(yù)，運(yùn)用免疫組化檢測(cè)子宮組織中TLR2、TLR4、NF-κB的灰度值；運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)子宮組織中TLR2、TLR4、NF-κB的mRNA表達(dá)變化。結(jié)果與空白組、假手術(shù)組比較，模型組的TLR2、TLR4、NF-κB灰度值顯著降低（P＜0.01），TLR2、TLR4、NF-κBmRNA的表達(dá)均顯著升高（P＜0.01），表明模型成功；與模型組比較，婦科千金片組、羅紅霉素組TLR2、TLR4、NF-κB灰度值均顯著升高（P＜0.01），TLR2、TLR4、NF-κBmRNA均顯著降低（P＜0.01）。結(jié)論婦科千金片對(duì)盆腔炎大鼠抗炎的作用機(jī)制，可能是通過(guò)調(diào)控TLR2/4-NF-κB炎性介質(zhì)變化信號(hào)通路的傳導(dǎo)而實(shí)現(xiàn)的。

婦科千金片；盆腔炎；Toll樣受體2；Toll樣受體4；核轉(zhuǎn)錄因子kappaB

婦科千金片是國(guó)家中藥保護(hù)品種，由千斤拔、金櫻根、穿心蓮、單面針、十大功勞、雞血藤、當(dāng)歸、黨參組成，具有清熱祛濕、補(bǔ)血益氣的功效。近10年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)婦科千金片具有抑菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、補(bǔ)益氣血、提高免疫力等作用。研究表明：婦科千金片對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌和白色念珠菌均有抑菌作用，對(duì)環(huán)磷酰胺所致免疫低下的小鼠，具有增加血清溶血抗體、提高細(xì)胞吞噬百分率和吞噬指數(shù)的作用[1]。本課題組前期研究顯示：婦科千金片能提高機(jī)體免疫能力，調(diào)節(jié)炎癥機(jī)體血清中細(xì)胞因子，促進(jìn)Ig分子生成[2]，調(diào)節(jié)盆腔組織中炎性因子的表達(dá)，抑制核轉(zhuǎn)錄因子kappaB（NF-κB）所引起的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，減輕機(jī)體組織炎癥損傷[3]。

TLR2、TLR4在炎癥反應(yīng)中起著重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，可通過(guò)TLR受體信號(hào)通路調(diào)控炎癥免疫反應(yīng)，從而達(dá)到調(diào)節(jié)炎癥的目的[4]。由此可以提出以下假說(shuō)：婦科千金片抑制TLR基因表達(dá)可以作為抗炎免疫的靶點(diǎn)，其機(jī)制是通過(guò)TLR2/4-NF-κB-信號(hào)通路調(diào)控炎性介質(zhì)變化。

本研究在課題組以往臨床、動(dòng)物研究工作的基礎(chǔ)上采用婦科千金片，以盆腔炎模型大鼠為受試對(duì)象，運(yùn)用免疫組化和熒光定量PCR技術(shù)，從細(xì)胞和分子水平探討婦科千金片對(duì)盆腔炎大鼠抗炎的作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1　材料

1.1動(dòng)物

SPF級(jí)成年雌性Sprague Dawley大鼠60只,體質(zhì)量200～220 g,由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,許可證號(hào):SYXK2013(湘)-0005。

1.2試劑與藥物

PBS、BSA、SABC、DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物工程有限公司）；TLR2、TLR4、NF-κB抗體（Proteintech公司），DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物公司）；引物（南京金斯瑞公司）；TLR2、TLR4、NF-κB總RNA提取試劑盒（Invitrogen公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（vazyme公司）；PCR試劑盒（Fermentas公司）；婦科千金片：批號(hào)：201412054（株洲千金藥業(yè)有限公司）；羅紅霉素分散片：150 mg/片，批號(hào)：1502121（江蘇神龍藥業(yè)有限公司）。

1.3主要儀器

TGL16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南長(zhǎng)沙市科威實(shí)業(yè)有限公司）；MIASE圖像分析系統(tǒng)（北航公司）；紫外分光光度計(jì)（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）；480型DNA熱循環(huán)儀（Perkin Elmer公司）；DYCP-31C型電泳儀（北京六一儀器）；7500熒光定量PCR儀（ApplidBiosystems公司）。

