MicroRNA-9調控室管膜下區(qū)干細胞增殖在電針治療局灶性腦缺血中的作用①

黃佳，鄭薏，姚建寧，葉曉倩，王露露，陶靜，柳維林

MicroRNA-9調控室管膜下區(qū)干細胞增殖在電針治療局灶性腦缺血中的作用①

黃佳，鄭薏，姚建寧，葉曉倩，王露露，陶靜，柳維林

目的 探討電針曲池、足三里穴是否是通過介導m icroRNA-9(m iR-9)調控缺血再灌注損傷大鼠室管膜下區(qū)神經(jīng)干細胞增殖來發(fā)揮神經(jīng)保護作用。方法 52只Sprague-Daw ley大鼠隨機分為假手術組(n=12)、模型組(n=12)、電針組(n=12)、電針+二甲基亞砜(DMSO)溶劑組(n=8)和電針+m iR-9模擬物組(n=8)。制作大鼠大腦中動脈閉塞(MCAO)致局灶性腦缺血模型，電針+DMSO溶劑組和電針+m iR-9模擬物組分別在造模前30m in側腦室注射0.7%DMSO溶劑和m iR-9模擬物。術后第2天電針患側曲池、足三里穴。造模后分別在第2天至第6天腹腔注射溴脫氧尿苷(BrdU)；免疫熒光觀察BrdU與巢蛋白(Nestin)共定位；RT-qPCR檢測室管膜下區(qū)m iR-9相對表達量。結果 電針后7 d，電針組神經(jīng)缺損功能評分明顯低于模型組(t=9.600,P=0.006)，腦梗死體積小于模型組(t=14.080,P=0.024)。電針組室管膜下區(qū)Nestin以及BrdU與Nestin共定位陽性細胞數(shù)量均增加，同時室管膜下區(qū)m iR-9低表達(P＜0.05)。電針+m iR-9模擬物組BrdU、Nestin陽性細胞數(shù)量以及BrdU與Nestin共定位的數(shù)量較電針+DMSO溶劑組減少。結論 電針曲池、足三里穴可促進室管膜下區(qū)神經(jīng)干細胞增殖，其作用可能通過下調m iR-9表達。

局灶性腦缺血；電針；神經(jīng)干細胞；microRNA-9；大鼠

[本文著錄格式] 黃佳，鄭薏，姚建寧，等.MicroRNA-9調控室管膜下區(qū)干細胞增殖在電針治療局灶性腦缺血中的作用[J].中

國康復理論與實踐,2016,22(11):1252-1258.

CITED AS:Huang J,Zheng Y,Yao JN,etal.EffectofmicroRNA-9 regulating stem cell proliferation in subventricular zone on electroacupuncture for focal cerebral ischemia[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2016,22(11):1252-1258.

近年來，內(nèi)源性神經(jīng)干細胞(neural stem cells, NSCs)的研究興起，為針灸治療腦卒中損傷，促進神經(jīng)再生修復提出了研究假說。成年哺乳動物大腦內(nèi)NSCs分布廣泛，主要區(qū)域包括腦室管膜下區(qū)(subventricular zone,SVZ)、海馬顆粒下層(subgranual zone, SGZ)和嗅球(olfactorius bulbus,OB)[1-2]。成年大腦內(nèi)NSCs處于靜息狀態(tài)，在某些因素(如缺血、缺氧、炎癥等)的刺激下，靜息狀態(tài)NSCs迅速被激活，在損傷原位出現(xiàn)或異位增生后，在其他趨化因子的作用下向損傷部位遷移并分化，替代并修復受損的神經(jīng)元，一定程度上改善神經(jīng)功能缺損[3]。

巢蛋白(Nestin)是哺乳動物NSCs中主要的細胞骨架蛋白，是一種胚胎性中間絲蛋白，在成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達于多潛能神經(jīng)前體細胞胞質中，已成為鑒定NSCs的重要標志蛋白之一。研究表明，腦缺血損傷能促使大鼠腦內(nèi)Nestin陽性細胞增殖分化，參與神經(jīng)再生和腦組織的功能恢復。Shimada等利用膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)純合子轉基因小鼠，在大腦中動脈閉塞(m iddle cerebral artery occlusion,MCAO)造模3 d后，發(fā)現(xiàn)Nestin陽性細胞顯著增加，并體外證實這種細胞能夠分化為神經(jīng)元、少突膠質細胞[4-5]。

