延齡草對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)制*

詹光杰， 肖本見， 楊年安

(1. 生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 2. 湖北民族學(xué)院科技學(xué)院， 3. 風(fēng)濕疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 恩施 445000)

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延齡草對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)制*

詹光杰1,2△， 肖本見2， 楊年安3

(1. 生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 2. 湖北民族學(xué)院科技學(xué)院， 3. 風(fēng)濕疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 恩施 445000)

目的：研究延齡草(TTM)對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)大鼠氧化應(yīng)激與肝損傷的保護(hù)作用。方法：SD大鼠60只，按體重隨機(jī)分成TTM高、中、低劑量組、模型組、地塞米松磷酸鈉(DEX)對(duì)照組及空白對(duì)照組(n=10)。TTM高、中及低劑量組按(8、4、2)g/(kg·d)TTM灌胃，模型組、DEX對(duì)照組及空白對(duì)照組灌胃等量蒸餾水，每隔5 d，TTM高、中、低劑量組、模型組、DEX對(duì)照組按1 mg/kg腹腔注射LPS，DEX對(duì)照組同時(shí)腹腔注射DEX(5 mg/kg)，空白對(duì)照組注射等量生理鹽水。30 d后，測(cè)定大鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)，對(duì)血清一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)活性與一氧化氮(NO)、谷胱甘肽(GSH)、硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物(TBARS)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、IL-10及腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量，肝組織SOD、谷胱甘肽過氧化氫酶(GSH-Px)活性與GSH、TBARS含量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：與模型組相比，TTM高劑量組在(19～30)d體重顯著降低(P<0.05)，TTM高、中、低劑量組胸腺指數(shù)，TTM高劑量組脾臟指數(shù)顯著降低(P<0.05)，TTM高、中、低劑量組血清NOS活性與TBARS、NO含量顯著降低(P<0.05)，TTM高劑量組血清SOD活性及中、高劑量組GSH含量顯著上升(P<0.05)，TTM高、中劑量組血清IL-6、TNF-α含量顯著降低，IL-10含量顯著升高(P<0.05)，TTM中、高劑量組肝臟TBARS含量顯著降低，TTM各劑量組肝臟SOD活性與中、高劑量組GSH-Px活性，高劑量組GSH含量顯著升高(P<0.05)。結(jié)論：TTM對(duì)LPS所致大鼠的胸腺、脾臟萎縮有一定的延緩作用，能有效降低血清中NOS活性，減少NO生成，提升SOD、GSH-Px活性與GSH含量，減輕脂質(zhì)過氧化，降低IL-6、TNF-α過量分泌、提升IL-10含量，有抗炎護(hù)肝的功能。

延齡草；脂多糖；肝損傷；抗氧化；抗炎

【DOI】 10.13459/j.cnki.cjap.2016.04.022

機(jī)體受到某些有害因子的刺激后會(huì)產(chǎn)生過多活性氮自由基(reactive nitrogen species，RNS)和活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)等活性分子，過量的活性分子通過多種途徑對(duì)核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物大分子進(jìn)行攻擊，造成機(jī)體不同程度損傷，是導(dǎo)致衰老和疾病的重要因素[1]。引發(fā)的氧化應(yīng)激可直接或間接作用于肝細(xì)胞，改變細(xì)胞膜通透性，破壞酶的活性，造成肝細(xì)胞壞死、損傷及凋亡，致使肝功能受損[2]。延齡草(Trillium tschonoskii Maxim，TTM)又名頭頂一顆珠，為百合科延齡草屬植物延齡草干燥根莖與成熟的果實(shí)，是湖北恩施地區(qū)土家族、苗族應(yīng)用較多的一種珍稀藥材，常被當(dāng)?shù)厝朔顬椤吧袼帯盵3]。其含有甾體皂苷、黃酮苷及倍半萜苷等活性成分，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、提高免疫力、抗衰老等功效[4，5]。本實(shí)驗(yàn)擬建立細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)大鼠氧化應(yīng)激和肝損傷模型，通過測(cè)定相關(guān)指標(biāo)，研究延齡草提取物不同濃度灌胃對(duì)大鼠肝損傷與炎癥的干預(yù)作用，并初步探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

9～10周齡SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量(210～230)g，購自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(鄂)2008-0005]。分籠飼養(yǎng)于安靜、干燥、通風(fēng)的環(huán)境中，自由飲水，通用飲料喂養(yǎng)，自由光照，溫度25℃±3℃。

