急性力竭運(yùn)動(dòng)對大鼠心肌PKCα、δ和ε表達(dá)的影響*

馬治云

(九江學(xué)院體育學(xué)院， 江西 九江 332005)

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急性力竭運(yùn)動(dòng)對大鼠心肌PKCα、δ和ε表達(dá)的影響*

馬治云△

(九江學(xué)院體育學(xué)院， 江西 九江 332005)

目的：檢測分析急性力竭運(yùn)動(dòng)對大鼠心肌蛋白激酶C (PKC)α、δ和ε亞型總蛋白及其磷酸化蛋白表達(dá)的影響。方法：健康雄性SD大鼠50只，隨機(jī)分為對照組(C組)和急性力竭運(yùn)動(dòng)組(AEE組)(n=25)，采用一次力竭跑臺運(yùn)動(dòng)建立急性力竭運(yùn)動(dòng)模型，Western blot法檢測PKCα、δ和ε總蛋白及其磷酸化蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：與C組比較，AEE組大鼠心肌PKCα、p-PKCαSer-657、 PKCδ、p-PKCδThr-507及PKCε水平均顯著升高(P<0.05)。結(jié)論：急性力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致PKCα、PKCδ、PKCε表達(dá)水平和PKCα、PKCδ活化水平上調(diào)，可能是急性力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致大鼠心肌損傷的重要因素，三亞型之間的交互作用可能是更重要的因素。

急性力竭運(yùn)動(dòng)；心肌；PKCα；PKCδ；PKCε；大鼠

acute exhaustive exercise(AEE); myocardium; PKCα; PKCδ; PKCε; rats

【DOI】 10.13459/j.cnki.cjap.2016.04.012

研究表明，急性力竭運(yùn)動(dòng)可造成心肌相對或絕對缺血，運(yùn)動(dòng)停止后血流再灌注，導(dǎo)致心肌發(fā)生缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷。本課題組在這方面的研究同樣發(fā)現(xiàn)急性力竭運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致心肌損傷[1]。心肌I/R損傷涉及復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中心肌細(xì)胞中蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)是一類關(guān)鍵的信號分子。PKC亞型多達(dá)13種，目前研究的焦點(diǎn)集中在α、δ和ε三亞型上，三者之間可能存在交互作用(cross-talk)[2]。PKC亞型需要活化才能發(fā)揮其作用，磷酸化是其活化的重要標(biāo)志。本研究檢測分析急性力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠心肌PKCα、δ和ε三亞型的總蛋白及其磷酸化蛋白表達(dá)的變化，并探討三者之間的cross-talk可能產(chǎn)生的影響，以期為揭示急性力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的心肌I/R損傷的發(fā)生機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象與分組

健康雄性SD大鼠50只，體重為(256±13)g。常規(guī)分籠飼養(yǎng)(5只/籠)，標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料飼養(yǎng)，自由飲食。室溫維持在20℃～22℃，相對濕度為45%～50%，光照時(shí)間為12 h/d。大鼠先進(jìn)行5 d適應(yīng)性飼養(yǎng)，同時(shí)進(jìn)行速度為15 m/min、坡度為0、時(shí)間為10～20 min跑臺適應(yīng)性訓(xùn)練，休息1 d后隨機(jī)分為兩組(n=25)：對照組(Control，C)和急性力竭運(yùn)動(dòng)組(acute exhaustive exercise，AEE)。

1.2 動(dòng)物模型的建立與兩組運(yùn)動(dòng)方案

參考Hao等[1]的文獻(xiàn)報(bào)道，采用一次性力竭跑臺運(yùn)動(dòng)建立急性力竭運(yùn)動(dòng)模型。C組大鼠置于靜止跑臺上；AEE組大鼠進(jìn)行速度為30 m/min、坡度為0的跑臺運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)至力竭。大鼠腹部著地，四肢癱軟，翻正反射暫時(shí)消失，視為力竭。力竭運(yùn)動(dòng)開始前進(jìn)行5 min熱身運(yùn)動(dòng)，速度從15 m/min 逐漸增加到30 m/min。

1.3 取材

C組置于靜止跑臺上2 h后取材，AEE組完成急性力竭運(yùn)動(dòng)30 min后取材。取材程序?yàn)椋捍笫笮懈骨蛔⑸?0%水合氯醛(400 mg/100 g)，麻醉后，以仰臥位于解剖臺上固定，開胸暴露心臟。取心臟，用滅菌生理鹽水漂洗干凈，放入Eppendorf管后投入液氮中，最后轉(zhuǎn)存進(jìn)-80℃冰箱備用。

1.4 大鼠心肌組織PKCα、δ和ε與p- PKCαSer-657、δThr-507和εSer-729蛋白的檢測

每組隨機(jī)選取9個(gè)心臟的凍融心肌組織塊，按如下基本流程進(jìn)行檢測：(1)心肌組織塊稱重、粉碎、勻漿、裂解；(2)采用Bradford比色法測定蛋白質(zhì)濃度；(3)制備SDS-PAGE電泳分離膠和積層膠；(4)上樣；(5)電泳；(6)電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜；(7)加PKCα、δ和ε或p- PKCαSer-657、δThr-507和εSer-729一抗(1∶3 000)，GADPH一抗(1∶10 000)，4℃過夜，抗原抗體結(jié)合；(8)Western blot試劑盒顯色，X光曝光膠片，掃描膠片，Image J軟件分析特異性條帶的灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠心肌組織PKCα、δ和ε總蛋白水平變化

與C組比較，AEE組PKCα、PKCδ、PKCε蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05，表1)。

GroupPKCα/GAPDHPKCδ/GAPDHPKCε/GAPDHC0．77±0．070．61±0．120．64±0．08AEE1．00±0．17?0．77±0．18?0．98±0．34?

