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    BALB/c小鼠陰虛型過敏性哮喘模型的建立與評價(jià)

    2016-12-03 11:07:02王志旺妥海燕任遠(yuǎn)李榮科劉雪楓程小麗
    中國中醫(yī)藥信息雜志 2016年9期
    關(guān)鍵詞:動(dòng)物模型

    王志旺 妥海燕 任遠(yuǎn) 李榮科 劉雪楓 程小麗

    摘要:目的 建立BALB/c小鼠陰虛型過敏性哮喘模型并進(jìn)行評價(jià)。方法 采用腹腔注射與皮下注射卵清白蛋白(OVA)致敏、霧化吸入OVA激發(fā)的方法復(fù)制過敏性哮喘BALB/c小鼠模型,激發(fā)后期合并灌胃甲狀腺素復(fù)制陰虛型過敏性哮喘模型。在監(jiān)測飲食、飲水及體質(zhì)量的基礎(chǔ)上,對支氣管激發(fā)過程中哮喘行為學(xué)、肺功能及肺組織病理學(xué)等哮喘相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行觀測,同時(shí)對cAMP、cGMP及肺液清除功能等陰虛證相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行考察。結(jié)果 陰虛哮喘模型組小鼠出現(xiàn)明顯的哮喘癥狀,哮喘行為學(xué)綜合評分明顯升高,吸氣峰流量、呼氣峰流量、潮氣量明顯下降,呼吸頻率增加,肺組織病理學(xué)可見明顯的炎癥反應(yīng);同時(shí),陰虛哮喘模型組小鼠進(jìn)食與飲水量明顯增加,而體質(zhì)量增長緩慢,肺組織濕重/干重比值下降,血清cAMP及cAMP/cGMP升高,cGMP下降,顯示小鼠處于陰虛而陽相對亢盛的狀態(tài)。結(jié)論 在OVA致敏、激發(fā)的基礎(chǔ)上給予甲狀腺素,可成功復(fù)制BALB/c小鼠陰虛型過敏性哮喘模型。

    關(guān)鍵詞:陰虛型過敏性哮喘;動(dòng)物模型;BALB/c小鼠

    DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2016.09.015

    中圖分類號:R228;R259.622.5;R332 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:1005-5304(2016)09-0061-04

    Establishment and Evaluation of BALB/c Mouse Model of Anaphylactic Asthma with Yin-deficiency Syndrome WANG Zhi-wang1,2, TUO Hai-yan1, REN Yuan1,2, LI Rong-ke1, LIU Xue-feng1, CHENG Xiao-li1 (1. Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China; 2. Key Laboratory of Pharmacology and Toxicology for TCM of Gansu Province, Lanzhou 730000, China)

    Abstract: Objective To establish and evaluate a BALB/c mouse model of anaphylactic asthma with yin-deficiency syndrome. Methods Ovalbumin (OVA) was injected to sensitize and was inhaled to stimulate to replicate the BALB/c mouse model of anaphylactic asthma. Thyroxin was used for gavage during late stimulation to replicate the BALB/c mouse model of asthma with yin-deficiency syndrome. On the basis of monitoring food and water intake and body weight, asthma related indexes, such as asthmatic behaviors, respiratory function, lung histopathology, were detected, and yin-deficiency syndrome related indexes, such as cAMP and cGMP, and pulmonary fluid clearance were examined. Results The BALB/c mouse model of asthma with yin-deficiency syndrome showed obvious asthma symptoms; comprehensive scores of asthmatic behaviors increased significantly; inhaling peak flow, exsufflation peak flow, and tidal volume decreased significantly; lung tissue histopathology showed obvious inflammatory response. Meanwhile, food and water intake of BALB/c mouse model of asthma with yin-deficiency syndrome increased significantly; body weight increased slowly; wet/dry ratio of lung tissue decreased; cAMP and cAMP/cGMP increased, while cGMP decreased, which showed that the mice were in the condition of yin-deficiency and yang-excess. Conclusion Combining thyroxin at the basis of sensitivity induced by OVA is a good pattern to successfully replicate the BALB/c mouse model of anaphylactic asthma with yin-deficiency syndrome.