1.2 藥品與試劑

TTM由湖北省恩施市板橋鄉(xiāng)中藥材生產(chǎn)基地提供，采用水提醇沉淀法制成含生藥30%的液體，瓶裝密封消毒貯存于4℃?zhèn)溆肹4]。LPS(大腸桿菌血清型055：B5)購自Sigma公司；地塞米松磷酸鈉注射液(Dexamethasone，DEX)，規(guī)格2 mg/ml，購自浙江仙琚制藥股份有限公司；大鼠一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)、一氧化氮(nitric oxide，NO)、谷胱甘肽過氧化氫酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性檢測(cè)試劑盒購于南京建成生物工程研究所；白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)、IL-10及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA試劑盒購自晶美公司；BCA 蛋白定量分析試劑盒購自美國 Thermo Fisher 公司；其他分析純?cè)噭┘皩?shí)驗(yàn)用耗材購自湖北恩施樂之塬科技公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

全自動(dòng)生化分析儀(日本Hitachi公司)，電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)(寧波新芝科技股份有限公司)，紫外-可見分光光度計(jì)(美國Beckman公司)，精密電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限責(zé)任公司)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)，低溫冷凍離心機(jī)(美國Beckman公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模、分組與處理

SD大鼠60只，適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后，按體重隨機(jī)分成TTM高、中、低劑量組、模型組、DEX對(duì)照組及空白對(duì)照組(n=10)。每6 d為一個(gè)實(shí)驗(yàn)周期，TTM高、中及低劑量組按(8、4、2)g/(kg·d)TTM灌胃，模型組、DEX對(duì)照組及空白對(duì)照組灌胃等量蒸餾水。每隔5 d，TTM高、中、低劑量組、模型組、DEX對(duì)照組按1 mg/kg腹腔注射LPS，DEX對(duì)照組同時(shí)腹腔注射DEX(5 mg/kg)，空白對(duì)照組注射等量生理鹽水[6]。每天觀察大鼠活動(dòng)情況，稱取體重，自由飲食，連續(xù)飼養(yǎng)30 d。

1.5 胸腺、脾臟指數(shù)測(cè)定

末次注射LPS后，各組大鼠禁食12 h(可飲水)，精確稱量，按3.5 ml/kg腹腔注射水合氯醛溶液麻醉[6]。心臟取血后，取胸腺、脾臟，預(yù)冷生理鹽水沖洗拭干，迅速精確稱取質(zhì)量，計(jì)算胸腺、脾臟指數(shù)。胸腺(脾臟)指數(shù)=胸腺(脾臟)質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100。

1.6 血清及肝臟相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1 血清NOS、SOD活性，NO、GSH、TBARS、IL-10、IL-6及TNF-α的含量檢測(cè) 將大鼠血液收集于促凝管中，于4℃，3 000 r/min離心10 min后 -80℃保存?zhèn)溆?。血清中NOS、SOD活性及NO、GSH、硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物(thiobarbituric acid reactive substances, TBARS)含量的檢測(cè)參考試劑盒說明書及文獻(xiàn)[6]進(jìn)行；IL-10、IL-6及TNF-α的檢測(cè)參考試劑盒說明書采用雙抗體夾心ELISA。

1.6.2 肝臟SOD、GSH-Px活性和GSH、TBARS含量檢測(cè) 取肝臟，預(yù)冷生理鹽水沖洗拭干，迅速精確稱取1 g肝組織后剪碎，制備成10%勻漿，于4℃，3 000 r/min離心15 min，取上清-80℃保存?zhèn)溆谩８黜?xiàng)檢測(cè)操作參照文獻(xiàn)[6]及檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般行為學(xué)觀察與體重變化

實(shí)驗(yàn)全程，空白對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)良好，進(jìn)食正常，反應(yīng)能力與行為無明顯異常。每次注射LPS后，大鼠會(huì)不同程度出現(xiàn)行動(dòng)遲緩、精神不振、畏寒、怕光等現(xiàn)象，經(jīng)過3 h后逐漸恢復(fù)正常。TTM高、中劑量組與DEX對(duì)照組恢復(fù)較快，模型組恢復(fù)最緩慢，各組生存率100%。各組體重均有不同程度增加。較空白對(duì)照組，DEX對(duì)照組在(13～30)d期間，模型組在(19～30)d期間體重顯著降低(P<0.05)；較模型組，TTM高劑量組在(19～30)d期間顯著降低(P<0.05，表1)，其它時(shí)段體重變化無明顯差異。

