不同灸法對免疫抑制兔脾臟指數(shù)及細胞因子的影響

單增天，田岳鳳*，李雷勇，吳愛花，王軍

（1.山西中醫(yī)學院針灸推拿學院，山西太原030619；2.山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院，山西太原030001）

·針灸推拿·

不同灸法對免疫抑制兔脾臟指數(shù)及細胞因子的影響

單增天1，田岳鳳1*，李雷勇2，吳愛花1，王軍1

（1.山西中醫(yī)學院針灸推拿學院，山西太原030619；2.山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院，山西太原030001）

目的觀察不同灸法對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制兔脾臟指數(shù)及細胞因子IFN-γ、IL-2及IL-4的影響。方法將大耳白兔50只隨機分為空白組、模型組、隔藥餅灸組、艾灸組和假藥餅灸組5組。除空白組外，其余4組均腹腔注射環(huán)磷酰胺60 mg/kg，造成免疫抑制模型。3個治療組分別給予隔藥餅灸、艾灸、假藥餅灸治療，隔日灸，共灸10次。治療結(jié)束次日動物麻醉，取動物脾臟計算其脾臟指數(shù)，采用ELISA法測定勻漿上清液中IFN-γ、IL-2、IL-4含量。結(jié)果環(huán)磷酰胺造模后，脾臟指數(shù)與空白組比較顯著升高，差異具有顯著的統(tǒng)計學意義（P＜0.01），3個治療組脾臟指數(shù)與模型組比較差異均有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01），與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與空白組比較，艾灸組IFN-γ、IL-4明顯降低，模型組、假藥餅組IL-4明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，艾灸組IFN-γ明顯降低，隔藥餅灸組IL-4顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論不同灸法對免疫抑制兔脾臟指數(shù)均有調(diào)節(jié)作用；隔藥餅灸可使因環(huán)磷酰胺所致下降的IL-4顯著提升。

環(huán)磷酰胺；隔藥餅灸；艾灸；脾臟指數(shù)；細胞因子

艾灸防病治病在我國已有數(shù)千年歷史，現(xiàn)代實驗研究證實艾灸有提高機體免疫功能的作用，可改善機體的免疫抑制狀態(tài)。隔藥餅灸是將藥物、艾灸、穴位三者有機結(jié)合作用于機體，本文從這一角度研究隔藥餅灸對免疫抑制兔機體脾臟指數(shù)及細胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4的影響，并與艾灸組及假藥餅組相比較,為艾灸提高機體免疫力提供明確的實驗依據(jù)，同時促進臨床艾灸的發(fā)展和進步。

1　材料

1.1實驗動物

大耳白兔50只，北京昌揚西山養(yǎng)殖場提供（動物許可證號：SCXK（京）2011-0010），體質(zhì)量（2.5± 0.3）kg，雌雄不限。飼養(yǎng)溫度：20～25℃，濕度：50%～70%。

1.2主要藥物、試劑和儀器

清艾條：江蘇盱眙華佗中藥廠（批號：Z32020153）；注射用環(huán)磷酰胺（CTX）：200 mg/瓶，山西普德藥業(yè)股份有限公司（批號:H14023686）；0.9%NaCl注射液500 mL：石家莊四藥有限公司；酶聯(lián)免疫試劑盒：上海酶聯(lián)生物科技有限公司；勻漿機：美國PRO科學股份有限公司；離心機：長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機儀器有限公司。

2　方法

2.1實驗方法

2.1.1動物造模將50只大耳白兔隨機分為5組，每組10只，分別為空白組、模型組、隔藥餅灸組、艾灸組和假藥餅灸組。動物適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，模型組、隔藥餅灸組、艾灸組和假藥餅灸組均腹腔注射環(huán)磷酰胺60 mg/kg（環(huán)磷酰胺用0.9%NaCl注射液稀釋），連續(xù)7 d，每天上午造模，造成免疫抑制模型，空白組注射等量0.9%NaCl注射液。

2.1.2穴位選擇神闕、關(guān)元、足三里（雙）、脾俞（雙）、腎俞（雙）。穴位定位參照林文注主編《實驗針

灸學》［1］常用動物穴位定位法及擬人比照法。

2.1.3藥物制作按六味地黃丸組方劑量將熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮、茯苓粉碎，過120目篩備用，用75%酒精將藥物粉末調(diào)勻用模具制作藥餅，直徑1 cm、厚0.3 cm；假藥餅原料采用面粉，制作方法與藥餅相同。