    Key words: anaphylactic asthma with yin-deficiency syndrome; animal model; BALB/c mice

    近年來,隨著環(huán)境污染與過敏體質(zhì)人群的增加,過敏性哮喘(以下簡稱“哮喘”)的發(fā)病率明顯增加[1];另一方面,隨著社會觀念的變化,偏瘦體質(zhì)的人(特

    基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金(81460668);甘肅省自然科學(xué)基金(1310RJZA086)

    別是女性)越來越多,導(dǎo)致陰虛質(zhì)偏頗體質(zhì)人群迅速增加[2]。本實(shí)驗(yàn)對陰虛型過敏性哮喘模型展開研究,為該動(dòng)物模型的建立及其評價(jià)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1 動(dòng)物

    SPF級雌性BALB/c小鼠48只,6~8周齡,體質(zhì)量16~20 g,蘭州獸醫(yī)研究所,動(dòng)物許可證號62000600000082。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)施使用號00000115。

    1.2 藥物、試劑與儀器

    甲狀腺片,山東中泰藥業(yè)有限公司,批號14080303。卵清白蛋白(OVA)、氯化乙酰膽堿、組胺,Sigma公司;cAMP、cGMP ELISA測試盒,成都光??萍加邢薰荆粴溲趸X,天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司。402AI型超聲霧化器,江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司;鼻部暴露/全身暴露吸入染毒系統(tǒng),CH Technologies;EMKA型動(dòng)物肺功能檢測系統(tǒng),北京廣源達(dá)科技發(fā)展有限公司;TGL-16G型高速冷凍離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠;722型分光光度計(jì),上海第三分析儀器廠;BI-2000型醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng),成都泰盟科技有限公司。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 分組、造模與給藥

    實(shí)驗(yàn)小鼠按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為正常組、陰虛模型組、哮喘模型組和陰虛哮喘模型組,每組12只。自由進(jìn)食飲水,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

    實(shí)驗(yàn)第1日開始致敏,即哮喘模型組、陰虛哮喘模型組小鼠每只腹腔注射配制的新鮮致敏液(OVA 100 μg+氫氧化鋁3 mg生理鹽水混懸液)0.2 mL,同時(shí)背部皮下注射等量致敏液,正常組與陰虛模型組以生理鹽水代替致敏液;第8日同法再致敏1次。第15日開始激發(fā),將小鼠置于暴露系統(tǒng)中,加入激發(fā)液(1%OVA),調(diào)節(jié)霧化速度至2 mL/min,使小鼠均勻吸入激發(fā)液20 min,隔日1次,連續(xù)28 d,正常組與陰虛模型組以生理鹽水代替激發(fā)液[3-4]。第29日開始,陰虛模型組與陰虛哮喘模型組小鼠給予甲狀腺片藥液120 mg/kg(用0.5%黃原膠助懸)灌胃,正常組與哮喘模型組給予生理鹽水20 mL/kg灌胃,1次/d,連續(xù)14 d[5]。

    2.2 指標(biāo)觀察

    2.2.1 一般狀況 觀測動(dòng)物體質(zhì)量、呼吸、飲食、飲水等。

    2.2.2 支氣管激發(fā)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)第28、42日進(jìn)行支氣管激發(fā)實(shí)驗(yàn)。配制含0.2%組胺與2%乙酰膽堿的混合激發(fā)液,在暴露系統(tǒng)中按2 mL/min霧化,小鼠吸入120 s。從霧化吸入開始觀察10 min內(nèi)小鼠抓鼻、撓癢及哮喘發(fā)作癥狀等哮喘行為學(xué)指標(biāo)并評分:無抓鼻或撓癢動(dòng)作計(jì)0分,抓鼻或撓癢出現(xiàn)1~3次計(jì)1分,4~6次計(jì)2分,7次及以上計(jì)3分;小鼠無哮喘癥狀計(jì)0分,出現(xiàn)輕微哮喘癥狀計(jì)3分,出現(xiàn)呼吸急促、或呼吸頻率明顯加快或焦躁不安等哮喘癥狀計(jì)6分,出現(xiàn)嚴(yán)重呼吸困難如急促點(diǎn)頭、腹式呼吸等哮喘癥狀計(jì)9分[6]。