Tab. 1 Changes in body weight of rats during the experiment (g, ±s, n=10)

LPS: Lipopolysaccharide； DEX； Dexamethasone； TTM： Trillium tschonoskii Maxim

*P<0.05vsnormal control group；#P<0.05vsLPS control group

2.2 TTM對(duì)大鼠胸腺、脾臟指數(shù)的影響

與空白對(duì)照組相比，模型組及TTM高、中、低劑量組胸腺、脾臟指數(shù)增加顯著(P<0.05)，DEX對(duì)照組無明顯變化；與模型組相比，DEX對(duì)照組胸腺、脾臟指數(shù)明顯減小(P<0.05)，TTM能有效抵制胸腺增生，高、中、低劑量組胸腺指數(shù)顯著降低(P<0.05)，而TTM對(duì)脾臟增生的抑制作用僅高劑量組作用顯著(P<0.05)，中、低劑量組脾臟指數(shù)變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

GroupThymusindexSpleenindexNormalcontrol0．069±0．0120．148±0．013LPScontrol0．145±0．013?0．379±0．024?LPS+DEX0．065±0．008#0．139±0．031#2g/kgTTM0．121±0．012?#0．366±0．028?4g/kgTTM0．113±0．009?#0．345±0．019?8g/kgTTM0．103±0．012?#0．314±0．021?#

*P<0.05vsnormal control group；#P<0.05vsLPS control group

2.3 TTM對(duì)大鼠血清NOS、SOD活性及NO、GSH、TBARS含量的影響

與空白對(duì)照組相比，模型組NOS活性與NO、TBARS含量顯著升高， SOD活性與GSH含量顯著下降(P<0.05)，DEX對(duì)照組GSH含量明顯降低(P<0.05)，TTM各劑量組GSH活性及中、低劑量組SOD活性顯著下降(P<0.05)，TTM低劑量組NO、TBARS含量顯著升高(P<0.05)，其它差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組相比，DEX對(duì)照組NOS活性與NO、TBARS含量顯著降低，而SOD活性及GSH含量顯著升高(P<0.05)，TTM各劑量組NOS活性及NO、TBARS含量顯著降低，TTM高劑量組SOD活性與中、高劑量組GSH含量顯著上升(P<0.05，表3)。

2.4 TTM對(duì)大鼠血清IL-10、IL-6及TNF-α含量的影響

與空白對(duì)照組相比，模型組IL-6、TNF-α含量顯著升高，IL-10含量顯著下降(P<0.05)，DEX對(duì)照組IL-10含量明顯降低(P<0.05)，TTM中、低劑量組IL-10含量顯著下降，TTM低劑量組IL-6、TNF-α含量顯著升高(P<0.05)，其它差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組相比，DEX對(duì)照組IL-6、TNF-α含量顯著降低，IL-10含量顯著升高(P<0.05)，TTM高、中劑量組IL-6、TNF-α含量顯著降低，IL-10含量則顯著升高(P<0.05，表4)。

Tab.

NOS： Nitricoxide synthase； SOD： Superoxide dismutase； NO： Nitricoxide； GSH： Glutathione； TBARS： Thiobarbituric acid reactive substances; LPS: Lipopolysaccharide; DEX: Dexamethasone; TTM: Trillium tschonoskii Maxim

*P<0.05vsnormal control group；#P<0.05vsLPS control group

GroupIL?10TNF?αIL?6Normalcontrol88．3±4．590．6±5．2101．6±6．8LPScontrol51．7±4．1?125．4±5．6?138．3±5．3?LPS+DEX53．5±4．4#96．3±4．4?93．8±7．5?2g/kgTTM52．8±4．3#115．7±4．8#128．1±7．8#4g/kgTTM62．6±4．8#107．6±3．8#110．6±8．1#8g/kgTTM75．7±4．6#95．8±4．5#93．4±6．5#

IL-10： Interleukin-10； TNF-α： Tumor necrosis factor α； IL-6： Interleukin-6; LPS: Lipopclysaccharide; DEX: Dexamethasone; TTM: Trillium techonoskii Maxim

*P<0.05vsnormal control group；#P<0.05vsLPS control group

2.5 TTM對(duì)大鼠肝組織GSH-Px、SOD活性及TBARS、GSH含量的影響

與空白對(duì)照組相比，模型組、DEX對(duì)照組、TTM各劑量組TBARS含量顯著升高，模型組GSH-Px、SOD活性及GSH含量顯著下降(P<0.05)，DEX對(duì)照組與TTM低劑量組GSH-Px、SOD活性明顯降低(P<0.05)，其它差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組相比，DEX對(duì)照組TBARS含量顯著降低，GSH含量顯著升高(P<0.05)，TTM中、高劑量組TBARS含量顯著降低，TTM各劑量組SOD活性和中、高劑量組GSH-Px活性，高劑量組的GSH含量顯著升高(P<0.05，表5)。

Tab.

