66份云南茶樹種質生化成分的分析及特異種質篩選

劉玉飛 龐丹丹 蔣會兵 田易萍 李友勇 孫云南 陳林波

摘要：【目的】鑒定云南茶樹種質資源，分析其兒茶素和嘌呤生物堿的多樣性，篩選出高兒茶素指數(shù)（Catechin index，CI）、高苦茶堿等特異茶樹種質資源，為茶樹品種選育和特異產品開發(fā)提供科學依據(jù)。【方法】通過高效液相色譜（HPLC）檢測云南66份代表性茶樹種質的兒茶素[沒食子兒茶素（GC）、表沒食子兒茶素（EGC）、兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）]和嘌呤生物堿（咖啡堿、可可堿和苦茶堿）等主要品質和功能性成分;利用統(tǒng)計軟件分析其遺傳多樣性（香農多樣性指數(shù)，H'），并對其進行主成分分析和聚類分析;最后篩選出高CI、高苦茶堿的種質。【結果】66份云南茶樹種質的GC、EGC、C、EC、EGCG、GCG、ECG、咖啡堿和可可堿等成分存在豐富的遺傳多樣性和變異性，其中，H'除EC、ECG外均大于1.80，EGCG的H'最高（2.06）;C（66.07%）具有最大的變異系數(shù)，可可堿的變異系數(shù)（15.68%）最小。通過主成分分析，發(fā)現(xiàn)前5個主成分的累計方差貢獻率達83.37%，包含所有性狀的大部分信息?；?4個生化成分，可以將66份茶樹種質分為4個類群，不同類群在CI、可可堿、咖啡堿、兒茶素總量等主要指標有明顯差異。綜合分析結果，篩選到13份CI>0.60的茶樹種質，其中有4份大于0.90（2份大于1.00）;另外，還鑒定到4份（其中有3份還具有低咖啡堿性狀）高苦茶堿茶樹種質。【結論】云南省茶樹資源的兒茶素和嘌呤生物堿多樣性豐富，變異系數(shù)大，具有豐富的遺傳多樣性;篩選到高CI、高苦茶堿、低咖啡堿等特異種質17份。

關鍵詞： 茶樹;種質資源;生化成分;兒茶素;CI值;苦茶堿;云南

中圖分類號： S571.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）03-0693-07

Biochemical component analysis and specific resource selection of 66 accessions of tea germplasms in Yunnan

LIU Yu-fei， PANG Dan-dan， JIANG Hui-bing， TIAN Yi-ping，

LI You-yong， SUN Yun-nan， CHEN Lin-bo*

（Tea Research Institute， Yunnan Academy of Agricultural Sciences/Yunnan Provincial Key Laboratory for Tea Science/ Yunnan Technology Engineering Research Center of Tea Germplasm Innovation and Supporting

Cultivation， Menghai， Yunnan? 666201， China）

Abstract：【Objective】The genetic diversity of catechins and purine alkaloids of tea germplasms in Yunnan were identified. Afterwards， the specific tea genetic resources with high catechin index（CI） values and high theacrine content were screened according to the results， which provide scientific bases for tea breeding and product development. 【Method】The predominant components of 66 representative tea germplasms in Yunnan， including catechins[（+）-gallocatechin （GC）， （?）-epigallocatechin（EGC）， （+）-catechin（C），（?）-epicatechin（EC），（?）-epigallocatechin-3-gallate（EGCG）， （?）-gallocatechin-3-gallate（GCG），（?）-epicatechin-3-gallate（ECG）]， purine alkaloids（caffeine， theobromine， and theacrine）， were detected by high efficiency liquid chromatography（HPLC）. Their genetic diversity（Shannons diversity index， H'） were performed by statistical software， principal component and cluster analysis were conducted. And the resources with high CI value and high theacrine were selected from the 66 accessions of tea germplasms. 【Result】There were abundant genetic diversity and variability of GC， EGC， C， EC， EGCG， GCG， ECG， caffeine， theobromine in 66 Yunnan tea germplasms. Among them， the genetic diversity index of EGCG was the highest（2.06）. Furthermore， the other components were greater than 1.8 except for EC and ECG. C had the largest coefficient of variation（66.07%）， while theobromine had the smallest coefficient of variation（15.68%）. Principal component analysis revealed that the cumulative contribution rate of the first five principal components presented the most of trait information as it reached 83.37%. Based on 14 biochemical components， 66 accessions of tea germplasms could be divided into four groups. And each groups had different main indicators such as CI value， theobromine， caffeine， and total catechins. A total of 13 tea germplasms with CI value greater than 0.60 were screened according to comprehensive analysis results， of which four were greater than 0.90（including two were more than 1.00）; in addition， four tea germplasms with high theacrine （including three resources with low caffeine） were also identified. 【Conclusion】Tea germplasms in Yunnan contain large variability of catechins and purine alkaloids， large variation coefficient. Therefore， they possess abundant genetic diversity. More importantly， 17 specific tea resources such as with high CI values， high theacrine， and low caffeine are selected.