2　方法

2.1動(dòng)物分組

將60只雌性SD大鼠,按照隨機(jī)數(shù)字表分為5組,即:空白組、假手術(shù)組、模型組、婦科千金片組、羅紅霉素組（西藥對(duì)照組)，每組12只。

2.2造模方法[5]

除空白組與假手術(shù)組外，將實(shí)驗(yàn)大鼠分別稱質(zhì)量，腹部常規(guī)消毒，用10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，腹部分別用碘伏和75%酒精消毒，下腹部正中切口約2 cm，暴露子宮，用1 mL注射器針頭在子宮分叉處分別向左右兩側(cè)子宮向卵巢方向緩慢注入0.2 mL含3×109個(gè)/mL的混合菌液，注畢，分層縫合傷口，消毒術(shù)區(qū)。大鼠造模術(shù)后第4天隨機(jī)分為婦科千金片組、羅紅霉素組。按大鼠與人等效劑量換算方法計(jì)算出各大鼠給藥劑量：婦科千金片組1.89 g/kg；羅紅霉素組：羅紅霉素82.74 mg/kg。各藥均配成10 mL/kg給藥溶液，每天定時(shí)經(jīng)口灌胃給藥治療，每日1次,連續(xù)21 d。假手術(shù)組，手術(shù)操作同上，朝卵巢方向注射等量0.9%生理鹽水，空白組不予任何處理。模型成功標(biāo)準(zhǔn)：采用HE染色,光鏡下觀察子宮組織病理改變情況,以確定造模是否成功。

2.3取材方法

大鼠給藥治療結(jié)束后的第2天清晨禁食，10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉。剖開(kāi)腹腔后,取雙側(cè)子宮，一側(cè)組織于10%中性甲醛固定于4℃保存，用于免疫組化檢測(cè)；一側(cè)組織放置于凍存管中，標(biāo)號(hào)后存于-80℃冰箱中，用于Real-time PCR檢測(cè)。

2.4檢測(cè)方法

2.4.1免疫組化圖像采集與分析把所截取的子宮進(jìn)行石蠟包埋，制成厚約5μm的切片。操作應(yīng)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟實(shí)施：（1）切片常規(guī)脫蠟至水化（步驟:每15 min用純二甲苯清洗1次，共清洗2次；100%、95%、80%梯度酒精水化各5 min；自來(lái)水清洗5 min；每隔5 min蒸餾水清洗1次，共2次）；（2）將1份30%H2O2和10份蒸餾水倒入一起，室溫下靜置10 min，以滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗3次。熱修復(fù)抗原：把切片放入0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（PH6.0）后，用微波爐加熱至沸騰3次，每次間隔5 min。冷卻后PBS（PH7.2）洗滌2次；（3）加入5%的BSA封閉液，室溫20 min。甩去多余液體，不洗；（4）滴加適當(dāng)稀釋一抗大鼠TLR2、TLR4、NF-κB單克隆抗體（1∶100），37℃1 h。PBS（PH7.2）洗2分鐘×3次；（5）滴加適量生物素化山羊抗兔IgG，37℃溫箱20 min。PBS（PH7.2）洗2 min×3次；（6）滴加試劑SABC，37℃20 min。PBS（PH7.2）洗5 min×4次；（7）DAB顯色:使用DAB顯色試劑盒。取試劑盒中A、B、C試劑各1滴,加入到1 mL蒸餾水中,搖勻后滴在切片上。

免疫組化圖像分析所有圖像均采用MIAPS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，用陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量表示灰度值，再以灰度值來(lái)表示抗原的表達(dá)量。每個(gè)切片重復(fù)測(cè)量3次，然后取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2.4.2Real-time PCR法檢測(cè)大鼠子宮組織TLR2、TLR4、NF-κBmRNA表達(dá)Trizol提取細(xì)胞總RNA，操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)執(zhí)行，RNA純度運(yùn)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定。引物在NCBI上搜索目的基因的序列，經(jīng)Blast進(jìn)行同源性分析，分析結(jié)果顯示引物特異性好，無(wú)明顯非特異性擴(kuò)增。本實(shí)驗(yàn)用β-action作為內(nèi)參照。（該引物及內(nèi)參照β-action引物均委托南京金斯瑞合成，運(yùn)用primer5.0軟件設(shè)計(jì)）。NF-κB-F：GCTCACGTACATCTCAGAGGGTTGG，NF-κB-R：TCCTCATTCTCATCGGCTGCTTTT，產(chǎn)物長(zhǎng)度：138 bp；TLR4-F：CATTGCTGCCAACATCATCC，TLR4-R：CCAGAGCGGCTACTCAGAAACT，產(chǎn)物長(zhǎng)度：144bp；TLR2-F：TTCTCAATGGGTTCCAGCAAA，TLR2-R：ACGCAGTGAGTGGTGCAAGTAT，產(chǎn)物長(zhǎng)度：102 bp；β-action-F：GAACGGGAAGCTGGTCATCAA，β-action-R：TGATGACCCTTTTGGCTCCG，產(chǎn)物長(zhǎng)度：174 bp。PCR反應(yīng)條件為：95℃10 min；95℃10 s，59℃50 s，讀板，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線60~95℃，結(jié)束反應(yīng)。PCR儀器自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線。