GSH-Px： Glutathione peroxidase； SOD： Superoxide dismutase； TBARS： Thiobarbituric acid reactive substances； GSH： Glutathione; LPS: Lipopclysaccharide; DEX: Dexamethasone; TTM: Trillium techonoskii Maxim

*P<0.05vsnormal control group；#P<0.05vsLPS control group

3 討論

LPS是由革蘭陰性桿菌產(chǎn)生的一類內(nèi)毒素，可造成機(jī)體內(nèi)ROS、RNS等自由基大量產(chǎn)生，并通過激活免疫巨噬細(xì)胞、釋放炎癥因子等途徑引發(fā)全身多器官損傷，作為主要清除內(nèi)毒素的肝臟是最易受損的器官之一[7]。及時(shí)補(bǔ)充外源性的抗氧化劑可有效抑制或減輕LPS誘發(fā)的機(jī)體損傷[6,8]。

大鼠注射LPS后，會(huì)出現(xiàn)急性氧化應(yīng)激反應(yīng)，大腦海馬最易受損，也是應(yīng)激最為敏感的區(qū)域，LPS刺激可導(dǎo)致大腦皮層中5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素(NE)含量升高[9]。本實(shí)驗(yàn)中大鼠一般行為學(xué)的改變，推測(cè)是LPS進(jìn)入大鼠體內(nèi)后，5-HT和NE含量增加所致。TTM高、中劑量組有較好恢復(fù)，表明TTM能影響海馬中5-HT合成和NE釋放而抗氧化應(yīng)激。注射LPS后，對(duì)大鼠體重變化均有影響，模型組尤其顯著，表明LPS已對(duì)機(jī)體造成了損傷，高劑量TTM對(duì)造成的損傷有較好抑制作用。DEX對(duì)照組體重變化與相啟森[6]研究一致，是因高劑量DEX可誘導(dǎo)瘦素的分泌，導(dǎo)致體重下降[6,10]。TTM對(duì)胸腺、脾臟萎縮有一定的延緩作用，TTM高劑組最為突出，表明大劑量TTM在改善免疫器官功能方面更有效，有助于T 細(xì)胞功能增強(qiáng)，遲發(fā)型過敏反應(yīng)升高[11]。

LPS進(jìn)入肝臟后還可誘使巨噬細(xì)胞-Kupffer細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，產(chǎn)生大量的活性自由基(如NO)，引起脂質(zhì)過氧化[12]，NOS是NO生成的限速酶，直接影響NO的產(chǎn)生[6]，TBARS涵蓋了大部分氧化損傷產(chǎn)生的醛酮類物質(zhì), 是衡量脂質(zhì)過氧化損傷的重要指標(biāo)[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，注射LPS后，大鼠NOS活性和NO、TBARS含量顯著升高，葉挺梅[14]研究認(rèn)為這主要是因NOS表達(dá)增高所致。高、中劑量TTM灌胃能顯著降低LPS誘導(dǎo)所致NO含量與NOS活性的升高，表明TTM可通過調(diào)節(jié)NOS活性來減少NO的釋放。TTM灌胃還可降低血清、肝組織中TBARS含量，尤以中、高劑量TTM顯著，提示高劑量TTM能有效抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減輕自由基對(duì)肝的損傷。

Kupffer細(xì)胞氧化應(yīng)激時(shí)可刺激GSH合成，增強(qiáng)SOD、GSH-Px抗氧化活性，但活性自由基超過機(jī)體自身抗氧化能力時(shí)，GSH耗竭，SOD、GSH-Px抗氧化活性下降[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LPS誘導(dǎo)氧化應(yīng)激嚴(yán)重影響了機(jī)體自身的抗氧化體系。TTM灌胃干預(yù)后，高劑量TTM對(duì)LPS誘導(dǎo)引起的機(jī)體抗氧化能力下降有較好的修復(fù)作用，推測(cè)其機(jī)制是TTM通過提高內(nèi)源性抗氧化物含量和氧化酶活性來完成的。

