封閉抗體陰性的反復(fù)自然流產(chǎn)患者采用配偶淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療效果觀察

王欣，李培旭

(解放軍150醫(yī)院婦產(chǎn)科，洛陽 471003)

?

封閉抗體陰性的反復(fù)自然流產(chǎn)患者采用配偶淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療效果觀察

王欣，李培旭*

(解放軍150醫(yī)院婦產(chǎn)科，洛陽 471003)

目的 觀察配偶淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療封閉抗體陰性的反復(fù)自然流產(chǎn)的效果。 方法 收集2010年1月至2015年1月于我院行封閉抗體陰性的經(jīng)治療后獲得首次妊娠的反復(fù)自然流產(chǎn)患者97例，依據(jù)不同治療方法分為研究組76例和對(duì)照組21例。研究組采用丈夫外周血淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療后觀察封閉抗體的變化，對(duì)照組采用小劑量免疫抑制劑等治療，比較兩組治療后首次妊娠的結(jié)局。 結(jié)果 研究組76例孕婦，妊娠成功51例，妊娠成功率67.11%；對(duì)照組21例孕婦，妊娠成功8例，妊娠成功率38.10%。研究組妊娠成功率顯著高于對(duì)照組妊娠成功率(P<0.05)。研究組76例免疫治療后復(fù)查封閉抗體，27例轉(zhuǎn)陽性孕婦19例妊娠成功，妊娠成功率70.37%，49例仍陰性孕婦32例妊娠成功，妊娠成功率為65.31%；兩者比較妊娠成功率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)論 免疫治療可顯著提高反復(fù)自然流產(chǎn)患者的妊娠成功率，封閉抗體轉(zhuǎn)陽只是其紛繁復(fù)雜的機(jī)理之一。

反復(fù)自然流產(chǎn)； 封閉抗體； 免疫治療

Methods：The data of 97 patients with recurrent spontaneous abortion & negative anti-paternal lymphocyte antibody who received their first pregnancy in our hospital from Jan.2010 to Jan.2015 were collected.The patients were divided to two groups：the patients in the study group were treated with paternal lymphocyte(n=76)，and the patients in control group were treated with small doses of immunosuppressants(n=21).The first pregnant outcomes were compared between the two groups.

Results：The pregnancy rate(67.11% vs.38.10%)of the study group is significantly higher than that of the control group(P<0.05).In the studying group，the pregnancy rate(70.37%)in 27 patients whose APLA turned positive was higher than that(65.31%)in 49 patients whose APLA was still negative after immunotherapy(P>0.05).

Conclusions：The pregnancy rate is significantly increased after immunotherapy with paternal lymphocyte；but the results are not always consistent with the changes in APLA.

(JReprodMed2016，25(11)：998-1001)

自然流產(chǎn)是指妊娠20周以前或者胎兒體重小于450克，或在獲得有生機(jī)兒之前的自然流產(chǎn)或胚胎宮內(nèi)停止發(fā)育；反復(fù)自然流產(chǎn)(RSA)是指連續(xù)2次及以上發(fā)生自然流產(chǎn)[1]。收集我院近5年因反復(fù)自然流產(chǎn)就診、經(jīng)臨床檢查排除生殖器官器質(zhì)性病變、染色體異常、黃體功能不足、動(dòng)靜血栓前狀態(tài)等，封閉抗體(APLA)檢測(cè)結(jié)果為陰性、經(jīng)過小劑量免疫抑制劑治療或者丈夫外周血淋巴細(xì)胞免疫治療(immunotherapy)后獲得首次妊娠的患者97例，根據(jù)治療方法不同分為兩組：研究組(76例)采用配偶淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療；對(duì)照組(21例)采用小劑量免疫抑制劑等治療，結(jié)果報(bào)告如下。本研究通過分析兩組患者治療后妊娠結(jié)局及封閉抗體轉(zhuǎn)陽情況，旨在探尋新的臨床RSA患者進(jìn)行淋巴免疫治療后療效評(píng)價(jià)和妊娠預(yù)后判斷的參考指標(biāo)。

