石斛合劑對胰島素抵抗肝細(xì)胞模型的影響

林心君，鄭遠(yuǎn)燕，張捷平，劉言鳳，施紅

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建福州350122；2.泉州市豐澤區(qū)東海街道社區(qū)醫(yī)院，福建泉州362400）

石斛合劑對胰島素抵抗肝細(xì)胞模型的影響

林心君1，鄭遠(yuǎn)燕2，張捷平1，劉言鳳1，施紅1

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建福州350122；2.泉州市豐澤區(qū)東海街道社區(qū)醫(yī)院，福建泉州362400）

目的初步探討石斛合劑對胰島素抵抗（IR）肝細(xì)胞模型的影響，旨在闡明石斛合劑改善IR的作用及機(jī)制。方法采用實(shí)驗(yàn)篩選的胰島素造模濃度培養(yǎng)LO2細(xì)胞24 h，建立IR肝細(xì)胞模型。以空白血清和石斛合劑含藥血清（濃度由實(shí)驗(yàn)篩選出）干預(yù)正常肝細(xì)胞和IR肝細(xì)胞，葡萄糖氧化酶-過氧化物酶（GLU-GOD）法檢測培養(yǎng)液中殘存葡萄糖水平，計(jì)算胰島素敏感指數(shù)；并檢測加PI3K抑制劑后石斛合劑對IR肝細(xì)胞胰島素敏感指數(shù)的影響。結(jié)果由實(shí)驗(yàn)篩選出的造模胰島素濃度為5×10-5mol／L，石斛合劑含藥血清和空白血清濃度為2.5%；含藥血清模型組胰島素敏感指數(shù)雖低于正常肝細(xì)胞組（P＜0.05），但與IR肝細(xì)胞組比較則顯著提高（P＜0.05）；與IR肝細(xì)胞組比較，加抑制劑后各組細(xì)胞的胰島素敏感指數(shù)均明顯下降（P＜0.05）。結(jié)論中藥復(fù)方石斛合劑可改善IR肝細(xì)胞的胰島素敏感指數(shù)，減輕胰島素抵抗，可能部分通過PI3K信號(hào)途徑起效。

胰島素抵抗肝細(xì)胞；胰島素敏感指數(shù)；石斛合劑

胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是指胰島素作用的靶器官（如肝臟、骨骼肌、脂肪組織）對胰島素作用的敏感性下降的一種病理現(xiàn)象，是糖尿病、肥胖等代謝性疾病的共同土壤［1-2］，因此改善IR的研究具有重要的臨床意義。研究表明：中醫(yī)藥通過多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)發(fā)揮作用，許多單味中藥及復(fù)方制劑都具有降低胰高血糖素、增加葡萄糖攝取和利用、刺激胰島素分泌、調(diào)節(jié)血脂等作用［3-6］。本課題組從1995至今的石斛合劑系列研究證明：具有滋陰益氣活血功效的石斛合劑（現(xiàn)為福建省二人民醫(yī)院院內(nèi)制劑，專利申請?zhí)枺?01110408411.0），不僅可明顯改善患者臨床癥狀，降低糖化血紅蛋白，綜合療效優(yōu)于二甲雙胍、參麥散、玉液湯等，而且還能增加胰島素受體的表達(dá)，促進(jìn)HepG2細(xì)胞的糖代謝［7-10］。本實(shí)驗(yàn)旨在通過建立IR肝細(xì)胞模型，在細(xì)胞水平上觀察該方對高胰島素誘發(fā)IR的影響，以初步探討其改善IR的作用及機(jī)制。

1材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器倒置相差顯微鏡［IX70，日本OLYMPUS公司］；酶標(biāo)儀（ELx800，美國Bio-TEK公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（HF212UV，美國Thermo Forma公司）。

1.2 藥品與試劑中藥復(fù)方石斛合劑（石斛、黃芪、知母、丹參、五味子、葛根等）購自福建中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂；RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清、溴化-（4，5-二甲-2-噻唑基）-2，5-二苯基四氮唑（MTT）購自Genview公司；PI3K抑制劑購自碧云天生物技術(shù)研究所；未提及試劑均購自美國Sigma公司。