Key words： tea plant（Camellia sinensis）; germplasm; biochemical component; catechin; CI value; theacrine; Yunnan

Foundation item： National Key Research and Development Program of China（2019YFD1001601）;Major Science and Technology Project of Yunnan（202002AE320001）;National Tea Industry Technology System Project（CARS-19）;Open Fund of State Key Laboratory of Yunnan Provincial Key Laboratory of Tea Science（2020YNCX004）

0 引言

【研究意義】茶葉中含有多種對人體有益的功能性成分，如兒茶素和嘌呤生物堿等。兒茶素不僅是茶葉主要的功能性成分，也是茶葉關鍵的品質成分（李大祥等，2006;薛金金，2014）。茶鮮葉的兒茶素指數(shù)（Catechin index，CI）可決定紅茶最終的茶黃素含量和質量（Kottur et al.，2010;Xu et al.，2018），而茶黃素顯著影響紅茶的品質（色、香、味），是形成紅茶湯色“亮”和“金圈”的最主要成分（宛曉春，2003）。茶葉中的嘌呤生物堿主要以咖啡堿和可可堿為主，并且常規(guī)檢測得不到苦茶堿，而苦茶中含有較高的苦茶堿（金基強等，2014）?？嗖鑹A不同于咖啡堿興奮的生理活性，其對人體有抗抑郁和促進睡眠作用（謝果等，2009）。云南地處我國西南部，是茶樹的起源中心和原產地，具有豐富的茶樹種質資源（宋維希等，2011），因此，鑒定云南茶樹種質資源，從而篩選出高CI、高苦茶堿等的特異茶樹種質，對于茶樹品種選育、產品開發(fā)，以及茶產業(yè)發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】我國具有豐富的茶樹種質多樣性，生化成分多樣性是茶樹多樣性研究的一個重點，并已有較多的研究成果。Jin等（2014）對來源于我國主要產茶區(qū)的403份茶樹種質的兒茶素進行鑒定，發(fā)現(xiàn)來自云南省的茶樹種質具有更高的多樣性，香農多樣性指數(shù)（H'）為1.87，平均變異系數(shù)（CV）為13.5%，而浙江和福建的H'和CV分別最低;另外，發(fā)現(xiàn)除云南茶樹資源的CI>0.5外，其他地區(qū)茶樹種質的CI均不足0.5。王飛權等（2015）分析42份武夷名叢茶樹種質主要品質成分，發(fā)現(xiàn)H'和變異系數(shù)分別為2.06和22.01%。王新超等（2010）對廣西98份茶樹種質的水浸出物、氨基酸、咖啡堿和茶多酚等主要生化成分進行了系統(tǒng)鑒定評價，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)茶樹種質的生化成分具有豐富的多樣性和變異，并篩選到一批適值綠茶的茶樹種質。楊興榮等（2016）、段志芬等（2020）分別對云南省野生茶樹種質和地方品種進行茶多酚及兒茶素和咖啡堿等生化成分多樣性的分析。謝文鋼等（2020）對109份四川茶樹種質的茶多酚和兒茶素等關鍵品質成分的多樣性進行了分析，并鑒定到14份高表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）的茶樹種質。李紅建等（2021）對28份國內各省份代表性品種（系）和13廣東苦茶資源的嘌呤生物堿進行分析評價，結果顯示，咖啡堿、可可堿、苦茶堿及生物堿總量的H'和變異系數(shù)分別在0.78～1.94和34.89%～191.19%，并篩選到10份生物堿含量優(yōu)異的苦茶種質。以上研究表明我國茶樹種質具有豐富的多樣性，但我國茶樹種質的整體CI較低，已成為影響我國紅茶加工過程中茶黃素含量的限制因素（Jin et al.，2014，2018）。另外，雖然苦茶在廣東、云南和福建等省份均有報道，但由于苦茶種質的稀缺性和分布區(qū)域的局限性，使得可利用的苦茶種質相對較少（王新超等，2010;Jin et al.，2014;李紅建等，2021）?！颈狙芯壳腥朦c】我國現(xiàn)階段可利用的茶樹CI較低，可利用的苦茶種質較少，且目前尚未見到以CI和苦茶堿含量為主要指標對云南茶樹種質兒茶素與嘌呤生物堿篩選鑒定的相關報道?！緮M解決的關鍵問題】對原產于云南省66份茶樹種質的兒茶素和嘌呤生物堿進行測定，對其主要成分進行遺傳多樣性分析評價，并發(fā)掘高CI、高苦茶堿的特異茶樹種質，從而為后期茶樹品種的選育以及功能性茶產品的開發(fā)提供種質材料。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

