產(chǎn)前應激對子代大鼠腦缺血/再灌注后星形膠質(zhì)細胞的影響*

王凌星， 黃紅紅， 陳雅芳， 蔡鴻潮， 錢家強

(福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 泉州 362000)

?

產(chǎn)前應激對子代大鼠腦缺血/再灌注后星形膠質(zhì)細胞的影響*

王凌星， 黃紅紅△， 陳雅芳， 蔡鴻潮， 錢家強

(福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 泉州 362000)

目的：探討產(chǎn)前應激對雄性子代大鼠大腦中動脈缺血/再灌注后星形膠質(zhì)細胞的影響。方法：SD孕鼠隨機分為有產(chǎn)前應激處理(妊娠第15到21天每日3次限制活動)和無產(chǎn)前應激處理，并對其雄性子代大鼠采用線栓法制備大腦中動脈閉塞(MCAO)模型，共分為產(chǎn)前應激+假手術(shù)組、MCAO模型組、產(chǎn)前應激+MCAO組(n=10)，于再灌注后第5天檢測腦梗死體積,免疫熒光雙標染色檢測缺血灶邊緣區(qū)星形膠質(zhì)細胞形態(tài)及促紅細胞生成素肝細胞受體A4(EphA4)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的共表達情況，并采用Western blot檢測EphA4、GFAP和神經(jīng)蛋白聚糖(Neurocan)蛋白表達。結(jié)果：產(chǎn)前應激+MCAO組子代大鼠腦梗死體積百分比、EphA4、GFAP和Neurocan蛋白表達均較MCAO組顯著增加(P均<0.05)，且GFAP陽性細胞形態(tài)學改變及EphA4/GFAP共表達也較MCAO組明顯。結(jié)論：產(chǎn)前應激可能改變子代大鼠腦缺血/再灌注后星形膠質(zhì)細胞上EphA4受體的表達，促進星形膠質(zhì)細胞活化，產(chǎn)生神經(jīng)蛋白聚糖。

產(chǎn)前應激；子代大鼠； 腦缺血； 星形膠質(zhì)細胞

【DOI】 10.13459/j.cnki.cjap.2016.04.004

腦缺血時，會出現(xiàn)星形膠質(zhì)細胞的活化，表現(xiàn)為數(shù)量和形態(tài)的改變，并出現(xiàn)GFAP表達增加。星形膠質(zhì)細胞的早期活化、遷移和增殖可以限制缺血半暗帶的擴展[1]，所形成的膠質(zhì)瘢痕會分隔并保護未損傷組織免于損傷，抑制炎癥擴散并調(diào)節(jié)細胞外環(huán)境[2]。但另一方面，膠質(zhì)瘢痕構(gòu)成了軸突生長的物理性障礙，而且膠質(zhì)瘢痕中活化星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生了具有抑制作用的細胞外基質(zhì)分子，如硫酸軟骨素蛋白多糖(chondroitin sulfate proteoglycans，CSPG)，對神經(jīng)軸突生長形成生物化學屏障作用[3]。因此調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞的活性會改變腦缺血的轉(zhuǎn)歸和神經(jīng)功能損傷的程度。我們的前期研究表明，產(chǎn)前應激會加重子代大鼠缺血性卒中的神經(jīng)功能損害[4]，但星形膠質(zhì)細胞在這個過程中的作用尚不明確，我們推測產(chǎn)前應激可能改變?nèi)毖笮切文z質(zhì)細胞的活性而影響神經(jīng)功能。盡管已有研究表明促紅細胞生成素肝細胞受體A4(erythropoietin-producing hepato cellular receptor A4, EphA4)受體可以調(diào)節(jié)脊髓損傷后的星形膠質(zhì)細胞活化[5,6]，但關(guān)于腦缺血后EphA4受體對星形膠質(zhì)細胞的影響研究較少[7]，而產(chǎn)前應激對子代大鼠腦缺血/再灌注后星形膠質(zhì)細胞EphA4受體的影響，國內(nèi)外更是少見報道。本研究通過使用大鼠產(chǎn)前應激模型和子代大鼠缺血/再灌注模型，探討產(chǎn)前應激是否會通過EphA4受體改變子代大鼠腦缺血/再灌注后星形膠質(zhì)細胞的活化，影響CSPG的形成。本研究可為今后調(diào)節(jié)EphA4受體，改變產(chǎn)前應激對子代大鼠腦缺血/再灌注后神經(jīng)功能的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

