電針神庭、百會對腦缺血再灌注大鼠學習記憶能力和海馬CA1區(qū)環(huán)磷酸腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白及其磷酸化水平的影響①

張?zhí)N，林如輝，李鉆芳，陶靜，陳立典

·專題·

電針神庭、百會對腦缺血再灌注大鼠學習記憶能力和海馬CA1區(qū)環(huán)磷酸腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白及其磷酸化水平的影響①

張?zhí)N1，林如輝2，李鉆芳2，陶靜3，陳立典4

目的 探討電針神庭、百會治療腦卒中后認知功能障礙的機制。方法 45只Sprague-Daw ley大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和電針組，每組15只。后兩組線栓法復制大鼠大腦中動脈缺血2 h再灌注模型。電針組于造模后24 h開始電針神庭和百會，共7 d。每天電針后行Morris水迷宮測試。治療后，取大鼠腦組織TTC染色測量腦梗死體積，免疫組化檢測海馬CA1區(qū)環(huán)磷酸腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)及其磷酸化水平(p-CREB)的表達。結(jié)果 從第4天開始，與模型組相比，電針組大鼠逃避潛伏期及游泳路程縮短(P＜0.05)；穿越平臺次數(shù)增多(P＜0.05)。電針組大鼠腦梗死體積小于模型組(P＜0.05)；海馬CA1區(qū)CREB、p-CREB表達量較模型組增加(P＜0.05)。結(jié)論 電針神庭、百會后，腦缺血再灌注大鼠海馬CA 1區(qū)CREB、p-CREB表達量增加，從而保護神經(jīng)元，改善學習記憶功能。

腦缺血再灌注；學習記憶；電針；環(huán)磷酸腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白；磷酸化；大鼠

[本文著錄格式] 張?zhí)N，林如輝，李鉆芳，等.電針神庭、百會對腦缺血再灌注大鼠學習記憶能力和海馬CA1區(qū)環(huán)磷酸腺苷效

應(yīng)元件結(jié)合蛋白及其磷酸化水平的影響[J].中國康復理論與實踐,2016,22(11):1241-1245.

CITED AS:Zhang Y,Lin RH,Li ZF,etal.Effectsof electroacupuncture at Shenting and Baihuion learning andmemory,and expression of cyclic AMP response elementbinding protein and phosphorylation in ratswith cerebral ischem ia-reperfusion[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2016,22(11):1241-1245.

卒中后認知功能障礙(post-stroke cognitiv impairment,PSCI)是腦卒中患者常見并發(fā)癥[1]，且缺血性腦卒中更易導致認知功能障礙[2-3]。環(huán)磷酸腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cyclic AMP response elementbinding protein, CREB)屬于亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子家族，表達于各種組織，參與神經(jīng)系統(tǒng)突觸可塑性和病理生理的調(diào)節(jié)過程[4-5]，在長期記憶中起主要作用[6]，磷酸化的CREB (p-CREB)對神經(jīng)元有重要的保護作用[7]，參與學習記憶過程[8-9]。本研究探討電針干預(yù)腦缺血再灌注大鼠學習記憶能力的CREB、p-CREB機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

45只成年雄性清潔級Sprague-Daw ley大鼠，體質(zhì)量260～280 g，由福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，許可證號SYXK2012-003。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由飲食和飲水，恒溫22℃，濕度50%～70%，光照8:00～20:00。

將大鼠編號，采用隨機數(shù)字表法抽取對應(yīng)隨機數(shù)字，將隨機數(shù)字由小到大進行編號，1～15號為假手術(shù)組、16～30號為模型組、31～45號為電針組。

1.2 主要儀器及試劑

華佗牌SDZ-V電針儀：蘇州醫(yī)療用品廠有限公司。Morris水迷宮：中國醫(yī)學科學院藥物研究所。TTC：SIGMA公司。β-actin、CREB、p-CREB抗體：ABCAM公司。

