改進(jìn)植物油黃曲霉毒素B1測(cè)定的前處理方法

鄧云 周新華

（茂名市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東茂名 525000）

改進(jìn)植物油黃曲霉毒素B1測(cè)定的前處理方法

鄧云 周新華

（茂名市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東茂名 525000）

黃曲霉毒素B1在自然界廣泛存在，具有強(qiáng)烈的致癌性，其是黃色曲霉菌（Aspergillus flavus）或寄生曲霉菌（Aspergillus parasiticus）的主要次生代謝產(chǎn)物，是目前已知的自然物質(zhì)中致癌性最強(qiáng)的一種。黃曲霉毒素B1毒性劇烈，致癌性強(qiáng)，即使含量非常少，通過生物積累，也能引起人體器官癌變，所以國內(nèi)外對(duì)其限量標(biāo)準(zhǔn)以及檢驗(yàn)方法都做了嚴(yán)格和深入的研究，但是常用的檢驗(yàn)前處理方法步驟繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)人力，消耗大量的試劑，且靈敏度低。通過嘗試?yán)煤銣卣袷幤骱吞刂频乃芰险袷幖苓M(jìn)行植物油的前處理，用酶聯(lián)免疫方法對(duì)樣品中黃曲霉毒素B1進(jìn)行檢測(cè)，大大提高了檢驗(yàn)速度、檢出限，降低了成本，對(duì)于一般的樣品可加提取液直接測(cè)定，具有很高的靈敏度。

植物油 黃曲霉毒素B1 前處理

黃曲霉毒素是一類真菌（如黃曲霉和寄生曲霉）的有毒的代謝產(chǎn)物，它們具有很強(qiáng)的致癌性，主要存在于谷物、堅(jiān)果、棉籽以及一些和人類血液，動(dòng)物飼料相關(guān)的產(chǎn)品中。其中黃曲霉毒素B1（AFB1）的毒性、致癌性、污染頻率均居于首位。而使用黃曲霉毒素B1 ELISA試劑盒則能夠快速而準(zhǔn)確的分析樣品中黃曲霉毒素B1殘留。參考國家標(biāo)GB/T5009.22-2003。黃曲霉毒素B1檢測(cè)試劑盒是應(yīng)用ELISA技術(shù)研發(fā)的新一代真菌毒素檢測(cè)產(chǎn)品，相比起薄層層析法操作時(shí)間短于60min，能最大限度地減少操作誤差和工作強(qiáng)度，提高了試驗(yàn)靈敏度，且安全無污染。

1　試驗(yàn)材料與方法

1.1主要材料

板式酶標(biāo)儀；恒溫孵育箱；梨形分液漏斗（250ml）；恒溫振蕩器；特制20孔振搖架，50ul-1000ul移液槍。

1.2主要試劑

石油醚（分析純，沸點(diǎn)60-90）；1+1甲醇水；ELISA定量檢測(cè)試劑盒（蘇菲內(nèi)含AFB1抗原包被12孔x2條形戴康酶標(biāo)板；抗原稀釋液；抗原；樣品稀釋液；顯色液ab；終止液；洗液；標(biāo)準(zhǔn)液。

1.3操作步驟

1.3.1前處理步驟

（1）梨形分液漏斗涂好凡士林，編號(hào)，稱取5g左右樣品于梨形分液漏斗中。

（2）分別加入20ml石油醚和25ml1+1甲醇水溶液。

（3）用適宜的膠塞緊塞梨形分液漏斗，按順序倒立于特制的20孔振蕩架（剛好可以固定梨形分液漏斗）中，再把振蕩架嫁置于恒溫振蕩器上。

（4）打開恒溫振蕩器電源開關(guān)和振蕩開關(guān)，調(diào)好左右搖晃的速度，振搖15分鐘左右。

（5）取下分液漏斗膠塞，靜置片刻后，扭到活塞，放下下層的甲醇水溶液于一次性杯內(nèi)。

（6）用移液槍按樣品順序分別移取300ul樣品液于10ml安培瓶內(nèi)，再加入900ul樣品稀釋液于樣品液內(nèi)搖勻備用。

1.3.2試劑盒處理步驟

（1）將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

（2）取出需要數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板放進(jìn)原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封，保存于2～8℃，不要冷凍。

（3）洗滌工作液在使用前也需回溫，且按20：1的配比配制洗液。（4）編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)。

（5）加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本：在標(biāo)準(zhǔn)孔內(nèi)加入從低到高濃度的標(biāo)準(zhǔn)液各50ul，再在樣品孔加入樣品液50ul后，再加入AFB1抗原試劑50ul/孔，輕輕振蕩混勻，放置入恒溫孵育箱內(nèi)孵育30min。

（6）洗板：小心拿出反應(yīng)板，將孔內(nèi)液體用力甩干，吸取洗滌工作液250ul/孔，充分洗滌4次，每次間隔2分鐘，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破）。

（7）顯色：加入底物液A液50ull/孔，再加底物液B液50ul/孔，輕輕振蕩混勻，再放置恒溫孵育箱避光環(huán)境反應(yīng)15～20min。

（8）終止反應(yīng)：加入終止液50ul，搖勻。

（9）測(cè)定：設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測(cè)，請(qǐng)?jiān)?min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測(cè)定每孔OD值。（若無酶標(biāo)儀，則不加終止液用目測(cè)法可進(jìn)行判定）。

2　結(jié)果與討論

2.1結(jié)果計(jì)算

以酶標(biāo)儀測(cè)出的OD相對(duì)值為Y軸，輸入酶標(biāo)儀計(jì)算原件內(nèi)，并編輯好稀釋倍數(shù)以及標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度，用對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，得出樣品的AFB1的lgX值，求出X值，及為樣品中AFB1含量。

2.2結(jié)果驗(yàn)證

用液相色譜法處理同一樣品，與本法得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不大。

3　操作注意事項(xiàng)

（1）室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回到室溫（20～25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

（2）在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

（3）每加一種試劑前需將其搖勻。

（4）反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

（5）不要使用過了有效日期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過了有效期的試劑盒會(huì)引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。

（6）保存試劑盒于2～8℃，不要冷凍，將不用的酶標(biāo)板微孔板放進(jìn)自封袋重新密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

（7）試劑變質(zhì)的跡象，發(fā)色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm＜0.5）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。

（8）在加入底物液A液和底物液B液后，一般顯色時(shí)間為15～20min即可。若顏色較淺，可延長反應(yīng)時(shí)間到30min（或更長）。反之，則減短反應(yīng)時(shí)間。

（9）濃縮洗滌液如有結(jié)晶屬正?，F(xiàn)象，請(qǐng)加熱溶解后使用。

（10）該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

4　結(jié)語

國標(biāo)植物油中黃曲霉毒素B1的測(cè)定前處理方法繁瑣，耗時(shí)長，而且要每個(gè)樣品需要搖蕩5分鐘，費(fèi)人力。通過對(duì)其前處理方法進(jìn)行改進(jìn)，在操作過程中利用恒溫振蕩器和特質(zhì)的震搖架從而可以批量處理樣品，進(jìn)而用酶聯(lián)免疫方法對(duì)其測(cè)定，大大縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

鄧云（1987—），男，廣東茂名人，畢業(yè)于廣東石油化工學(xué)院，研究方向：食品檢測(cè)。