前期我們也證實，電針曲池、足三里能有效促進急性腦缺血大鼠模型腦內(nèi)側腦室室管膜下區(qū)內(nèi)源性神經(jīng)細胞增殖、遷移和分化，室管膜下區(qū)溴脫氧尿苷(bromodeoxyuridine,BrdU)陽性細胞在7 d達到峰值，而BrdU/NeuN雙陽性細胞在21 d達到峰值[6]，海馬CA1、齒狀回Nestin陽性細胞增加[7]，改善神經(jīng)缺損功能[8-9]。但是電針具體作用機制尚未清楚。越來越多的證據(jù)也表明，非編碼RNAs，包括微小RNA(m icroRNA,miRNA)參與神經(jīng)保護。m iRNAs是一類序列長度約為18～25個核苷酸的非編碼小RNA分子，以堿基互補配對原則識別靶向基因，抑制其翻譯或直接降解mRNA。現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)m iRNAs分子參與細胞增殖、分化以及凋亡等過程，與人類眾多疾病的發(fā)生與發(fā)展密切相關[10-11]。m iR-9是一類高度保守分子，表現(xiàn)組織特異性，在大腦中與神經(jīng)發(fā)育密切相關，它存在于NSCs上，在神經(jīng)元分化時會上調[12]。

本研究試圖揭示電針曲池、足三里穴是否通過介導m iR-9調控缺血再灌注損傷大鼠室管膜下區(qū)NSCs增殖。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

52只雄性Sprague-Daw ley大鼠，體質量(250±30) g，由上海斯萊克實驗動物責任有限公司提供，生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2014-0002，由福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心喂養(yǎng)，許可證號SYXK(閩)2014-001。本研究由兩部分實驗組成。

實驗1：應用隨機數(shù)字表法將36只大鼠隨機分為假手術組、模型組和電針組，每組12只。模型組和電針組大鼠均制作局灶性腦缺血模型大鼠。電針組所有大鼠在手術后第2天取患側曲池、足三里穴，穴位定位參考《實驗針灸學》[13]。局部消毒后，用華佗牌30 號0.5寸毫針，斜刺0.2～0.3 cm，接G6805型電針儀，電壓峰值6 V，以大鼠肢體輕輕抖動為度，選用疏密波，頻率1～20Hz，每次30m in，每天1次，共7 d。

實驗2：應用隨機數(shù)字表法將16只模型大鼠隨機分為電針+二甲基亞砜(DMSO)溶劑組和電針+miR-9模擬物組，每組8只。10μl 0.7%DMSO溶劑或10μl m iR-9模擬物在造模前30m in完成側腦室注射，miR-9模擬物(10 mMol/L)溶解在0.7%DMSO中。電針+ DMSO組和電針+m iR模擬物組大鼠均接受電針患側曲池、足三里穴治療，其干預參數(shù)同上。

1.2 主要實驗試劑

Nestin單抗、BrdU多抗：ABCAM公司。p16多抗、β-actin多抗、堿性磷酸酶標記山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗：CST公司，美國。m iR-9模擬物：SANTA CRUZ公司，美國。

1.3 局灶性腦缺血模型

實驗大鼠術前24 h禁食，不禁水。采用改良Longa方法[14]，制備局灶性腦缺血動物模型。具體造模過程如下。使用10%水合氯醛0.3m l/100 g腹腔麻醉。大鼠先處于俯臥，矢狀位剪開額頂部皮膚約2 cm，暴露皮下筋膜，用浸滿雙氧水的棉簽摩擦暴露的筋膜，直至暴露出顱骨前囟及左側半顱骨。將激光多普勒血流儀的探頭固定于前囟向左5mm，向后3mm定位點上，開始記錄左側大腦中動脈供血區(qū)域血流變化值，當所示數(shù)值平穩(wěn)，開始制作MCAO模型。將大鼠輕放