66份試驗材料均來源于云南省，并保存在國家種質大葉茶樹資源圃（勐海），其中包含37份茶（Camellia sinensis）、11份大理茶（C. taliensis）、4份禿房茶（C. gymnogyna）、2份厚軸茶（C. crassicolumn）、1份大廠茶（C. tachangensis）和11份尚未分類（C. sp.）的種質資源，具體信息見表1。

1. 2 生化成分測定

采摘春季第一輪茶樹新梢的一芽二葉120 ℃烘5 min，75 ℃烘至足干，作為生化成分測定的樣品。采用高效液相色譜法（HPLC）測定生化樣中兒茶素[沒食子兒茶素（GC）、表沒食子兒茶素（EGC）、兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、EGCG、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）]及嘌呤生物堿（咖啡堿、可可堿和苦茶堿）含量，各樣品均獨立重復3次。待測樣品的前處理及液相色譜測定條件參照Jin等（2020）的測定方法。低咖啡堿茶樹種質的篩選參見行業(yè)標準NY/T 2031—2011《農作物優(yōu)異種質資源評價規(guī)范 茶樹》（陳亮等，2011）。EC+ECG（二羥基兒茶素Dihydroxylated catechins，DRI）與EGC+EGCG（三羥基兒茶素Trihydroxylated catechins，TRI）的比值稱為CI（Jin et al.，2014）。

1. 3 統(tǒng)計分析

采用Excel 2018和SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行描述性統(tǒng)計、主成分分析、方差分析和聚類分析（采用瓦爾德法，以歐式距離為遺傳距離）。根據(jù)聚類分析的結果，將某一性狀值的總和比上對應類群的種質份數(shù)，記為某一類群某一性狀的平均值。H'計算方法參考金基強等（2014）。

2 結果與分析

2. 1 不同種質兒茶素組分分析

本研究測定了7種主要兒茶素，即EGCG、ECG、EGC、EC、GC、GCG和C，其在66份茶樹種質中的平均含量分別為65.10、28.91、16.17、7.03、3.19、8.52和1.70 mg/g（表2）。66份茶樹種質中，兒茶素總量在76.99～206.76 mg/g，其中，EGCG的含量最高，最高占兒茶數(shù)總量的71.71%，GC和C在不同種質中含量均較低。另外，EGCG、ECG、EGC和EC是兒茶素的主要成分，占兒茶素總量的79.70%以上。DRI和TRI平均含量分別為35.94和81.27 mg/g，CI的平均值為0.48（表2）。在66份茶樹種質中80.30%（53/66）的種質CI<0.60，而CI>0.60僅13份（圖1）。