12周齡的健康雌性SD大鼠，體重200～250 g，共15只，12周齡健康雄性大鼠15只，體重300～350 g，均購自上海斯萊克實驗動物有限公司。動物飼養(yǎng)條件：溫度為(22±1)℃，光照7：00 am—7：00 pm，自由攝取水和食物。

1.2 實驗方法

產(chǎn)前應激模型：將大鼠按雌∶雄1∶1的比例隨機合籠，以發(fā)現(xiàn)陰栓當日為妊娠第0天，次日為妊娠第1天。按隨機數(shù)字表法將孕鼠分為有產(chǎn)前應激處理和無產(chǎn)前應激處理。參考文獻方法建產(chǎn)前應激模型[8]：于妊娠第15到21天每日3次(分別在10:00、14:00、18:00)將孕鼠限制在塑料質(zhì)地的圓柱形裝置內(nèi)(長19 cm，直徑7 cm)，每次45 min。無產(chǎn)前應激處理的孕鼠在整個妊娠期均飼養(yǎng)于塑料籠內(nèi)不受干擾。除應激處理外，孕鼠不受其他打擾。所有孕鼠均自然分娩，共獲得15窩仔鼠，為避免奶水不足對新生仔鼠生長發(fā)育的影響，每窩仔鼠隨機留8只飼養(yǎng)。子代大鼠在3周齡后斷乳，僅保留雄性子代大鼠(3～4只/窩)。

MCAO模型：雄性子代大鼠于2月齡(體重約250～300 g)時采用右側(cè)頸外動脈插入線栓法[9]制造MCAO模型，大鼠于右側(cè)大腦中動脈缺血90 min后，向外輕輕拉出栓線，建立再灌注模型。并判定模型是否成功，以動物清醒后有右眼Horner征，提尾時出現(xiàn)左側(cè)前肢屈曲內(nèi)收者為研究對象，并剔除蛛網(wǎng)膜下腔出血者。假手術(shù)組采取同樣的手術(shù)過程，但線栓插入較淺，并不造成大腦中動脈閉塞。實驗共分3組：產(chǎn)前應激+假手術(shù)組，MCAO組，產(chǎn)前應激+MCAO組(n=10)。

1.3 HE染色

于再灌注后第5天，每組取5只大鼠，10%水合氯醛麻醉，并使用4%中性多聚甲醛灌注內(nèi)固定，于斷頭取腦后，從額極至枕葉切成厚度為3 mm的冠狀腦切片，經(jīng)脫水、透明、浸蠟，最后包埋成蠟塊。每一蠟塊切片行常規(guī)HE染色檢測腦梗死情況。采用Image J圖像軟件(Media Cybernetics,Inc)計算總的梗死體積(MV)及左右半球體積(LV、RV)。根據(jù)公式[10]進行計算：梗死體積(%)=[LV-(RV-MV)]/LV×100%，以糾正腦水腫對梗死面積的影響。

1.4 免疫熒光雙標染色

將腦組織的石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化、微波修復后，加入胎牛血清封閉后，加兔抗EphA4抗體(Santa Cruz Biotechnology Inc.，1∶150)和小鼠抗GFAP抗體(北京博奧森生物制劑有限公司，1∶300),4℃過夜，加FITC熒光素標記的羊抗兔IgG(1∶50)和CY3標記的羊抗小鼠IgG(1∶50)混合抗體，避光室溫孵育2 h，甘油封片。熒光顯微鏡下觀察缺血灶邊緣區(qū)EphA4和GFAP的表達情況并拍照。EphA4陽性細胞呈綠色熒光，GFAP陽性細胞呈紅色熒光，EphA4/GFAP雙陽性細胞呈淡黃色。