至仰臥位(注意探針)并固定，取頸部正中開口1.5～2 cm，暴露分離頸總動脈(common carotid artery, CCA)、頸外動脈(external carotid artery,ECA)、頸內(nèi)動脈(internal carotid artery,ICA)。結扎CCA近心端及ECA，用微動脈夾夾閉遠端ICA，在距CCA分叉處1.0 cm處用顯微剪刀剪一切口，采用直徑為0.2mm尼龍線，頭端涂上硅膠，使頂端直徑約0.22～0.25mm，自左側CCA插入ICA至有少許阻力為止(自ECA與ICA分叉處起計算插入約18～22mm)，線栓到達大腦中動脈分支處，此時激光多普勒血流儀(LDF)顯示血流下降至基礎值的20%～30%[15]，即為栓塞成功，再固定線栓，頸部傷口縫合。待缺血2 h后回抽線栓至CCA分叉處，恢復再灌注，此時MCAO模型制備完成。假手術組只分離CCA、ICA、ECA，但不結扎、插線，稍后縫合傷口。手術結束后，所有動物放置于25℃室溫環(huán)境下蘇醒，保持正常飲水、飲食，直到動物恢復活動。

1.4 BrdU腹腔注射

將BrdU溶于無菌生理鹽水中，終濃度為10mg/ m l，分別在手術后第2、3、4、5、6天對所有大鼠腹腔注射BrdU溶液50mg/kg，每天2次，間隔8 h，最后一次注射24 h后處死動物。

1.5 神經(jīng)功能缺損評估

采用Longa[14]5分評價方法：0分，無神經(jīng)功能缺損體征；1分，不能伸展對側前爪；2分，向偏癱側轉圈；3分，行走時向偏癱側傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識喪失。MCAO手術后2 h出現(xiàn)神經(jīng)癥狀。1～3分模型鼠進入下一步實驗，并電針治療3 d和7 d后進行神經(jīng)功能缺損評估。

1.6 TTC染色

大鼠乙醚麻醉后斷頭處死。取新鮮腦組織，用大鼠腦切片模具自距大腦額部2mm處沿冠狀面切成2 mm厚的薄片，每個腦組織切成5片；進行TTC(2,3, 5-triphenyltetrazolium chloride)染色并計算腦腦梗死體積。應用Image-ProPlus圖像分析處理系統(tǒng)(Motic Med 6.0 System)計算每片腦組織腦梗死的體積(mm3)，每個腦組織的梗死總體積由連續(xù)切割的5片腦組織的梗死體積相加所得。最后計算出梗死總體積占整個大腦體積百分比，以此結果做統(tǒng)計分析。

1.7 免疫組化和免疫熒光

大鼠乙醚麻醉后斷頭處死。取新鮮腦組織，4%多聚甲醛固定，石蠟切片。脫蠟，透明；抗原修復和DNA變性，封閉；滴加一抗Nestin(1∶150)、BrdU(1 ∶500)，置濕盒中4℃孵育過夜，PBS沖洗；滴加異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)標記的相應二抗(1∶500)，37℃避光孵育2 h，PBS沖洗；4', 6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diam idino-2-phenylindole, DAPI)復染；抗熒光淬滅處理及封片觀察。在400×熒光顯微鏡下選取不重疊的6個視野，進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

1.8 RT-qPCR檢測

大鼠乙醚麻醉處死。取缺血側定管膜下區(qū)，應用m iRNAA ll-in-oneTMqRT-PCRm iRNA Detection試劑盒進行逆轉錄反應和PCR擴增反應，miR-9引物m iRQP0825，內(nèi)參U6引物RQP047936(廣州復能基因公司)。反應在ABI 7500熒光定量PCR儀上完成。37℃持續(xù)60m in，85℃持續(xù)5m in進行逆轉錄反應；95℃預變10m in；95℃變性，20 s；60℃退火15 s，72℃延伸收集30 s，共40個擴增循環(huán)。在相對定量分析中，取同一樣本目的基因的Ct值減去內(nèi)參基因的Ct值，所得出的ΔCt為目的基因相對于內(nèi)參基因的表達強度。再使用2-ΔΔCt方法將目的基因的表達差異通過處理樣本相對于未處理樣本的倍數(shù)來表示。

-ΔΔCt=-(ΔCt處理樣本-ΔCt未處理樣本）。

2-ΔΔCt＞1，目的基因表達上調，反之下調。該實驗重復3次并取其均值。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 神經(jīng)缺損功能評估

干預前，模型組與電針組神經(jīng)行為學評分無顯著性差異(P＞0.05)。干預7 d后，電針組神經(jīng)行為學評分明顯低于模型組(P＜0.01)。見表1。