由表2還可知，66份茶樹種質中，兒茶素各組分含量、兒茶素總量、DRI、TRI和CI等11個指標的變異系數(shù)在21.68%～67.07%，變異范圍較大，其中C含量的變異系數(shù)最大;11個指標的偏度均大于0，除GC、EGCG和GCG外其他成分的峰度均大于0。11個指標的H'在1.59～2.06，其中EGCG、GC和TRI的H'均較高（>2.00），EC的H'最小，為1.59。

2. 2 不同種質嘌呤生物堿組分分析

66份茶樹種質中，可可堿、咖啡堿和嘌呤生物堿總量的分布范圍在2.47～18.15、7.31～57.19和12.06～68.00 mg/g，平均含量分別為8.66、31.90和40.56 mg/g（表3）。上述3種成分的變異系數(shù)均小于40.00%，其中嘌呤生物堿總量的變異系數(shù)最小，嘌呤生物堿總量的峰度和可可堿的偏度均小于0，其他成分的峰度和偏度均大于0?？煽蓧A、咖啡堿和嘌呤生物堿總量的H'均大于1.80，分別為2.02、1.94和1.86。

2. 3 茶樹種質聚類分析

從圖2可知，以GC、EGC和咖啡堿等14個化學成分為指標，在遺傳距離為8時，將66份茶樹種質分為4個類群，分別包含26、11、6和23份種質。由表4可知，類群Ⅰ和Ⅲ種質的CI均較小，平均值小于0.40;第Ⅱ和Ⅳ類群種質具有較高的CI，平均值大于或等于0.60;第Ⅱ類群相對于其他類群具有較高的可可堿含量（平均值>10.00 mg/g）;第Ⅲ類群的咖啡堿含量、嘌呤生物堿總量、TRI和兒茶素總量均較高;第Ⅳ類群的咖啡堿含量相對于其他類群較低，平均值小于30.00 mg/g。

2. 4 主成分分析

對66份茶樹種質的14個生化成分進行主成分分析，提取特征值大于1的主成分，將14個性狀簡化為5個主成分，累積貢獻率大于80%，其包含14個性狀指標的絕大部分信息。如表5所示，第1主成分的特征值和貢獻率分別為4.81和34.33%，在其特征向量中，載荷系數(shù)較高且為正值的性狀有兒茶素總量、TRI、咖啡堿、EGCG含量和嘌呤生物堿總量，載荷系數(shù)均大于0.80;第2主成分的特征值為2.84，貢獻率為20.25%，在其特征向量中，載荷系數(shù)較高且為正值的性狀有CI、DRI、EC和ECG含量，載荷系數(shù)均大于0.60;第3主成分的特征值為1.59，貢獻率為11.33%，在其特征向量中，載荷系數(shù)較高且為正值的性狀有GC、可可堿和GCG含量，載荷系數(shù)均大于0.55;第4主成分的特征值為1.34，貢獻率為9.60%，在其特征向量中，載荷系數(shù)較高且為正值的性狀有EGC和EC含量，載荷系數(shù)均大于0.60;第5主成分的特征值為1.10，貢獻率為7.86%，在其特征向量中，載荷系數(shù)較高且為正值的性狀有C、GCG含量和嘌呤生物堿總量，載荷系數(shù)均大于0.50。

2. 5 特異種質資源篩選

CI可作為評價紅茶適制性的一個指標，較高的CI有利于紅茶關鍵品質成分茶黃素的形成。在66份茶樹種質中，13份種質的CI大于0.60，其中4份大于0.90、2份大于1.00。另外，還鑒定出3份低咖啡堿茶樹種質（M22、M23和M24），其咖啡堿含量小于15.00 mg/g，且其還具有高苦茶堿（均大于19.00 mg/g）的生物學性狀（表6）。同理，M26也是一份高苦茶堿的茶樹種質，但其咖啡堿含量大于15.00 mg/g。