1.5 Western blot檢測

于再灌注后第5天，每組均取5只大鼠，10%水合氯醛麻醉，于低溫下開顱取缺血灶周邊區(qū)，假手術(shù)組取與手術(shù)組相對應的腦區(qū)，立即放入液氮中凍存。提取總蛋白后，使用BCA法測定蛋白濃度，于10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS- PAGE)分離后,轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，并在5%脫脂奶粉封閉后分別加入一抗：EphA4(Santa Cruz Biotechnology Inc.，1∶500)；GFAP(北京博奧森生物制劑有限公司，1∶200)；Neurocan(北京博奧森生物制劑有限公司，1∶200); β-肌動蛋白(β-actin，北京博奧森生物制劑有限公司，1∶2000)，4℃過夜，洗滌后與辣根過氧化酶標記的二抗孵育。ECL顯影后掃描，使用凝膠成像處理系統(tǒng)(美國SYNGENE公司)行吸光度分析。以目的條帶與β-actin條帶吸光度之比作為目的蛋白的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 腦梗死體積測定

各組子代大鼠腦梗死情況見圖1。產(chǎn)前應激+假手術(shù)組未見腦梗死灶。MCAO組梗死累及尾狀殼核及蒼白球，產(chǎn)前應激+MCAO組梗死范圍相對彌散，尚累及胼胝體和皮質(zhì)。產(chǎn)前應激+MCAO組梗死體積百分比(30.80±2.68)%明顯大于MCAO組(16.94±1.10)%(P<0.05)。

Fig. 1 Representative photographs of hematoxylin-eosin (HE) stained brain sections obtained from three experimental groups after 5 days of transient middle cerebral artery occlusion(MCAO)

2.2 EphA4/GFAP免疫熒光雙標染色

缺血灶邊緣區(qū)GFAP陽性細胞呈紅色熒光，產(chǎn)前應激+假手術(shù)組的GFAP陽性細胞數(shù)量較少，胞體小且纖維纖細(圖2A1)，MCAO組GFAP陽性細胞數(shù)量增多且體積增大(圖2B1)，產(chǎn)前應激+MCAO組GFAP陽性細胞分枝變長且增多增粗，部分突起交織呈網(wǎng)狀(圖2C1)。缺血灶邊緣區(qū)存在大量EphA4陽性細胞，呈綠色熒光(圖2A2、B2、C2)，且免疫熒光雙標染色提示EphA4受體與GFAP陽性星形膠質(zhì)細胞在缺血灶邊緣區(qū)的分布有較好的一致性，兩者疊加發(fā)現(xiàn)GFAP陽性星形膠質(zhì)細胞上均有EphA4表達，信號呈淡黃色(圖2A3、B3、C3)。

2.3 Western blot檢測EphA4、GFAP和Neurocan蛋白表達情況

產(chǎn)前應激+假手術(shù)組子代大鼠缺血灶邊緣區(qū)有EphA4和GFAP蛋白表達；與產(chǎn)前應激+假手術(shù)組比較，MCAO增加缺血灶邊緣EphA4和GFAP蛋白表達，差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；與MCAO組比較，產(chǎn)前應激+MCAO顯著增加EphA4和GFAP蛋白表達(P均<0.05)。產(chǎn)前應激+假手術(shù)組全長Neurocan蛋白表達極少；與產(chǎn)前應激+假手術(shù)組比較，MCAO增加全長Neurocan蛋白表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與MCAO組比較，產(chǎn)前應激+MCAO顯著增加全長Neurocan蛋白表達(P<0.05)。產(chǎn)前應激+假手術(shù)組、MCAO組和產(chǎn)前應激+MCAO組均檢測出C-末端Neurocan蛋白表達，但差異無統(tǒng)計學意義(圖3,表1)。