2.1.4施灸方法施灸前將動物穴位處皮毛剪去，將其固定于兔臺。將清艾條折斷，取出艾絨，制成大小相等，底徑0.8 cm、高0.5 cm的圓錐形艾柱，置于藥餅和假藥餅上，以線香點燃，燃盡更換，每穴連灸3壯，隔日灸，共灸10次；將3壯艾柱量的艾絨制作成小艾條，置于自制艾灸架在穴位施灸。隔日灸，共灸10次。

2.2樣品采集及處理

治療結(jié)束次日，耳緣靜脈麻醉，解剖取出脾臟，稱取脾臟質(zhì)量。取中段脾臟0.5 g左右放入試管，剪碎，按照每克組織加入9 mL PBS溶解，放入勻漿機中勻漿，離心20 min，2 500 r/min，收集上清液備用。

2.3指標觀察

脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量（g）/兔子體質(zhì)量（kg）×10。

采用ELISA法檢測脾臟勻漿上清液中IFN-γ、IL-2、IL-4的含量。

2.4數(shù)據(jù)處理

全部數(shù)據(jù)由統(tǒng)計人員采用SAS8.2統(tǒng)計軟件進行專業(yè)分析。實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)“±s”表示，采用單因素方差分析（one way-ANOVA）并進行組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3　結(jié)果

3.1不同灸法對脾臟指數(shù)的影響

與空白組比較，模型組脾臟指數(shù)顯著升高，差異具有顯著的統(tǒng)計學意義（P＜0.01），隔藥餅組、艾灸組和假藥餅組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，空白組、隔藥餅組、艾灸組和假藥餅組差異有顯著統(tǒng)計學意義（P﹤0.01）。說明不同灸法對脾臟指數(shù)的改變均有調(diào)節(jié)作用。見表1。

表1　不同灸法對免疫抑制兔脾臟指數(shù)的影響（±s,mg/g）

表1　不同灸法對免疫抑制兔脾臟指數(shù)的影響（±s,mg/g）

注：與空白組比較◆◆P﹤0.01；與模型組比較**P﹤0.01。

組別空白組模型組隔藥餅組艾灸組假藥餅組F值P值n 10 10 10 10 10脾臟指數(shù)4.13±1.10** 5.60±1.50◆◆3.79±1.04** 3.74±1.06** 3.59±1.04** 5.03﹤0.01

3.2不同灸法對細胞因子的影響

與空白組比較，艾灸組IFN-γ、IL-4明顯降低，模型組、假藥餅組IL-4明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；IL-2差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。與模型組比較，隔藥餅灸組IL-4顯著升高，艾灸組IFN-γ降低明顯，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。表明隔藥餅灸對免疫因子IL-4的良性調(diào)整作用。見表2。

表2　不同灸法對免疫抑制兔IFN-γ、IL-2、IL-4的影響（±s,mg/L）

表2　不同灸法對免疫抑制兔IFN-γ、IL-2、IL-4的影響（±s,mg/L）

注：與空白組比較◆P﹤0.05；與模型組比較*P﹤0.05。

組別空白組模型組隔藥餅組艾灸組假藥餅組F值P值n 10 10 10 10 10 IFN-γ 1 092.95±231.61* 874.20±79.32 986.75±134.11 800.45±303.81◆* 990.50±161.61 3.28﹤0.05 IL-2 5.93±1.12 4.93±0.70 5.22±0.63 5.30±1.39 5.66±0.74 1.65﹥0.05 IL-4 121.61±18.88* 105.21±14.30◆120.95±11.91* 103.16±13.67◆105.66±17.65◆3.48﹤0.05