    2.2.3 肺功能檢測 實(shí)驗(yàn)第42日,將小鼠置于肺功能檢測系統(tǒng)中,啟動(dòng)系統(tǒng),在時(shí)間與事件模式下測定小鼠肺功能。

    2.2.4 離體指標(biāo)測定 實(shí)驗(yàn)第43日,麻醉小鼠,摘眼球取血,分離血清,測定cAMP、cGMP水平。斷頸處死,小鼠摘取肺臟,于固定位置取肺組織2份。第1份經(jīng)固定、切片、HE染色,鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化,對支氣管壁炎性細(xì)胞浸潤程度進(jìn)行半定量分析[7-8];第2份準(zhǔn)確稱量濕重,充分干燥至衡重后稱取干重,計(jì)算濕重/干重比值。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以—x±s表示,組間比較采用方差分析,等級資料采用Ridit分析,計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    4 結(jié)果

    4.1 陰虛哮喘小鼠進(jìn)食量、飲水量及體質(zhì)量變化

    正常組小鼠實(shí)驗(yàn)過程中飲食飲水無明顯變化,體質(zhì)量正常增長;與正常組比較,陰虛模型組和陰虛哮喘模型組小鼠第42日進(jìn)食量、飲水量明顯增加(P<0.05,P<0.01),但體質(zhì)量增長緩慢,顯示出多飲多食、代謝水平升高等陰虛證的癥狀;哮喘模型組小鼠飲水量明顯增加(P<0.05);提示陰虛與哮喘均可使飲水量增加,哮喘模型小鼠飲水量增加的原因可能與哮喘咳嗽、咽干口燥而致飲水增加有關(guān)。結(jié)果見表1、表2。

    4.2 陰虛哮喘小鼠血清cAMP、cGMP及其比值變化

    與正常組比較,哮喘模型組、陰虛哮喘模型組吸入混合激發(fā)液后哮喘行為學(xué)綜合評分顯著升高,哮喘動(dòng)物數(shù)明顯增加(P<0.01),而陰虛模型組未出現(xiàn)明顯異常。結(jié)果見表4。

    陰虛哮喘小鼠肺通氣變化

    結(jié)合動(dòng)物肺功能儀檢測指標(biāo),本實(shí)驗(yàn)對哮喘小鼠吸氣峰流量(PIF)、呼氣峰流量(PEF)、潮氣量(TV)與呼吸頻率(F)等肺功能指標(biāo)進(jìn)行檢測。與正常組比較,哮喘模型組、陰虛哮喘模型組小鼠PIF、PEF、TV顯著下降,而F顯著升高(P<0.01)。結(jié)果見表5。

    4.5 陰虛哮喘小鼠肺液清除功能變化

    本實(shí)驗(yàn)在復(fù)制慢性哮喘模型過程中,哮喘模型組、陰虛哮喘模型組小鼠肺組織濕重/干重比值顯著下降,與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),陰虛模型組小鼠肺組織濕重/干重比值有一定的下降趨勢,但與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表6。

    4.6 陰虛哮喘小鼠肺組織病理學(xué)變化

    正常組和陰虛模型組炎癥反應(yīng)不明顯,哮喘模型組和陰虛哮喘模型組小鼠肺組織可見支氣管上皮細(xì)胞腫脹、部分脫落,基底膜增生、變厚,支氣管壁充血、腫脹并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤,見圖1。小鼠支氣管壁炎性細(xì)胞浸潤程度結(jié)果顯示,與正常組比較,哮喘模型組和陰虛哮喘模型組小鼠支氣管壁炎性細(xì)胞浸潤程度明顯加重(P<0.01),見表7。

    5 討論

    中醫(yī)陰虛模型的復(fù)制方法比較多,但造模簡單可控的當(dāng)屬甲狀腺素法與糖皮質(zhì)激素法[9],而糖皮質(zhì)激素屬于常用的治療哮喘的藥物,因此,在復(fù)制陰虛哮喘模型時(shí),甲狀腺素法是復(fù)制陰虛證較適宜的方法。目前,國內(nèi)外復(fù)制哮喘模型最常用的方法為OVA法,即采用OVA通過致敏與激發(fā)兩步來復(fù)制哮喘動(dòng)物模型[10]。本實(shí)驗(yàn)基于文獻(xiàn)及前期研究,采用腹腔注射與皮下注射OVA致敏2周、超聲霧化吸入OVA激發(fā)4周復(fù)制哮喘模型,在此基礎(chǔ)上采用甲狀腺素灌胃復(fù)制陰虛哮喘小鼠模型。造模藥物劑量選擇方面,OVA采用最適宜的劑量,復(fù)制出典型的哮喘模型;但考慮到動(dòng)物的承受能力,特別是陰虛哮喘小鼠體質(zhì)量增長緩慢、死亡率明顯上升等因素,甲狀腺素劑量降為120 mg/kg。