Fig. 2 Immunofluorescence double staining of GFAP and EphA4 in the peri-ischemia regions of three experimental groups after 5 days of transient middle cerebral artery occlusion (MCAO)

A1-A3: Prenatal stress+Sham group; B1-B3: MCAO group; C1-C3: Prenatal Stress+MCAO group. Scale bar=25 μm

Fig. 3 Expression of Neurocan, C-Neurocan, GFAP and EphA4 in the peri-ischemia regions of three experimental groups after 5 days of transient middle cerebral artery occlusion (MCAO)

A: Prenatal stress+Sham group； B: MCAO group； C: Prenatal stress+MCAO group

3 討論

產(chǎn)前應激來自生活或工作的不良事件的影響，如自然災害、戰(zhàn)爭、失業(yè)、家人或配偶的死亡、家庭和婚姻的不和諧等。本室驗前期研究[4]表明：產(chǎn)前應激會促進子代大鼠缺血/再灌注后24 h的神經(jīng)細胞凋亡，提示圍產(chǎn)期不良事件會影響子代缺血性卒中的預后。與前期研究結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)在缺血/再灌注后5 d，產(chǎn)前應激+MCAO組較MCAO組具有更大的腦梗死體積，提示產(chǎn)前應激會產(chǎn)生持久影響，導致成年子代對腦缺血/再灌注的易損性，從而加重子代腦缺血損害。

星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最豐富的細胞類型，在生理環(huán)境下可以為神經(jīng)元提供許多必須的支持性活動。在病理條件，如卒中、脊髓損傷、Alzheimer’s病等，星形膠質(zhì)細胞出現(xiàn)快速活化，經(jīng)歷數(shù)量和大小上的增加(增生和肥大)。活化的星形膠質(zhì)細胞不同于生理性的星形膠質(zhì)細胞，具有升高的GFAP表達，已有研究表明，在腦缺血時抑制星形膠質(zhì)細胞GFAP的過度表達可以保護神經(jīng)元并減輕神經(jīng)功能缺損[11]。本實驗觀察到MCAO組中GFAP陽性星形膠質(zhì)細胞出現(xiàn)數(shù)量增加、體積增大和細胞突起增多，且產(chǎn)前應激+MCAO組較MCAO組改變更明顯，而產(chǎn)前應激+假手術(shù)組則無這種改變，提示產(chǎn)前應激使子代的星形膠質(zhì)細胞在缺血/再灌注后出現(xiàn)更明顯的活化。我們推測星形膠質(zhì)細胞的活化及GFAP表達增加可能是產(chǎn)前應激的子代大鼠腦梗死面積增加的原因。

Tab. 1 Quantitative results of Neurocan, C-Neurocan, EphA4 and GFAP in three experimental ±s, n=5)

MCAO: Middle cerebral artery occlusion

*P<0.05vsprenatal stress + sham group;#P<0.05vsMCAO group

已有研究表明Eph是星形膠質(zhì)細胞活化的重要調(diào)節(jié)物，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后或中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病過程中的星形膠質(zhì)細胞增殖[12]。在Eph受體家族中，EphA4受體在損傷部位的星形膠質(zhì)細胞高度表達[5]，并可在體外[7]和活體[6]調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞活性。在EphA4基因敲除的小鼠，星形膠質(zhì)細胞反應明顯減少，GFAP表達減少，且CSPG染色也減少。在非人類的靈長類動物腦損傷模型中也發(fā)現(xiàn)EphA4受體表達在病灶部位周圍活化的星形膠質(zhì)細胞中明顯上調(diào)，而在體外實驗中EphA4受體活化介導星形膠質(zhì)細胞增殖和膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達[13]。與此類似，本實驗發(fā)現(xiàn)在MCAO組中EphA4受體表達增加且主要表達于GFAP陽性星形膠質(zhì)細胞，提示MCAO增加缺血灶周邊EphA4受體表達且該受體可能介導了星形膠質(zhì)細胞的活化，實驗還發(fā)現(xiàn)產(chǎn)前應激+MCAO組較MCAO組EphA4受體在GFAP陽性星形膠質(zhì)細胞的表達更明顯，提示產(chǎn)前應激會改變?nèi)毖笞哟切文z質(zhì)細胞上EphA4受體的表達，進而調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞的活化，出現(xiàn)GFAP表達增加及細胞形態(tài)改變。