4　討論

脾臟是機體最大的免疫器官，占全身淋巴組織總量的25%，含有大量的B淋巴細胞、T淋巴細胞和巨噬細胞，是免疫細胞居住和產(chǎn)生應(yīng)答的重要產(chǎn)所。脾臟還具有合成和分泌細胞因子、補體等作用，因此脾臟指數(shù)的高低能夠較為客觀地反應(yīng)機體的免疫能力。細胞因子主要由免疫細胞合成、分泌的一類具有廣泛生物學活性的小分子蛋白質(zhì)。白細胞介素、干擾素是重要的細胞因子，主要參與機體免疫應(yīng)答、免疫細胞分化發(fā)育等。INF-γ即Ⅱ型干擾素，主要由活化的T細胞和NK細胞產(chǎn)生，具有廣泛的生物學活性。IFN-γ具有激活巨噬細胞并促進其功能和激活中性粒細胞功能和NK細胞殺傷力等作用。IL-2主要由CD4+和CD8+T細胞產(chǎn)生，NK細胞和轉(zhuǎn)化的B細胞亦可產(chǎn)生。IL-2具有多種生物學作用，最早被稱為T細胞生長因子，是引起T細胞增殖的主要細胞因子；IL-2還可刺激NK細胞的生長和增強他們的殺傷能力，并激發(fā)B細胞生長及產(chǎn)生抗體；IL-2在體內(nèi)是參與免疫應(yīng)答的重要細胞因子，并參與炎癥反應(yīng)。IL-4主要由Th2細胞產(chǎn)生，可刺激活化B細胞和T細胞增殖、CD4+T細胞分化成II型輔助T細胞，它也在調(diào)節(jié)體液免疫和適應(yīng)性免疫中起關(guān)鍵作用，誘導B細胞抗體類別轉(zhuǎn)換向IgE，上調(diào)第二型主要組織兼容性復合體的產(chǎn)生。在機體免疫調(diào)節(jié)方面，INF-γ、IL-2、IL-4起著重要的生物學作用。

有實驗研究表明，環(huán)磷酰胺能夠造成脾臟和胸腺明顯萎縮，進而降低脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，還可以降低IL-2、IL-4、TNF-α和INF-γ等細胞因子，使機體體液免疫和細胞免疫功能下降[2]。但也有實驗研究表明，環(huán)磷酰胺可使脾臟指數(shù)顯著升高，并抑制正常小鼠DTH程度、NK細胞活性及細胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ分泌水平[3]。環(huán)磷酰胺的免疫抑制作用，隨著時間的推移，其免疫抑制作用慢慢消失，脾臟指數(shù)出現(xiàn)代償性增高[4-5]。本實驗研究中，環(huán)磷酰胺造模結(jié)束后，脾臟代償性增大，模型組脾臟指數(shù)明顯高于空白組，隔藥餅組、艾灸組和假藥餅組脾臟指數(shù)降低明顯，接近空白組，表明三種治療方法均可拮抗環(huán)磷酰胺免疫抑制作用，減少環(huán)磷酰胺的毒性作用，使脾臟指數(shù)在較短的時間內(nèi)恢復到正常水平。

神闕穴可溫通陽氣、回陽救逆，關(guān)元穴為元陰元陽之氣閉藏之門戶，灸關(guān)元可壯元陽、補腎精、益骨髓；足陽明胃經(jīng)之合穴為足三里，根據(jù)《內(nèi)經(jīng)》“合治內(nèi)腑”的理論，凡六腑之病皆可用之，具有調(diào)理脾胃、補中益氣、通經(jīng)活絡(luò)、扶正祛邪的作用；脾俞、腎俞為均為背俞穴，是脾臟和腎臟氣血匯聚之地，長灸之可健脾益氣、滋陰補腎。實驗研究表明，艾灸腎俞、足三里等穴可以提高環(huán)磷酰胺導致的小鼠免疫功能損傷和脾臟指數(shù)降低，對小鼠脾臟起到修復和保護作用[6]。艾灸肝俞、脾俞、腎俞能增強脾淋巴細胞增殖轉(zhuǎn)化能力、增加血清IL-2和TNF-α含量，改善機體免疫功能[7]。實驗觀察表明，灸腎俞穴能提高正常及免疫功能低下小鼠胸腺、脾臟指數(shù)及IL-1、IL-2的含量，增強和調(diào)節(jié)免疫功能的作用[8]。逆針灸關(guān)元可調(diào)節(jié)脾臟組織細胞HSP 70及其基因的表達，調(diào)節(jié)血清免疫因子IL-2、TNF-α的含量，對調(diào)整更年期免疫功能紊亂具有一定作用[9]。

六味地黃丸為滋補腎陰的經(jīng)典名方，能促進胸腺細胞增殖及抑制脾細胞凋亡，提高機體的免疫功能[10]。六味地黃湯能多途徑增強氫化可的松所致免疫功能低下小鼠免疫功能[11]，對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠脾細胞IFN-γ、IL-4和IL-10mRNA的表達具有明顯促進作用，對IL-2mRNA的表達具有顯著抑制作用，對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠脾臟表達的細胞因子水平有調(diào)節(jié)作用，發(fā)揮糾正機體平衡紊亂的作用[12]，并可抑制燙傷后大鼠腹腔巨噬細胞TN F分泌和降低血清IL-6水平，對燙傷引起的大鼠腹腔巨噬細胞吞噬活性、脾臟淋巴細胞轉(zhuǎn)化增殖、分泌IL-2、NK細胞活性抑制有不同程度的拮抗作用，從而調(diào)節(jié)機體免疫功能[13]。