    中西醫(yī)結(jié)合病證模型的評價(jià)方面,既要考慮基于病理學(xué)對疾病全過程認(rèn)識的病,又要考慮基于癥候群對疾病現(xiàn)階段認(rèn)識的證,同時(shí)要結(jié)合現(xiàn)代研究的最新成果[11]。三大營養(yǎng)物質(zhì)與水液代謝是生命活動(dòng)的基礎(chǔ),陰虛是指機(jī)體精血津液(物質(zhì))不足與陽(功能)相對亢盛的病理狀態(tài)。本研究從小鼠的進(jìn)食量與飲水量、體質(zhì)量、肺液清除功能等方面評價(jià)陰虛證模型的物質(zhì)代謝水平,從cAMP、cGMP及其平衡方面評價(jià)機(jī)體機(jī)能虛性亢奮的病理狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,陰虛哮喘小鼠進(jìn)食量、飲水量明顯增加,而體質(zhì)量增長緩慢,提示模型小鼠基礎(chǔ)代謝率明顯上升,出現(xiàn)“多飲、多食、少肉”的典型陰虛癥狀;血清cAMP及cAMP/cGMP升高、cGMP下降表明機(jī)體處于陰虛而陽相對亢盛的狀態(tài);而肺組織濕重/干重比值下降顯示肺臟處于精血津液不足的虛損狀態(tài)。

    藥理學(xué)評價(jià)主要由藥理作用與作用機(jī)制2個(gè)方面組成,而對動(dòng)物模型的評價(jià)則更應(yīng)側(cè)重于藥理作用,即對病證癥狀的影響。作為哮喘病,痰、咳、喘是臨床最常見的癥狀,也是評價(jià)哮喘模型的最基礎(chǔ)指標(biāo),但小鼠咳嗽聲音太小而不易察覺,痰液難以量化,唯有哮喘引起的癥狀有明顯特征而易于量化。哮喘可引發(fā)呼吸異常,如呼吸急促甚至呼吸伴有點(diǎn)頭、腹式呼吸等,以及缺氧而引發(fā)的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀如焦躁不安、直立靜坐或急促爬刨墊料等異常行為。采用OVA復(fù)制的哮喘屬于過敏性哮喘,動(dòng)物會出現(xiàn)鼻腔與皮膚發(fā)癢。因此,抓鼻、撓癢也屬于易量化的指標(biāo)。本研究對小鼠抓鼻、撓癢及哮喘發(fā)作癥狀等哮喘行為學(xué)指標(biāo)進(jìn)行評價(jià),結(jié)果顯示陰虛哮喘模型小鼠哮喘等行為學(xué)指標(biāo)評分出現(xiàn)明顯的變化。肺功能與肺組織病理學(xué)是反映肺臟功能與結(jié)構(gòu)的最直接指標(biāo),本研究對肺功能指標(biāo)PIF、PEF、TV與F進(jìn)行考察,結(jié)果提示陰虛哮喘小鼠的肺功能明顯下降;病理結(jié)果顯示,陰虛哮喘小鼠肺組織出現(xiàn)一定的病理學(xué)變化,而支氣管壁炎性細(xì)胞浸潤程度明顯加重。

    綜上,在OVA復(fù)制哮喘模型的基礎(chǔ)上,采用甲狀腺素復(fù)制陰虛哮喘BALB/c小鼠模型,該造模方法簡便、觀測指標(biāo)變化明顯且符合西醫(yī)對病的診斷和中醫(yī)對證候的認(rèn)識特點(diǎn),為研究陰虛哮喘的本質(zhì)及平喘藥物的作用機(jī)制提供了較為理想的動(dòng)物模型。

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