3 討論

茶樹屬于山茶科山茶屬茶組植物，其自交不親和性及長期的異花授粉導致茶樹種質資源極其豐富的多樣性（陳亮等，2006）。云南是茶樹的起源中心和原產地，也是世界上茶組植物種類最多、分布最廣的地區(qū)，世界上已發(fā)現(xiàn)的茶組植物絕大部分分布在該地區(qū)（宋維希等，2011）。楊興榮等（2016）、段志芬等（2020）研究均指出，云南茶樹種質資源兒茶素和生物堿等生化成分具有不同程度的變異，且發(fā)現(xiàn)兒茶素組分有較大的變異系數(shù)（13.1%～60.2%）。Jin等（2014）對我國主要產茶區(qū)的403份（其中46份來源于云南）茶樹種質進行兒茶素總量多樣性和變異系數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)云南茶樹種質具有最高的多樣性（H'=1.89）和變異系數(shù)（15.6%）。本研究測定的兒茶素相關指標的變異系數(shù)也較大，范圍在21.68%～67.07%，且兒茶素總量的H'（1.83）與Jin等（2014）的研究結果相近，但本研究兒茶素總量的變異系數(shù)（21.68）較大，可能是由于選擇的樣品來源地和樣品數(shù)量等原因引起了差異。因此，對于茶樹兒茶素等多樣性的分析，需盡可能地收集較多的不同地區(qū)的代表性種質樣品。另外，本研究測定的嘌呤生物堿變異系數(shù)順序依次為嘌呤生物堿總量<咖啡堿<可可堿，該結果與金基強等（2014）對403份茶樹種質嘌呤生物堿的分析結果相同。

兒茶素是茶葉的關鍵品質和功能性成分，其中EGCG、ECG、EGC和EC是主要的兒茶素成分，CI可決定紅茶最終的茶黃素含量和質量，較高CI有利于茶黃素的形成（Jin et al.，2014）。Jin等（2014）等對我國主要產茶區(qū)的403份茶樹種質的CI值進行測定，其中云南省茶樹CI均值最高，約為0.53，其他地區(qū)的CI均值不足0.5;Jin等（2014，2018）指出我國茶樹資源的整體CI值較低，其已成為影響我國紅茶加工過程中茶黃素含量的限制因素。本研究鑒定的66份云南茶樹種質資源的CI均值為0.48，低于Jin等（2014）測定的云南茶樹種質資源的CI均值，可能與樣品的來源有關，但與Jin等（2014）得出的云南CI均值較高的結果相符。另外，在66份茶樹種質中，80%種質的CI≤0.60，13份種質的CI>0.60，2份種質的CI>1.00，這些種質為研究茶樹高CI的分子提供了有利材料，也為培育高CI、高茶黃素的茶樹品種提供了可利用的親本。

苦茶堿具有促進睡眠和抗抑郁作用，且毒理試驗表明其無毒副作用（Xu et al.，2007;謝果等，2009）。因此，富含苦茶堿的種質，在功能性茶樹品種和茶產品的開發(fā)中具有重要作用。本研究的66份茶樹種質中，僅在來源于云南景洪的資源中鑒定到4份富含苦茶堿的種質材料，與苦茶種質分布具有區(qū)域性及可利用得資源較少相符（王新超等，2008）。本研究挖掘到的4份苦茶種質為今后苦茶堿合成的遺傳機制，以及富含苦茶堿茶樹品種的培育提供了可以利用的基礎材料。

4 結論

云南省茶樹資源的兒茶素和嘌呤生物堿多樣性豐富，多數(shù)成分的變異系數(shù)大，具有豐富的遺傳多樣性。本研究篩選到13份茶樹種質的CI>0.60，其中4份種質的CI>0.90，2份種質的CI>1.00;另外，鑒定到3份低咖啡堿高苦茶堿和1份高苦茶堿正?？Х葔A含量的茶樹種質。上述特異資源可作為茶樹的遺傳育種和茶產品開發(fā)的基礎材料。

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（責任編輯 鄧慧靈）