活化的星形膠質(zhì)細胞具有以損傷部位為目標的細胞遷移增加以及隨后活躍的細胞增殖，并能產(chǎn)生CSPG，形成膠質(zhì)瘢痕[14]。Neurocan是一種主要的CSPG，在成年腦組織，神經(jīng)蛋白聚糖(275 kD)很快被分解為兩個片段，即C-端(150 kD)和N-端(130 kD)片段。因此，在正常的成年腦組織無法檢測到全長的神經(jīng)蛋白聚糖，而在發(fā)育不成熟的腦組織則可以檢測出全長神經(jīng)蛋白聚糖及其分解片段[15]，此外，在某些病理情況下，如腦外傷、癲癇的腦組織中也可以檢測到全長的神經(jīng)蛋白聚糖[15]。全長神經(jīng)蛋白聚糖可以通過調(diào)節(jié)鈣粘蛋白和整聯(lián)蛋白抑制軸突延伸或再生[15]。本實驗中，在MCAO組的缺血側(cè)額頂葉檢出全長神經(jīng)蛋白聚糖，這與既往的研究一致[16]，提示缺血可以誘導周邊腦組織表達全長神經(jīng)蛋白聚糖，從而調(diào)節(jié)神經(jīng)網(wǎng)絡形成。產(chǎn)前應激+MCAO組較MCAO組表達更多的全長神經(jīng)蛋白聚糖，說明產(chǎn)前應激可能通過改變CSPG分泌，阻礙神經(jīng)元再生，從而影響子代卒中后神經(jīng)功能恢復障礙。

總之，產(chǎn)前應激可能增加子代大鼠缺血/再灌注后缺血灶周邊星形膠質(zhì)細胞上EphA4受體的表達，促進星形膠質(zhì)細胞活化，分泌抑制分子，如神經(jīng)蛋白聚糖，抑制神經(jīng)元再生，可能導致更明顯的膠質(zhì)瘢痕形成，加重神經(jīng)損傷。本研究表明產(chǎn)前應激會加重子代大鼠腦缺血/再灌注損害，為腦血管病的防治與優(yōu)生優(yōu)育提供新的理論依據(jù)。

[1] Rolls A, Shechter R, Schwartz M. The bright side of the glial scar in CNS repair [J].NatRevNeurosci, 2009, 10(3): 235-241.

[2] Teshigawara K, Kuboyama T, Shigyo M,etal. A novel compound, denosomin, ameliorates spinal cord injuryviaaxonal growth associated with astrocyte-secreted vimentin [J].BrJPharmacol, 2013, 168(4): 903-919.

[3] Shen LH, Li Y, Gao Q,etal. Down-regulation of neurocan expression in reactive astrocytes promotes axonal regeneration and facilitates the neurorestorative effects of bone marrow stromal cells in the ischemic rat brain [J].Glia, 2008, 56(16): 1747-1754.

[4] 王凌星， 黃紅紅， 陳雅芳， 等. 產(chǎn)前應激對成年子代大鼠缺血性卒中后細胞凋亡的影響[J]. 中國應用生理學雜志, 2015, 31(5): 427-430.

[5] Coulthard MG, Morgan M, Woodruff TM,etal. Eph/Ephrin signaling in injury and inflammation[J].AmJPathol, 2012, 181(5): 1493-1503.[6] Goldshmit Y, Spanevello MD, Tajouri S,etal. Epha4 blockers promote axonal regeneration and functional recovery following spinal cord injury in mice [J].PLoSOne, 2011, 6(9): e24636.

[7] Parmentier-Batteur S, Finger EN, Krishnan R,etal. Attenuation of scratch-induced reactive astrogliosis by novel Epha4 kinase inhibitors [J].JNeurochem, 2011, 118(6): 1016-1031.