材料與方法

一、臨床資料

收集我院2010年1月至2015年1月因兩次及以上自然流產(chǎn)就診的重復(fù)流產(chǎn)患者97例，經(jīng)臨床檢查排除生殖器官器質(zhì)性病變、染色體異常、黃體功能不足、動(dòng)靜血栓前狀態(tài)等，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)封閉抗體為陰性經(jīng)治療后獲得首次宮內(nèi)妊娠，年齡20～32歲、平均(25.60±5.95)歲，流產(chǎn)2～6次、平均(3.75±1.88)次。臨床詳細(xì)詢問患者每次流產(chǎn)的情況：包括孕周、出血、腹痛、尿及血HCG、彩色多普勒超聲檢查等，以確認(rèn)妊娠和流產(chǎn)的診斷成立，并且無淋巴細(xì)胞免疫治療史及輸血史。常規(guī)檢查：①男方精液正常且無淋球菌、支原體、衣原體感染；②夫妻雙方染色體正常且Rh血型陽性、雙方血常規(guī)和血紅蛋白正常、雙方艾滋病和梅毒篩查陰性；③女方常規(guī)婦科及彩色多普勒超聲檢查或子宮輸卵管造影檢查排除子宮及宮頸畸形，宮頸管陰道內(nèi)無滴蟲、霉菌、淋球菌、支原體、衣原體感染，自身免疫性抗體抗心磷脂抗體、抗子宮內(nèi)膜抗體、抗β2-糖蛋白1抗體均陰性，內(nèi)分泌激素正常，凝血四項(xiàng)及血脂四項(xiàng)正常，不孕及優(yōu)生抗體全套篩查陰性。

二、實(shí)驗(yàn)方法

對(duì)照組21例，皆因丈夫乙型或丙型肝炎病毒感染或攜帶，不宜采用其血液分離淋巴細(xì)胞給妻子做免疫治療的患者，從試孕前6周開始每日口服強(qiáng)的松5 mg(浙江仙琚制藥)+腸溶阿司匹林25 mg(石家莊歐意藥業(yè))+維生素E 100 mg(浙江醫(yī)藥)，直至妊娠滿36周止，每一月查血小板計(jì)數(shù)、凝血功能及纖溶指標(biāo)；研究組76例，簽署淋巴免疫治療知情同意書，于試孕前6周開始，取丈夫肘靜脈空腹血20 ml，加入適量肝素鈉溶液(2 ml，12 500 U，上海第一生化藥業(yè))防止血液凝固，將血液用生理鹽水按1∶1的比例稀釋；在4根無菌離心試管底部加入3 ml淋巴細(xì)胞分離液(天津市灝洋生物制品)，再將稀釋均勻的血液平均加入到這4根離心管中使其兩兩平衡，并保持血液和淋巴細(xì)胞分離液形成的界面清晰；將離心管平衡放入離心機(jī)內(nèi)以2 000 r/min的速度離心20 min，集中4根離心管中的淋巴細(xì)胞到清潔無菌的離心管內(nèi)，加入10 ml生理鹽水以2 000 r/min的速度離心10 min，去上清液；反復(fù)生理鹽水洗滌淋巴細(xì)胞3次，調(diào)整懸液淋巴細(xì)胞濃度到2x108個(gè)/ml；于妻子前臂內(nèi)側(cè)行皮內(nèi)注射，每個(gè)點(diǎn)約0.2 ml，共6個(gè)點(diǎn)。間隔兩周重復(fù)1次共3次；第3次治療后兩周酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)復(fù)查封閉抗體，同時(shí)安排試孕，待確定懷孕后重復(fù)上述免疫治療1次。

三、觀察指標(biāo)

觀察淋巴細(xì)胞免疫治療后APLA的表達(dá)情況、妊娠結(jié)局；妊娠成功評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：妊娠超過28周且B超提示胎兒宮內(nèi)發(fā)育良好，包括早產(chǎn)及妊娠足月分娩。