C: Control; AEE: Acute exhaustive exercise group; PKC： Protein kinase C

*P<0.05vscontrol group

2.2 大鼠心肌組織PKCαSer-657、δThr-507和εSer-729磷酸化蛋白水平變化

與C組比較，AEE組p-PKCαSer-657蛋白、p-PKCδThr-507蛋白水平顯著升高(P<0.05)，p-PKCεSer-729蛋白水平輕微下降，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表2)。

Groupp?PKCα/GAPDHp?PKCδ/GAPDHp?PKCε/GAPDHC0．88±0．070．72±0．081．18±0．24AEE1．17±0．26?0．92±0．22?1．14±0．25

PKC： Protein kinase C

*P<0.05vscontrol group

3 討論

PKCα與心肌肥大、擴(kuò)張性心肌病和心肌缺血損傷等有關(guān)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，PKCα表達(dá)或活化水平的變化對心肌收縮力產(chǎn)生重要調(diào)節(jié)作用。PKCα活化后定位在多種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上，可通過多種方式下調(diào)心肌細(xì)胞的收縮力。本研究發(fā)現(xiàn)提示急性力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)PKCα在活化水平上調(diào)后，可能定位在各種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上，發(fā)揮多種調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞功能的作用，尤其是下調(diào)心肌收縮力，導(dǎo)致心臟泵血功能下降，從而引發(fā)疲勞直至力竭。

PKCδ 主要作為一種促凋亡蛋白起作用[4]。Inagaki等[5]使用豬心AMI模型，在再灌注前在體冠狀動(dòng)脈內(nèi)施加PKCδ特異性活性抑制肽δV1-1干預(yù)，僅需1 min，就能明顯減小心肌梗塞面積、改善心臟功能、抑制cTnT釋放和減少心肌細(xì)胞的凋亡。這提示抑制PKCδ的活性，有利于減輕心肌細(xì)胞的損傷和提高心肌細(xì)胞的存活率。Murriel等[6]發(fā)現(xiàn)I/R后心肌細(xì)胞中PKCδ的活化產(chǎn)生關(guān)鍵性的促凋亡作用。本研究中，與C組比較，AEE組大鼠心肌組織PKCδ和 p-PKCδThr-507蛋白水平都顯著升高，提示AEE組大鼠心肌PKCδ活化水平上調(diào)，這可能導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

研究表明，PKCε在對抗心肌I/R損傷中起關(guān)鍵作用。使用特異性激活劑活化PKCε，可以保護(hù)心臟[7]。該現(xiàn)象在小鼠、大鼠和豬等物種的離體心肌細(xì)胞、離體灌注心臟和在體實(shí)驗(yàn)中都得到了驗(yàn)證。研究表明，在心肌細(xì)胞中PKCε參與調(diào)節(jié)sarcoKATPchannel、mitoKATPchannel、MPTP和Cx43(connexin43，連接蛋白43)等的結(jié)構(gòu)和功能。以上提示，PKCε可以調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的多種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的功能。在本研究中，與C組比較，AEE組大鼠心肌組織PKCε蛋白水平顯著上升，但 p-PKCεSer-729蛋白水平無明顯變化，提示急性力竭運(yùn)動(dòng)不會(huì)引起PKCε的活化水平上調(diào)。從前述分析可知，PKCε的活化水平上調(diào)有利心肌的存活。

PKC亞型之間存在cross-talk，使得各亞型的功能表現(xiàn)出時(shí)空協(xié)調(diào)的特征，可能對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)在功能上統(tǒng)一是至關(guān)重要的。PKCδ和PKCε在心肌細(xì)胞中存在cross-talk，對執(zhí)行不同的功能而言，既可能是相互拮抗，也可能是相互協(xié)調(diào)。就對抗缺血誘導(dǎo)的心肌損傷而言，兩者的cross-talk表現(xiàn)為相互拮抗[8]。目前，有關(guān)心肌細(xì)胞中PKCα與PKCδ、PKCα與PKCε之間cross-talk的文獻(xiàn)報(bào)道尚未出現(xiàn)，但是出現(xiàn)了非心肌細(xì)胞中PKCα與PKCδ、PKCα與PKCε之間cross-talk的報(bào)道[9,10]。本研究中，急性力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致AEE組大鼠心肌細(xì)胞中PKCα的表達(dá)水平和活化水平均上調(diào)；PKCδ表達(dá)和活化水平都上調(diào)；PKCε蛋白表達(dá)水平上調(diào)，但活化水平未上調(diào)，上述這些變化可能產(chǎn)生復(fù)雜的cross-talk，綜合起來對急性力竭運(yùn)動(dòng)作用下的心肌產(chǎn)生影響。

綜上所述，急性力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致PKCα、PKCδ表達(dá)和活化水平上調(diào)、PKCε表達(dá)水平上調(diào)，可能是急性力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致大鼠心肌損傷的重要因素，三亞型之間的cross-talk可能是更重要的因素。

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國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31071031)

2015-05-21

2016-02-01

G804.23

A

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