選擇數(shù)據(jù)分析方式：本檢測(cè)采用相對(duì)定量法檢驗(yàn)基因的表達(dá)變化。本實(shí)驗(yàn)中目的基因與內(nèi)參的擴(kuò)增效率基本一致，故應(yīng)用△△CT法進(jìn)行相對(duì)定量分析。比較5組子宮中TLR2、TLR4、NF-κBmRNA的表達(dá)量,以空白組子宮中TLR2、TLR4、NF-κBmRNA的表達(dá)量作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。按照下列公式計(jì)算各組樣本中TLR2、TLR4、NF-κBmRNA的相對(duì)表達(dá)量[6]。2-△△CT表示的是實(shí)驗(yàn)組目的基因的表達(dá)相對(duì)于空白組的變化倍數(shù)，△△CT=（目的基因CT值-內(nèi)對(duì)照基因CT值）實(shí)驗(yàn)組-（目的基因CT值-內(nèi)對(duì)照基因CT值）對(duì)照組，目的基因的相對(duì)含量=2-△△CT。

2.5統(tǒng)計(jì)方法

所有數(shù)據(jù)均輸入計(jì)算機(jī)，用SPSS 17.0軟件進(jìn)行處理。各檢測(cè)指標(biāo)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均以“±s”表示，組間兩兩比較若方差齊時(shí)選擇LSD法，方差不齊時(shí)選擇Tamhane法進(jìn)行方差分析。

3　結(jié)果

3.1動(dòng)物死亡情況

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，共有8只大鼠死亡，其中3只死于麻醉意外，2只死于術(shù)后感染，3只在干預(yù)治療過(guò)程中不明原因猝死。（空白組死亡1只，假手術(shù)組2只，模型組死亡2只，婦科千金片組2只，羅紅霉素組1只)。

3.2婦科千金片對(duì)盆腔炎大鼠子宮TLR2、TLR4、NF-κB抗原活性的影響

與空白組、假手術(shù)組比較，模型組TLR2、TLR4、NF-κB灰度值均顯著降低（P＜0.01），與模型組比較，婦科千金片組、羅紅霉素組TLR2、TLR4、NF-κB灰度值均顯著升高（P＜0.01），表明婦科千金片、羅紅霉素均對(duì)盆腔炎大鼠具有一定的治療作用；且婦科千金片組與羅紅霉素組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），顯示婦科千金片、羅紅霉素對(duì)盆腔炎的療效相當(dāng)。見(jiàn)圖1-3、表1。

圖1　各組免疫組化TLR2表達(dá)光鏡圖（×200倍）

圖2　各組免疫組化TLR4表達(dá)光鏡圖（×200倍）

圖3　各組免疫組化NF-κB表達(dá)光鏡圖（×200倍）

3.3婦科千金片對(duì)盆腔炎大鼠子宮TLR2、TLR4、NF-κBmRNA表達(dá)的影響

與空白組、假手術(shù)組比較，模型組TLR2、TLR4、NF-κBmRNA的表達(dá)均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，婦科千金片組、羅紅霉素組TLR2、TLR4、NF-κBmRNA均顯著降低（P＜0.01），表明婦科千金片、羅紅霉素治療藥物均對(duì)盆腔炎大鼠子宮的TLR2、TLR4、NF-κBmRNA表達(dá)具有一定下調(diào)作用；且婦科千金片組與羅紅霉素組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），顯示婦科千金片、羅紅霉素對(duì)盆腔炎的療效相當(dāng)。見(jiàn)表2。