APLA的檢測(cè)：每例研究對(duì)象抽取外周靜脈血3 ml，離心析出血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA，萊姆德，美國)進(jìn)行血清APLA的檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行操作。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、對(duì)照組與研究組一般情況比較

比較兩組患者年齡、流產(chǎn)次數(shù)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。對(duì)照組21例患者服藥期間無不良反應(yīng)，研究組有3例患者治療期間注射部位偶感瘙癢。

二、兩組妊娠成功率比較

對(duì)照組和研究組妊娠成功率比較：對(duì)照組21例孕婦，妊娠不成功13例，10例再次發(fā)生自然流產(chǎn)，3例胚胎停止發(fā)育；妊娠成功8例，其中7例妊娠至足月順利分娩存活新生兒，1例合并妊娠高血壓疾病重度子癇，孕36周行剖宮產(chǎn)術(shù)新生兒存活，妊娠成功率為38.10%。研究組76例孕婦，妊娠不成功25例，15例再次自然流產(chǎn)，10例胚胎停止發(fā)育；妊娠成功51例，其中50例妊娠至足月順利分娩存活新生兒(其中1例胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限)，1例早產(chǎn)，妊娠成功率67.11%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示免疫治療顯著提高了反復(fù)自然流產(chǎn)患者的妊娠成功率(表2)。

表1 兩組一般資料比較(x-±s)

注：與對(duì)照組比較，P>0.05

表2 兩組妊娠成功率比較[n(%)]

注：與對(duì)照組比較，P<0.05

三、研究組免疫治療后封閉抗體的變化

研究組76例免疫治療后復(fù)查封閉抗體，27例轉(zhuǎn)陽性孕婦中5例再次自然流產(chǎn)，3例胚胎停止發(fā)育，19例妊娠足月順利分娩存活新生兒，妊娠成功率70.37%，49例仍陰性孕婦中10例再次自然流產(chǎn)，7例胚胎停止發(fā)育，31例妊娠足月順利分娩存活新生兒(其中1例胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限)，1例早產(chǎn)，妊娠成功率為65.31%；兩者比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P> 0.05)。提示免疫治療能顯著提高反復(fù)自然流產(chǎn)患者的妊娠成功率，但并不一定能使封閉抗體轉(zhuǎn)陽。

討 論

反復(fù)自然流產(chǎn)的病因很多，目前已經(jīng)明確的病因包括：染色體異常、生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)異常、黃體功能不足、抗磷脂抗體綜合征、動(dòng)靜脈血栓前狀態(tài)、甲狀腺功能低下及感染等因素，但仍約有50%～70%的患者病因不明，稱為原因不明性復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(URSA)[2]，病因可能主要與免疫因素造成封閉抗體缺乏有關(guān)[3-4]。人類白細(xì)胞抗原(HLA)、滋養(yǎng)層及淋巴細(xì)胞交叉反應(yīng)抗原(TLX)等對(duì)母體免疫系統(tǒng)發(fā)生刺激所產(chǎn)生的一類IgG抗體稱為封閉抗體[5]。Taylor等[6]首次報(bào)導(dǎo)淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)并獲得了81.5%以上的活嬰出生率。淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的療效近年來已得到肯定，國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道其有效率可達(dá)70%～90%[7]，楊章莉等[8]報(bào)道淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫聯(lián)合地屈孕酮治療封閉抗體陰性所致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者妊娠成功率高(83.3%)，陳建玲[9]通過對(duì)380例淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫療法治療不明原因的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)療效觀察，認(rèn)為該方案治療不明原因的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)有效率為89.7%。本研究結(jié)果研究組76例孕婦，妊娠成功51例，妊娠成功率67.11%；對(duì)照組21例孕婦，妊娠成功8例，妊娠成功率38.10%；兩者比較，研究組妊娠成功率顯著高于對(duì)照組妊娠成功率(P<0.05)；且研究組復(fù)查封閉抗體，27例轉(zhuǎn)陽性孕婦獲得19例妊娠成功，妊娠成功率70.37%，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，說明淋巴主動(dòng)免疫治療確能提高封閉抗體陰性所致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的妊娠成功率。本研究把孕前經(jīng)3次淋巴免疫治療APLA仍陰性的反復(fù)自然流產(chǎn)患者仍作為一部分觀察對(duì)象，不管淋巴免疫治療后APLA為陽性或陰性，這是本研究與其他同類研究選取淋巴免疫治療后復(fù)查APLA陽性的有復(fù)發(fā)流產(chǎn)病史患者為研究對(duì)象的不同之處。