1.3 細(xì)胞及動(dòng)物來源人肝細(xì)胞株（LO2）購于上海細(xì)胞所；SPF級(jí)Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量190～230 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，合格證號(hào)：2007000546931。

2方法

2.1 LO2細(xì)胞的培養(yǎng)LO2細(xì)胞用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2環(huán)境培養(yǎng)、傳代。

2.2 石斛合劑含藥血清的制備參照課題組前期研究［10］。

2.3 篩選含藥血清濃度

2.3.1 LO2細(xì)胞存活率取對數(shù)生長期的LO2細(xì)胞，3×103／m L接種于96孔板，待細(xì)胞長至80%，先以不同濃度的含藥血清和空白血清（見表1）孵育12 h、24 h、48 h，再加入5 mg／mL的MTT溶液20 μL，避光培養(yǎng)4 h，棄上清，酶標(biāo)儀測定吸光度（OD），篩選最佳含藥血清濃度。

2.3.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察同樣方法培養(yǎng)LO2細(xì)胞，加入由上述實(shí)驗(yàn)中篩選出的的含藥血清和空白血清濃度，24 h后去上清，PBS洗2遍，10%甲醛固定，Giemsa染色法觀察鏡下細(xì)胞形態(tài)。

2.4 篩選造模胰島素濃度取對數(shù)生長期LO2細(xì)胞，按106／瓶接種于培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞貼壁后去舊培養(yǎng)基，分別加入不含胰島素的全培液（對照組）和不同濃度（5×10-4mol／L、5×10-5mol／L、5×10-6mol／L）的胰島素全培液24 h后，消化，重懸，每組按3× 105／管分裝，離心，去上清，加入含3.5×10-5mol／L胰島素的無酚紅培養(yǎng)液，37℃溫育3 h后取上清，GOD-POD法測定各組（對照組、5×10-6mol／L胰島

素組、5×10-5mol／L胰島素組、5×10-4mol／L胰島素組）的殘存葡萄糖濃度。

2.5 篩選胰島素的刺激濃度同樣方法培養(yǎng)LO2細(xì)胞，按3×105／管分裝15管，離心，去上清，分別加入含7×10-5mol／L、3.5×10-5mol／L、1.75×10-5mol／L、0.875×10-5mol／L、0 mol／L（對照組）胰島素的無酚紅培養(yǎng)液，孵育后，取上清，GOD-POD法測定殘存葡萄糖濃度。

2.6 石斛合劑對IR肝細(xì)胞胰島素敏感性指數(shù)的影響將肝細(xì)胞分6組：正常對照組（正常肝細(xì)胞）為A1組，模型對照組（IR肝細(xì)胞）為B1組，正常肝細(xì)胞+空白血清組為C1組，IR肝細(xì)胞+空白血清組為D1組，正常肝細(xì)胞+含藥血清組為E1組，IR肝細(xì)胞+含藥血清組為F1組。正常肝細(xì)胞相關(guān)組（B1、D1、F1組）予含5×10-5mol／L胰島素的全培液，IR肝細(xì)胞相關(guān)組（A1、C1、E1組）予全培液，孵育24 h后，取上清，C1、D1組加空白血清，E1、F1組加含藥血清，24 h后測定殘存葡萄糖濃度，并計(jì)算胰島素敏感性指數(shù)［11］。

2.7 加PI3K抑制劑（30 nmol／L）后石斛合劑對IR肝細(xì)胞模型島素敏感指數(shù)的影響將肝細(xì)胞分6組：正常對照組（正常肝細(xì)胞）為A2組，模型對照組（IR肝細(xì)胞）為B2組，正常肝細(xì)胞+PI3K抑制劑組為C2組，IR肝細(xì)胞+PI3K抑制劑組為D2組，正常肝細(xì)胞+含藥血清+PI3K抑制劑組為E2組，IR肝細(xì)胞+含藥血清+PI3K抑制劑組為F2組，按上述方法造模、加藥、測定培養(yǎng)液中殘存葡萄糖濃度并計(jì)算胰島素敏感指數(shù)。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用方差分析。