LPS進(jìn)入機(jī)體后，還可通過與特異性Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)結(jié)合，激活NF-κB 釋放進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)炎性因子基因表達(dá)[16]，NF-κB適度活化有利于增強(qiáng)機(jī)體防御能力，活化過度則對(duì)機(jī)體造成損傷[17]，炎性因子IL-10、IL-6及TNF-α的含量高低可體現(xiàn)炎癥反應(yīng)狀態(tài)[9,18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組IL-6、TNF-α急劇增加，抗炎因子IL-10含量顯著降低，與前人[18]研究結(jié)果一致。表明TTM對(duì)LPS引起的炎癥損傷有較好的恢復(fù)作用，抗炎機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

研究發(fā)現(xiàn)延齡草提取物有抗炎、抗氧化的降酶保肝作用。

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The protective effects and mechanisms of Trillium tschonoskii Maxim on rats’ liver damage induced by lipopolysaccharide

ZHAN Guang-jie1,2△， XIAO Ben-jian2， YANG Nian-an3

(1. Key Laboratory of Biologic Resources Protection and Utilization of Hubei Province， 2. Science and Technology College of Hubei University for Nationalities， 3.Hubei Provincial Key Laboratory of Occurrence and Intervention of Rhumatic Diseases, EnShi 445000， China)

Objective: To study the protective effects of Trillium tschonoskii maxim (TTM)on rats’ oxidative stress and hepatotoxicity induced by lipopolysaccharide (LPS). Methods: Sixty SD rats were randomly divided into TTM high, medium and low dose groups, model group, Dexamethasone (DEX) control group and blank control group with ten rats in each group. The TTM high, medium and low dose groups were treated with 8, 4, 2 g/(kg·d)TTM by intragastric administration and model group, DEX control group and blank control group were treated with the same amount of distilled water respectively. The TTM high, medium and low dose groups, model group, DEX control group were injected intraperitoneal with 1 mg/kg LPS and the DEX control group was injected intraperitoneal with 5 mg/kg DEX, the blank control group was injected with same amount of normal saline every five days. The indexes of rats’ thymus and spleen were measured in 30 days. The activities of serum nitric oxide synthase (NOS), superoxide dismutase (SOD) and the contents of nitric oxide (NO), glutathione (GSH), glucosinolates barbituric acid reaction product(TBARS), white cells interleukin-6(IL-6), IL-10 and tumor necrosis factor-α(TNF-α), the activities of liver SOD, GSH-Px and the contents of GSH and TBARS were measured. Results: TTM high dose group was significantly different in body weight in 19～30 days(P<0.05); The index of thymus in TTM high, medium and low dose groups and the index of spleen in TTM high dose group were decreased significantly compared with those of the model group. The activity of serum NOS and the contents of TBARS and NO in TTM high, medium and low dose groups were decreased significantly(P<0.05). The activity of serum SOD in TTM high dose group and the contents of GSH in TTM medium and low dose groups were increased significantly(P<0.05).The contents of serum IL-6 and TNF-α in TTM high, medium dose groups were decreased significantly and the contents of serum IL-10 were increased significantly(P<0.05).The contents of liver TBARS in TTM high, medium dose groups were decreased significantly. The activity of liver SOD in TTM high, medium and low dose groups, the activity of GSH-Px in TTM high, medium dose groups and the contents of GSH in TTM high dose group were increased significantly(P<0.05). Conclusion: TTM has a certain effect to delay the rats’ atrophy of thymus and spleen generated by LPS. It can effectively reduce the activity of NOS in serum, reduce the formation of NO, improve the activity of SOD, GSH-Px and the contents of GSH, reduce lipid peroxidation, decrease the excessive secretion of IL-6, TNF-α, increase the contents of IL-10, which can resist inflammation and protect the liver.

Trillium tschonoskii Maxim(traditional Chinese medicine); lipopolysaccharide; liver damage; antioxidant; anti-inflammatory

生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助(PKLHB1514)；林學(xué)一級(jí)學(xué)科資助

2015-06-05

2016-01-29

R285.5

A

1000-6834(2016)04-373-05

△【通訊作者】Tel： 13135832144； E-mail： zhan 323@163.com