淋巴免疫治療(LIT)治療機(jī)制：1、主要是將外源體淋巴細(xì)胞注射到患者體內(nèi)，從而對(duì)患者的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生刺激，誘導(dǎo)產(chǎn)生APLA，當(dāng)其再次妊娠時(shí)，APLA抗體就能識(shí)別胚胎上來自配偶的抗原，并與之結(jié)合，繼而產(chǎn)生封閉作用，可使胚胎得到保護(hù)并生長(zhǎng)；2、可改變不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者外周血T細(xì)胞的功能，降低Th1/Th2比值，使患者處于以Th2為主的免疫狀態(tài)而有利于成功妊娠[10]。Th1和Th2細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞的兩個(gè)亞群，Th1細(xì)胞的作用為分泌TNF-α，IFN-γ和IL-2等促炎因子參與移植排斥反應(yīng)，而TH2細(xì)胞分泌的IL-10和IL-13等抑炎因子可以誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)移植物的耐受，正常妊娠中Th1細(xì)胞比例降低而Th2細(xì)胞比例上升。3、妊娠中外周血NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性調(diào)節(jié)就是妊娠成功與否的關(guān)鍵[11-12]，LIT能降低NK細(xì)胞活性，保護(hù)細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞免受NK細(xì)胞損傷。目前對(duì)LIT機(jī)制的探討主要集中在“封閉抗體”、Th1/Th2平衡、NK細(xì)胞活性等方面，研究認(rèn)為L(zhǎng)IT治療能夠糾正母胎界面紊亂的免疫反應(yīng)[13]，維持正常妊娠。

本研究結(jié)果顯示研究組76例免疫治療后復(fù)查封閉抗體，27例轉(zhuǎn)陽性孕婦獲得19例妊娠成功，妊娠成功率70.37%，49例未轉(zhuǎn)陽性孕婦獲得32例妊娠成功，妊娠成功率為65.31%；兩者比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；提示淋巴免疫治療能顯著提高復(fù)發(fā)流產(chǎn)患者的妊娠成功率，但并不一定能使封閉抗體轉(zhuǎn)陽。由此可見淋巴免疫治療提高妊娠成功率的機(jī)理應(yīng)該極其復(fù)雜，使能夠被檢測(cè)的封閉抗體轉(zhuǎn)陽只是其機(jī)理之一；這也是不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的復(fù)雜性所決定的。目前臨床上對(duì)于RSA的診斷和治療監(jiān)測(cè)主要是通過ELISA法檢測(cè)母體血液中是否含有足量的抗混合HLA抗體[14-17]，由于封閉抗體的復(fù)雜性和多樣性，目前還無法對(duì)各種封閉抗體進(jìn)行全面、準(zhǔn)確、快速的定量檢測(cè)，因此封閉抗體的檢測(cè)具有難把握性，所以也就無法全面反映免疫治療的效果。妊娠是復(fù)雜的，不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是更復(fù)雜的，不是單純封閉抗體缺乏都能解釋的，是否有其他的指標(biāo)可以明確評(píng)價(jià)淋巴免疫治療后效果，有待于我們進(jìn)一步去探索。

綜上所述，免疫治療可顯著提高反復(fù)流產(chǎn)患者的妊娠成功率，封閉抗體轉(zhuǎn)陽只是其紛繁復(fù)雜的機(jī)理之一。

[1] Saravelos SH，Regan L.Unexplained recurrent pregnancy loss [J].Obstet Gynecol Clin North Am，2014，41：157-166.