隔藥餅灸是臨床常用灸法之一，是將中藥與艾灸有機結(jié)合的一種方法，具有艾灸、藥物、腧穴三重效應(yīng)，通過艾灸的溫熱作用促進皮膚對滋陰補腎藥物的吸收，經(jīng)經(jīng)絡(luò)傳輸從而發(fā)揮藥物歸經(jīng)之效能。我們十余年的臨床研究結(jié)果充分表明隔藥餅灸對機體免疫功能的良好調(diào)節(jié)作用[14-16]。

本實驗結(jié)果表明，造模后IFN-γ含量低于空白組，IL-4含量明顯低于空白組（P＜0.05），表明動物免疫功能受到抑制。隔藥餅灸神闕、關(guān)元、足三里（雙）、脾俞（雙）、腎俞（雙）后，免疫抑制兔脾臟組織中IFN-γ、IL-4含量明顯回升，與空白組比較差異不明顯，免疫抑制兔脾臟指數(shù)恢復到接近正常水平，表明隔藥餅灸可調(diào)節(jié)IFN-γ、IL-4含量，提高免疫抑制兔的免疫功能。艾灸組和假藥餅灸組IL-4含量與模型組比較無明顯差異，與空白組差異顯著，說明艾灸組、假藥餅灸治療效果不佳。然而不同灸法對IL-2含量無明顯影響，同時，艾灸組IFN-γ含量明顯低于模型組，出現(xiàn)這一結(jié)果是否與艾灸量有關(guān)？或是樣本含量不夠大？值得我們在下一步的研究中深入探討。

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（本文編輯 匡靜之）

Influence of Different Moxibustion on Spleen Index and Cytokines in Immunosuppressive Model Rabbits

SHAN Zengtian1,TIAN Yuefeng1*,LI Leiyong2,WU Aihua1,WANG Jun1
(1.Acupuncture and Massage College of Shanxi University of Traditional Chinese Medicine,Shanxi,Taiyuan 0306191,China; 2.The Second Hospital of Shanxi Medical University,Shanxi,Taiyuan 030001,China)

Objective To observe the inhibitory effect of differentmoxibustion methods on rabbit spleen index,the contents of IFN-γ,IL-2 and IL-4 in cyclophosphamide induced immunosuppression model rabbits.Methods The 50 rabbits were randomly divided into five groups,namely black group,model group,herb-cake-separated moxibustion group,moxibustion group,sham-cakeseparated moxibustion group.In addition to the black group,the other four groups were injected with cyclophosphamide 60 mg/kg to make immunosuppressive model.Three treatment groups were respectively given herb-cake-separated moxibustion,moxibustion, sham-cake-separated moxibustion treatment every other day,for 10 times.The next day after finished moxibustion,the animals were anesthetized,the spleen index was detected,the IFN-γ,IL-2,IL-4 in supernatant of spleen homogenate were determined by ELISA.Results Compared with the black group,the spleen index of model group was significantly higher, it was statistically significant(P＜0.01).The spleen index in the three treatment group was statistically significant comparing with the model group(P＜0.01),while the diffrence between the treatment groups and blank group was not statistically significant(P＞0.05).Compared with the blank group,the IFN-γand IL-4 in the moxibustion group were lower significantly, the IL-4 in model group and sham-cake-separated group was reduced,the differences were statistically significant(P＜0.05).Compared with the model group,the content of IFN-γwas decreased in moxibustion group,and the content of IL-4 increased in herb-cake-separated moxibustion group was increased,the differences were statistically significant(P＜0.05).Conclusion Different moxibustion shows a regulating effect on spleen index in immunosuppressive rabbits.The herb-cakeseparated moxibustion could significantly increase the decline content of IL-4 induced by cyclophosphamide.

cyclophosphamide;herb-cake-separated moxibustion;moxibustion;spleen index;cytokines

R245.8

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2016.11.022

2016-06-17

國家自然科學基金面上項目（81373742）。

單增天，男，在讀碩士研究生，研究方向：艾灸防治疾病。

*田岳鳳，女，教授，博士研究生導師，E-mail:tyfsx@163.com。