3結(jié)果

3.1 不同濃度含藥血清和空白血清對LO2細(xì)胞存活率的影響見表1。

表1 不同濃度含藥血清和空白血清對LO 2細(xì)胞存活率的影響（x±s）

3.2 2.5%空白血清組及含藥血清組細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察見圖1。由圖1看出2.5%空白血清組及含藥血清組的細(xì)胞胞核、胞質(zhì)、胞膜結(jié)構(gòu)完整、清晰，與正常組比較，細(xì)胞形態(tài)無明顯差異，說明2.5%含藥血清及空白血清無明顯細(xì)胞毒性。

3.3 造模用胰島素濃度篩選見圖2。

3.4 刺激量胰島素濃度篩選見圖3。

3.5 石斛合劑含藥血清對各組細(xì)胞胰島素敏感指數(shù)影響見表2。

表2 石斛合劑含藥血清對各組細(xì)胞胰島素敏感指數(shù)影響（x±s）

3.6 PI3K抑制劑對各組細(xì)胞胰島素敏感指數(shù)影響見表3。

表3 PI3K抑制劑對各組細(xì)胞胰島素敏感指數(shù)影響（x±s）

4討論

4.1 肝細(xì)胞胰島素抵抗模型IR是代謝綜合征的核心表現(xiàn)，關(guān)于IR研究日益被人們所重視，而探索穩(wěn)定而有效的IR細(xì)胞模型成為IR相關(guān)疾病研究的關(guān)鍵問題，也是在細(xì)胞水平上深入研究IR發(fā)生機(jī)制的基礎(chǔ)。目前比較常用的IR細(xì)胞模型有：高葡萄糖誘導(dǎo)培養(yǎng)模型、高胰島素誘導(dǎo)培養(yǎng)模型、高類固醇誘導(dǎo)培養(yǎng)模型等，其中以較穩(wěn)定的高胰島素誘導(dǎo)培養(yǎng)模型的使用最為廣泛［12－13］。肝臟是胰島素發(fā)揮效應(yīng)的重要靶器官，也是胰島素受體分布最密集臟器之一，故本實(shí)驗(yàn)采用LO2肝細(xì)胞株加高胰島素誘導(dǎo)培養(yǎng)法建立IR模型。

本實(shí)驗(yàn)篩選出2.5%（無毒濃度）為含藥血清及空白血清濃度，最小有效濃度5×10-5mol／L為造模用胰島素濃度，與文獻(xiàn)［14］報(bào)道的濃度有別，考慮可能與實(shí)驗(yàn)條件的差異以及選用的肝細(xì)胞株不同有關(guān)。3.5×10-5mol／L及7×10-5mol／L這兩種濃度的胰島素都能增加胰島素抵抗肝細(xì)胞的葡萄糖攝取，選用最小有效刺激濃度3.5×10-5mol／L。實(shí)驗(yàn)中選用最小有效的造模濃度和胰島素刺激濃度，旨在盡可能減少高胰島素對細(xì)胞的毒性。

4.2 石斛合劑對IR肝細(xì)胞模型胰島素敏感指數(shù)的影響糖尿病屬于祖國醫(yī)學(xué)“消渴病”的范疇，是IR的代表性疾病，故醫(yī)家多從“消渴病”的角度認(rèn)識(shí)IR［15］，認(rèn)為其病位主要在肝、脾、腎三臟，以氣、陰、陽虛為本，痰濁、瘀血、熱毒為標(biāo)。石斛合劑具有滋陰清熱、益氣活血的功效。本實(shí)驗(yàn)用石斛合劑含藥血清干預(yù)IR肝細(xì)胞模型，結(jié)果顯示：石斛合劑含藥血清能提高胰島素敏感性指數(shù)，改善IR；加入PI3K抑制劑后石斛合劑改善IR的作用消失，說明PI3K抑制劑能減弱甚至阻斷石斛合劑改善IR的作用，提示石斛合劑可能通過PI3K通路改善IR。此作用是直接作用PI3K通路，還是繼發(fā)效應(yīng)還有待進(jìn)一步深入研究。

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R285.5

A

1000-338X（2016）04-0040-03

2016－05－10

福建省衛(wèi)生廳科技創(chuàng)新項(xiàng)目（2014-CX-29）；福建省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（JA15228）

林心君（1979—），女，講師，博士研究生，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療糖尿病研究。

施紅，女，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail：shihong3327@sina.com