[2] Toth B，Jeschke U，Rogenhofer N，et al. Recurrent miscarriage：current concepts in diagnosis and treatment[J].J Reprod Immunol，2010，85：25-32.

[3] Alkhuriji AF，Alhimaidi AR，Babay ZA，et al. The relationship between cytokine gene polymorphism and unexplained recurrent spontaneous abortion in Saudi females [J].Saudi Med J，2013，34：484-489.

[4] Karami N，Boroujerdnia MG，Nikbakht R，et al. Enhancement of peripheral blood CD56(dim)cell and NK cell cytotoxicity in women with recurrent spontaneous abortion or in vitro fertilition failure [J].J Reprod Immunol，2012，95：87-92.

[5] 歐陽能勇，黃松音，鄭澄宇.反復(fù)自然流產(chǎn)患者免疫治療后封閉抗體與調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞變化[J].現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)，2010，36：332-334.

[6] Taylor C,Faulk WP.Prevention of recurrent abortion with leucocyte transfasions [J].Lancet,1981,2(8237):68-70.

[7] 張建平，林其德，李大金，等.復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的診斷與治療[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2006，15：481-492.

[8] 楊章莉，周春慧，李新蓉，等.淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫聯(lián)合地屈孕酮治療封閉抗體陰性所致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的臨床觀察[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2014，23：128-130.

[9] 陳建玲.380例淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫療法治療不明原因的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)療效觀察[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2015，24：457-460.

[10] 胡曉東，梁佩燕，黃春宇，等.淋巴免疫治療對(duì)不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者外周血T細(xì)胞的影響[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2014，23：733-738.

[11] Mukhopadhyay R，Saraswathy KN，Ghost PK. MTHFR C667T and factor V Leiden in recurrent pregnancy loss：a study among an endogamous group in North India[J].Genet Test Mol Biomarkers，2009，13：861-865.

[12] Rodríguez-Guillén Mdel R，torres-Sánchez L，Chen J，et al. Maternal MTHFR polymorphisms and risk of spontaneous abortion[J].Salud Publica Mex，2009，51：19-25.

[13] 陳穎，張建平.淋巴細(xì)胞免疫治療在反復(fù)種植失敗和復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)中的作用[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2013，22：241-244.

[14] Sipak-Szmigiel O.Ronin-Walknowska E.Cybulski C，et al. Antigens HLA-G，sHLA-G and sHLA-class I in reproductive failure[J].Folia Histochem Cytobiol，2007，45 suppl I：S137-S141.

[15] Wilczyński JR，Radwan P，Tchórzewski H，et al. Immunotherapy of paticnts with rccurrent spontaneous miscarriage and idiopathic infertility：does the immunization-dependent Th2 cytokine overbalance really matter? [J].Arch Immunol Ther Exp(Warsz)，2012，60：151-160.

[16] 曹文麗，葉玲玲，姜雯，等.復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的免疫因素及抗免疫治療效果的評(píng)價(jià) [J].中國婦幼保健，2010，25：1118-1119.

[17] 周文潔，王曉秋，李大金.母-胎界面免疫細(xì)胞交互對(duì)話參與蛻膜化的分子機(jī)制[J].中國免疫學(xué)雜志，2014，30：1268-1271.

[編輯：王慧萍]

Effect of immunotherapy with paternal lymphocyte for patients with recurrent spontaneous abortion & negative anti-paternal lymphocyte antibody

WANG Xin，LI Pei-xu*

DepartmentofGynecology，The150thHospitalofPLA，Luoyang471003

Objective：To observe the effect of immunotherapy with paternal lymphocyte for the patients with recurrent spontaneous abortion & negative anti-paternal lymphocyte antibody(APLA).

Recurrent spontaneous abortion； Anti-paternal lymphocyte antibody； Immunotherapy

10.3969/j.issn.1004-3845.2016.11.009

2016-03-01；

2016-04-20

王欣，女，河南南陽人，學(xué)士，主治醫(yī)師，婦產(chǎn)科專業(yè)(*