表1 各組大鼠的神經(jīng)行為學評分比較

2.2腦梗死體積

假手術組腦組織染色全部為紅色，其余兩組腦組織冠狀切面均可見不同程度的左側梗死灶呈蒼白色，與周圍紅色的正常腦組織界限清晰，符合血管分布范圍。與模型組比較，電針組腦梗死體積減小(P＜0.05)。見圖1、表2。

圖1 各組TTC染色

表2 各組腦梗死體積百分比(%)

2.3 NSCs增殖

假手術組大鼠左側大腦室管膜下區(qū)幾乎無Nestin陽性細胞；模型組Nestin陽性表達顯著增高；而電針組Nestin陽性表達高于模型組。見圖2。

BrdU與Nestin免疫熒光共定位結果顯示，與假手術組相比，模型組BrdU與Nestin共定位的細胞大量增加，并定位于缺血側室管膜下區(qū)；電針組進一步促進大鼠室管膜下區(qū)BrdU與Nestin共定位細胞增殖。見圖3。

2.4 室管膜下區(qū)m iR-9表達

以U6 snRNA作為內(nèi)參，m iR-9在模型組大鼠室管膜下區(qū)的表達相對假手術組降低，而電針組表達低于模型組(P＜0.05)。電針+m iR-9模擬物組表達高于電針組(P＜0.05)，而與電針+DMSO溶劑組相比無顯著性差異(P＞0.05)。見表3。

表3 各組大鼠室管膜下區(qū)m iR-9的表達水平

2.5 miR-9在NSCs增殖中的作用

電針+m iR-9模擬物組較電針+DMSO溶劑組BrdU陽性細胞數(shù)量、Nestin陽性細胞數(shù)量以及BrdU與Nestin共定位的數(shù)量相對減少。見圖4。

圖2 各組大鼠Nestin在室管膜下區(qū)的陽性表達(免疫組化染色，400×)

圖3 假手術組、模型組、電針組BrdU與Nestin共表達(免疫熒光染色，200×)

圖4 電針+miR-9模擬物組和電針+DM SO溶劑組大鼠BrdU與Nestin共表達(免疫熒光染色,200×)

3 討論

《素問·痿論篇》提出“治痿獨取陽明”。曲池、足三里均為陽明經(jīng)穴。公維軍等電針足三里，可有效改善腦卒中偏癱痙攣期患者綜合痙攣量表評分[16]。周海云等電針軟癱期腦卒中偏癱患者頭部運動區(qū)以及患側肩偶、曲池、合谷、手三里、足三里、陽陵泉、三陰交等穴，有效率高于對照組[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，電針曲池、足三里穴能夠改善腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)行為學評分和腦梗死體積。

內(nèi)源性NSCs是終生具有自我更新和增殖分裂能力，以維持自身數(shù)量恒定的一種細胞，對損傷具有一定反應能力和遷移功能，具有多向分化潛能，可分化為神經(jīng)元、星形膠質細胞和少突膠質細胞。腦缺血損傷后，腦內(nèi)室管膜下區(qū)、海馬齒狀回等部位NSCs被激活增殖，在損傷區(qū)趨化因子等因素刺激下遷移和分化，參與神經(jīng)再生和腦組織功能的恢復[18]。Huang等證實，腦缺血損傷后激活同側海馬及室下區(qū)NSCs，且單側腦缺血可使雙側大腦半球NSCs被激活[19]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，NSCs的增殖不足以完成自身修復，超過80%新生神經(jīng)元在腦卒中后6周內(nèi)死亡，僅有0.2%壞死神經(jīng)元被新生神經(jīng)元替代[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，電針曲池、足三里，可促進腦缺血后室管膜下區(qū)NSCs增殖。Kim等[21]和Cheng等[22]也發(fā)現(xiàn)電針能促進小鼠海馬區(qū)NSCs增殖，并能改善神經(jīng)缺損癥狀。張業(yè)貴等電針MCAO大鼠百會、大椎穴，觀察到齒狀回顆粒下區(qū)Nestin表達增加，7 d時達到峰值[23]。