表1　各組大鼠子宮TLR2、TLR4、NF-κB表達(dá)的灰度值比較（±s）

表1　各組大鼠子宮TLR2、TLR4、NF-κB表達(dá)的灰度值比較（±s）

注：與空白組比較，#P＜0.05,##P＜0.01；與假手術(shù)組比較，▲P＜0.05,▲▲P＜0.01；與模型組比較，※※P＜0.01。

組別空白組假手術(shù)組模型組婦科千金組羅紅霉素組F值P值n 11 10 10 10 11 TLR2灰度值179.50±22.15 164.95±9.34 82.21±6.34##▲▲145.27±4.81#▲※※139.53±7.64#▲※※8.59＜0.05 TLR4灰度值162.54±17.47 153.48±7.25 91.27±6.64##▲▲137.74±8.62#▲※※127.59±4.34#▲※※4.43＜0.05 NF-κB灰度值155.62±14.61 147.54±7.71 86.94±5.62##▲▲131.48±11.76#▲※※121.37±4.59#▲※※5.57＜0.05

表2　各組大鼠子宮TLR2、TLR4、NF-κBmRNA表達(dá)的比較（±s）

表2　各組大鼠子宮TLR2、TLR4、NF-κBmRNA表達(dá)的比較（±s）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與假手術(shù)組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，※※P＜0.01。

組別空白組假手術(shù)組模型組婦科千金組羅紅霉素組F值P值n 11 10 10 10 11 TLR2mRNA 1.45±0.67 1.67±0.326 3.86±0.43##▲▲2.25±0.27##▲▲※※2.43±0.32##▲▲※※31.52＜0.01 TLR4mRNA 1.37±0.24 1.49±0.38 3.64±0.43##▲▲1.93±0.31##▲▲※※1.97±0.27##▲▲※※35.14＜0.01 NF-κBmRNA 1.24±0.23 1.49±0.16 2.98±0.26##▲▲2.21±0.32##▲▲※※2.14±0.29##▲▲※※36.98＜0.01

4　討論

Toll樣受體（TLR）首先在果蠅中發(fā)現(xiàn)。已經(jīng)證實(shí)哺乳動(dòng)物也存在TLR同源域,被命名為T(mén)LR家族。TLR是一組跨膜受體蛋白質(zhì),包括胞外豐富的亮氨酸序列和胞內(nèi)與白介素-1（IL-1）受體信號(hào)域顯著同源的尾狀結(jié)構(gòu)域,稱為T(mén)oll/IL-1同源域。配體與TLR聚合活化后,接頭蛋白髓樣因子(myeloid differentiation factor 88,MyD88)與TLR胞內(nèi)尾狀結(jié)構(gòu)結(jié)合,激活絲裂原激活蛋白激酶和NF-κB通路。這樣,TLR介導(dǎo)的信號(hào)誘導(dǎo)了編碼促炎因子的基因大量表達(dá)。目前為止，人類TLR家族有12名成員已被發(fā)現(xiàn)，其中以表達(dá)TLR4為主，尚有少量的TLR2。研究表明,TLR可能是細(xì)菌感染與炎癥形成的一個(gè)橋梁,TLR在炎癥形成中的信號(hào)通路有條主線：TLRNF-κB信號(hào)通路調(diào)控炎性介質(zhì)變化[4]。

NF-κB作為一種普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，是多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的匯聚點(diǎn)，不僅參與介導(dǎo)了免疫應(yīng)答病毒復(fù)制、細(xì)胞凋亡和增殖的多種基因的表達(dá)，而且在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的基因表達(dá)中起關(guān)鍵作用。已證實(shí)NF-κB可高效誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子(如IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α)、黏附分子(如ICAM1、VCAM1、ELAM1)、趨化因子和急性期反應(yīng)蛋白的基因蛋白的基因表達(dá)，同時(shí)對(duì)參與炎癥級(jí)聯(lián)瀑布效應(yīng)的多種酶的基因表達(dá)具有重要的調(diào)控作用[7]。