[8] Igosheva N, Taylor PD, Poston L,etal. Prenatal stress in the rat results in increased blood pressure responsiveness to stress and enhanced arterial reactivity to neuropeptide Y in adulthood [J].JPhysiol, 2007, 582(Pt 2): 665-674.

[9] Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S,etal. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats [J].Stroke, 1989, 20(1): 84-91.

[10]Swanson RA, Morton MT, Tsao-Wu G,etal. A semiautomated method for measuring brain infarct volume [J].JCerebBloodFlowMetab, 1990, 10(2): 290-293.

[11]尚 宇， 呂紅梅， 顧佩菲. 異丙酚對局灶性腦缺血/再灌注星形膠質(zhì)細胞GFAP表達的影響 [J]. 中國應用生理學雜志, 2009, 25(1): 16-17.

[12]Frugier T, Conquest A, McLean C,etal. Expression and activation of Epha4 in the human brain after traumatic injury [J].JNeuropatholExpNeurol, 2012, 71(3): 242-250.

[13]Goldshmit Y, Bourne J. Upregulation of Epha4 on astrocytes potentially mediates astrocytic gliosis after cortical lesion in the marmoset monkey [J].JNeurotrauma, 2010, 27(7): 1321-1332.

[14]Sofroniew MV. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation [J].TrendsNeurosci, 2009, 32(12): 638-647.

[15]Asher RA, Morgenstern DA, Fidler PS,etal. Neurocan is upregulated in injured brain and in cytokine-treated astrocytes [J].JNeurosci, 2000, 20(7): 2427-2438.

[16]Deguchi K, Takaishi M, Hayashi T,etal. Expression of neurocan after transient middle cerebral artery occlusion in adult rat brain [J].BrainRes, 2005, 1037(1-2): 194-199.

The effects of prenatal stress on the astrocytes after cerebral ischemia/reperfusion injury in adult offspring rats

WANG Ling-xing, HUANG Hong-hong△, CHEN Ya-fang, CAI Hong-chao, QIAN Jia-qiang

(Department of Neurology, the Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Quanzhou 362000, China)

Objective: To investigate the effects of prenatal stress on astrocytes after ischemia/reperfusion of cerebral middle artery in adult offspring rats. Methods: Pregnant rats were randomly assigned to prenatal stress treatment group, which was exposed to restraint three times daily in the last week of pregnancy, and no prenatal stress treatment group. Adult male offspring rats were subjected to transient focal cerebral ischemia by middle cerebral artery occlusion (MCAO). There were three groups: prenatal stress + sham group, MCAO group and prenatal stress + MCAO group (n=10). After 5 days of reperfusion, the infarct size was evaluated. The morphology of astrocytes, co-localization of erythropoietin-producing hepatocellular receptor A4 (EphA4) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) were detected by double immunofluorescent staining. And the protein expressions of EphA4, GFAP and Neurocan in peri-ischemic regions were detected by Western blot. Results: The infarct size and the expression of EphA4, GFAP and Neurocan were significantly increased in prenatal stress + MCAO group compared with MCAO group (allP<0.05). And the morphological changes of GFAP-positive astrocytes and co-localization of EphA4/GFAP were more obvious in prenatal stress + MCAO group compared with MCAO group. Conclusion: Prenatal stress may upregulate the expression of EphA4 on astrocytes in the offspring rats after cerebral ischemia/reperfusion, which promotes the reactivity of astrocyte and increases the expression of neurocan.

prenatal stress; offspring rats; cerebral ischemia; astrocyte

福建省自然科學基金項目(2015J01449)；福建省教育廳項目(JB13067)；泉州市技術(shù)研究與開發(fā)項目(2012Z35)；院苗圃基金(2012MP65)

2015-11-24

2016-04-04

R741.02

A

1000-6834(2016)04-301-05

△【通訊作者】Tel： 13600766682； E-mail： minghuaxin@139.com