腦缺血可誘導大鼠腦組織特異性m iRNA廣泛而持續(xù)的變化。MCAO模型中，短暫腦缺血后表達發(fā)生改變的m iRNA占觀察總數(shù)的20%，其中24種表達增強，23種表達減弱[24]。

m iR-9是一類高度保守分子，表現(xiàn)出組織特異性，在大腦中與神經(jīng)發(fā)育密切相關。它存在于NSCs，在神經(jīng)元分化時上調[25]。m iR-9可以表達于神經(jīng)源性的大腦區(qū)域，抑制孤兒核受體Tailless樣蛋白(tailless-like protein,TLX)表達，從而減少NSCs增殖及過早分化[26]。TLX則抑制m iR-9 pri-miRNA的表達。此外，m iR-9敲除后，促進胚胎干細胞中NSCs的遷移[27]。過表達m iR-9顯著減少NSCs增殖并促進神經(jīng)

元及星形膠質細胞的分化[28]。Jing等認為，m iR-9通過抑制Notch-1促進骨髓間充質干細胞分化為神經(jīng)元[29]。腦缺血后神經(jīng)祖細胞m iR-9下調，也可以調節(jié)Notch信號通路[30]。張靖慧等發(fā)現(xiàn)，腦缺血后7 d是NSCs增殖高峰期，此時患側大腦組織中m iR-9表達減少；重復經(jīng)顱磁刺激(repetitive transcranialmagnetic stimulation,rTMS)7 d后，m iR-9表達又顯著下降，且與NSCs增殖呈負相關[31]。

本研究顯示，電針曲池、足三里促進大鼠室管膜下區(qū)m iR-9低表達；側腦室注射m iR-9激動劑阻斷電針促進NSCs增殖效應。說明電針曲池、足三里可能通過下調miR-9的表達促進室管膜下區(qū)NSCs的增殖。

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Effect of MicroRNA-9 Regulating Stem Cell Proliferation in Subventricular Zone on Electroacupuncture for FocalCerebral Ischem ia

HUANG Jia,ZHENG Yi,YAO Jian-ning,YEXiao-qian,WANG Lu-lu,TAO Jing,LIUWei-lin
College of Rehabilitation Medicine,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou,Fujian 350122, China

Objective To investigate theeffectof electroacupuncture(EA)atQuchi(LI11)and Zusanli(ST36)acupointson ratswith focal cerebral ischem ia,and whether itwasmediated by microRNA-9(miR-9)regulating neural stem cells proliferation in subventricular zone.Methods Fifty-two Sprague-Daw ley rats were random ly assigned into sham group(n=12),model group(n=12),EA group(n=12), EA+dimethylsulfoxide(DMSO)group(n=8)and EA+miR-9m imicsgroup(n=8).Themiddle cerebralartery occlusionmodelwas induced. DMSO and miR-9mim icswere performed by intracerebroventricular injection 30minutes beforemodeling.The EA group,EA+DMSO group and EA+m iR-9m im ics group were electroacupunctured atQuchiand Zusanliacupoints the next day aftermodeling.A ll the groups were intraperitoneally injected with bromodeoxyuridine(BrdU).The BrdU co-localized with Nestin was observed by immunofluorescence. The expression ofm iR-9 in subventricular zonewas detected by real time qPCR.Results The neurological deficitscorewas lower(t=9.600, P=0.006),and the infarctvolumewas smaller(t=14.080,P=0.024)in the electroacupuncture group than in themodelgroup.The expression of Nestin and BrdU co-localizated with Nestin increased;while the expression ofmiR-9 decreased in subventricular zone(P＜0.05)in the electoacupuncture group.However,the expression of Nestin,BrdU and BrdU co-localizated with Nestin was lower in the EA+m iR-9m imics group than in the EA+DMSO group.Conclusion Electroacupuncture atQuchiand Zusanliacupointsmay promote the neural stem cells proliferation in subventricular zoneby downregulating themiR-9 expression.

focalcerebral ischem ia;electroacupuncture;neuralstem cells;m icroRNA-9;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.11.003

R743.3

A

1006-9771(2016)11-1252-07

2016-07-01

2016-07-19)

1.福建省衛(wèi)生廳青年科研課題(No.2014-1-70)；2.福建省自然科學基金(No.2016J01382)。

福建中醫(yī)藥大學康復醫(yī)學院，福建福州市350122。作者簡介：黃佳(1984-)，女，漢族，重慶市人，博士，講師，主要研究方向：神經(jīng)康復。通訊作者：柳維林(1985-)，男，漢族，湖南衡東縣人，博士，講師，主要研究方向：腦疾病中西醫(yī)結合康復基礎。E-mail:liu_0366@sina.com。