有研究[8-9]取三七提取物(含三七總皂苷和三七氨酸)進(jìn)行治療用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及消化性鏈球菌的混合菌液復(fù)制出恒河猴子宮內(nèi)膜炎出血模型，發(fā)現(xiàn)三七復(fù)合有效成分可以抑制：阻斷NF-κB的信號(hào)通路，降低TNF-αmRNA的表達(dá)，抑制炎性細(xì)胞因子TNF-α的生成。丁青[10-11]等用三七復(fù)合成分治療子宮內(nèi)膜炎患者，發(fā)現(xiàn)三七復(fù)合成分可以調(diào)節(jié)MMP-1和TIMP-1系統(tǒng)的平衡；有效降低炎癥因子TNF-α、IL-1β的含量，降低NF-κB p65的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)量，抑制NF-κB p65的核因子DNA結(jié)合活性。從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞炎癥的修復(fù)，三七復(fù)合有效成分能促使炎癥細(xì)胞轉(zhuǎn)歸，有效保護(hù)細(xì)菌脂多糖對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的損傷，有長(zhǎng)效持續(xù)性保護(hù)細(xì)胞形態(tài)完整性功能。本課題組前期已研究證實(shí)，婦科千金片能改善盆腔炎大鼠盆腔組織的炎癥病變，有保護(hù)盆腔組織作用[12-13]，減少細(xì)胞凋亡，降解細(xì)胞外基質(zhì)抑制炎癥反應(yīng)[14]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化檢測(cè)證實(shí)婦科千金片能使盆腔炎大鼠子宮的TLR2、TLR4、NF-κB的灰度值顯著升高，灰度值的高低與蛋白表達(dá)的強(qiáng)弱成反比關(guān)系，表明盆腔炎模型大鼠子宮的TLR2、TLR4、NF-κB表達(dá)水平顯著降低。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，婦科千金片對(duì)盆腔炎大鼠模型的干預(yù)，使TLR2/4-NF-κB信號(hào)通路中TLR2、TLR4、NF-κBmRNA表達(dá)明顯下降，抑制了因NF-κB激活而產(chǎn)生的一系列炎癥反應(yīng)，從而表明婦科千金片對(duì)盆腔炎大鼠抗炎的作用，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控TLR2/4-NF-κB炎性介質(zhì)變化信號(hào)通路的傳導(dǎo)而實(shí)現(xiàn)的。

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（本文編輯 楊瑛）

Effect of Fuke Qianjin Tablets on TLR2/4-NF-κB Signaling Pathway in Pelvic Inflammatory Model Rats

YUAN Jianling,LI Ping,WEN Qiqi,LIU Li,CHEN Xiaoli,WANG Yan
(Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

Objective To observe the effect of Fuke Qianjin tablets on the expression of TLR2,TLR4,NF-κB in pelvic inflammatory model rats,and to investigate its anti-inflammatory mechanism of TLR2/4-NF-κB signaling pathway on the pelvic inflammatory rats.Methods The 60 female SD rats were injected with the mixture of the uterus to establish the model of the rats with pelvic inflammatory disease.Then the rats were randomly divided into 5 groups,12 rats in each group,namely:blank group,sham operation group,model group,Fuke Qianjin tablets group,roxithromycin group,which were given corresponding drug intervention.The gray values of TLR2,TLR4,NF-κB were detected by immunohistochemistry, and the expression of TLR2，TLR4,NF-κB mRNA of uterus was detected by real-time fluorescence quantitative PCR.Results Compared with the blank group,sham operation group,the gray values of TLR2,TLR4 and NF-κB in model group were decreased significantly(P＜0.01),the expression of TLR2,TLR4 and NF-κB mRNA were significantly increased(P＜0.01).Compared with the model group,the gray values of TLR2,TLR4 and NF-κB in Fuke Qianjin tablets group and roxithromycin group were significantly increased(P＜0.01),the TLR2,TLR4 and NF-κB mRNA were significantly lower(P＜0.01).Conclusion Mechanism of anti-inflammation of Fukeqianjin tablets on pelvic inflammatory model rats may be through the regulation of TLR2/4-NF-κB inflammatory medium signaling pathway.

Fukeqianjin tablets;pelvic inflammatory disease;TLR2;TLR4;NF-κB

R285.5；R271

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2016.11.004

2015-11-30

湖南省科技廳資助項(xiàng)目（2014SK3005）。

袁建菱，女，碩士，講師，主要從事中藥新藥的研究與開(kāi)發(fā)，E-mail：jly888666@163.com。