1.3 模型制備

大鼠以10%水合氯醛3m l/kg腹腔注射麻醉。徹底暴露頸總動脈，分離頸內(nèi)動脈和頸外動脈的主干及分支，結(jié)扎頸內(nèi)、頸外動脈分叉處，血管夾夾住頸內(nèi)動脈分叉處，結(jié)扎頸總動脈遠端，并在離結(jié)扎1～2mm處剪一小口，將線拴插入頸內(nèi)動脈，松開血管夾；插入深度大約距頸內(nèi)、外動脈的分叉處18～22mm，有阻塞感時停止，固定線栓。2 h后將線栓緩慢退出。

假手術(shù)組僅將動脈分離，然后縫合。

模型制備完畢后采用Longa法[10]對大鼠進行測試：0分，無神經(jīng)缺失的癥狀；1分，不能完全伸展對側(cè)前爪；2分，向右側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，向?qū)?cè)傾倒；4分，神經(jīng)缺失癥狀嚴重，不能行走。0分、4分剔除，重新造模補充。

1.4 干預(yù)方法

假手術(shù)組和模型組不予任何治療。給予同等條件喂養(yǎng)和抓取。

電針組選用華佗牌針灸針(直徑0.25mm，長13 mm)針刺神庭、百會。大鼠穴位定位參考《實驗針灸學》[11]，神庭向上斜刺，深2mm；百會向前斜刺，深2mm。接SDZ-V電針儀，疏密波，頻率1～20Hz，強度2mA。每次30m in，每天1次，共1周。

1.5 Morris水迷宮

電針第2天開始進行Morris水迷宮實驗，包括定位航行實驗和空間探索實驗。

定位航行實驗時，每次訓練將大鼠從4個象限依次放入，每個象限的入水點固定，間隔5min。若大鼠在90 s內(nèi)找到平臺，并在平臺上停留3 s以上，計為逃避潛伏期；如果90 s內(nèi)沒有完成，則逃避潛伏期計為90 s。計算機自動計算平均路程。均取4個象限的平均值，共5 d。

空間探索實驗于定位航行實驗結(jié)束24 h后進行。撤掉平臺，將大鼠從原平臺所在象限的對面象限放入水中，計算90 s內(nèi)大鼠游泳時穿過平臺區(qū)的次數(shù)。

1.6 TTC染色

各組分別取7只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛3 m l/kg，左心室灌注冰生理鹽水?？焖贁囝^取腦，將組織置于-20℃冰箱速凍30m in。取出組織于冰上切掉嗅球及小腦部分，在視交叉處前后每隔2mm切1片，共切5個腦片。將腦片置2%TTC溶液中，錫箔紙包裹，37℃水浴15～30m in，用毛筆刷翻動腦片，使組織均勻接觸染色液[12]。Image J軟件測定腦梗死面積

梗死面積=非缺血側(cè)半球面積-缺血側(cè)半球未梗死區(qū)面積

各腦片梗死面積之和乘以厚度為總的梗死體積，計算腦梗死灶體積與全腦體積比(腦梗死體積百分比)。

1.7 免疫組化染色

各組分別取8只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛3 m l/kg，左心室生理鹽水灌注沖洗，4%多聚甲醛固定。斷頭取腦，4%多聚甲酸后固定。梯度酒精脫

水，二甲苯透明，石蠟包埋。非連續(xù)性切片，厚5 μm。烤片，脫蠟脫水，10%H2O2室溫孵育10m in，枸櫞酸鹽緩沖液(pH=6.0)高壓修復抗原，滴加山羊血清抗原封閉20min，加入CREB(1∶1500)、p-CREB (1∶1000)一抗，4℃冰箱孵育過夜；滴加二抗，室溫孵育20min。DAB顯色，自來水充分沖洗，蘇木素復染，脫水透明，封片。光學顯微鏡下觀察。采用Image pro-Plus6.0對圖片進行分析，計算平均光密度。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)錄入和處理。符合正態(tài)分布方差齊的組間比較采用單因素方差分析。所有數(shù)據(jù)用(±s)表示。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮

從電針第4天開始，與模型組比較，電針組大鼠經(jīng)過的路程、逃避潛伏期縮短(P＜0.05)；空間探索實驗穿過平臺次數(shù)增加(P＜0.05)。見表1、表2、表3。

表1 各組逃避潛伏期比較(s)

表2 各組經(jīng)過路程比較(cm)

2.2 TTC染色

電針組梗死體積小于模型組(P＜0.05)。見圖1、表4。

圖1 各組腦組織TTC染色

2.3 CREB、p-CREB表達

與假手術(shù)組比較，模型組CREB、p-CREB表達減少(P＜0.05)；與模型組比較，電針組 CREB、 p-CREB表達增加(P＜0.05)。見圖2、表5。

圖2 各組海馬CA1區(qū)CREB、p-CREB表達(免疫組化染色,bar=100μm)

表3 各組穿過平臺次數(shù)比較

表4 各組梗死體積百分比比較(%)

表5 各組海馬CA1區(qū)CREB、p-CREB表達比較(光密度)

3 討論

督脈腧穴百會、神庭的下方是大腦額葉、頂葉等重要功能腦葉所在。針刺百會可以減少腦梗死體積[13]，有效緩解各種退行性疾病，改善認知功能[14]。神庭穴是元神之府中最中心的地方。二穴合用，對改善認知功能有明顯作用[15]。

本研究顯示，電針神庭、百會可減輕腦缺血再灌注大鼠的梗死體積，對腦組織缺血有保護作用；并能部分恢復空間學習記憶功能。

海馬是缺血缺氧最敏感的區(qū)域[16]，特別是CA1區(qū)，在缺血再灌注后最易遭受二次損傷[17]。海馬CA1區(qū)遲發(fā)性神經(jīng)元死亡后，動物可表現(xiàn)出空間學習障礙[18]。它的完整性對空間學習記憶至關(guān)重要[19]。CREB作為一種記憶功能蛋白，與長時程增強記憶密切相關(guān)[20-21]，其Ser133位磷酸化對所調(diào)控的基因轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要，可促進神經(jīng)元存活，突觸增生，神經(jīng)元分化以及學習、記憶功能[22-23]。本研究顯示，電針可能通過調(diào)控CREB、p-CREB的表達，保護神經(jīng)元，改善缺血再灌注大鼠的學習記憶能力。

今后我們需進一步深化研究，結(jié)合相關(guān)的機制，從功能方面進行探討，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

[1]Jacquin A,Binquet C,Rouaud O,et al.Post-stroke cognitive impairment high prevalence and determ ining factors in a cohort of m ild stroke[J].J A lzheimers Dis,2014,40(4):

1029-1038.

[2]van Straaten EC,Scheltens P,Barkhof F.MRIand CT in the diagnosis of vascular dementia[J].JNeurol Sci,2004,226(1-2): 9-12.

[3]Erkinjuntti T,Inzitari D,Pantoni L,et al.Research criteria for subcortical vascular dementia in clinical trials[J].J Neural Transm Suppl,2000,59:23-30.

[4]Roy A,Jana M,CorbettG,etal.Regulation of cyclic AMP response element binding and hippocampal plasticity-related genes by peroxisome proliferator-activated receptor alpha[J]. CellReports,2013,4(4):724-737.

[5]Ikeda H,Mochizuki K,Murase K.Astrocytes are involved in long-term facilitation of neuronalexcitation in the anterior cingulate cortex of m ice with inflammatory pain[J].Pain,2013, 154(12):2836-2843.

[6]Descalzi G,Fukushima H,Suzuki A,et al.Genetic enhancementof neuropathic and inflammatory pain by forebrain upregulation of CREB-mediated transcription[J].Mol Pain,2012,8 (90):1-6.

[7]鄭麗君,周芝文,楊杰.二苯乙烯苷對腦缺血再灌注大鼠TrKA 及Bcl-2表達的影響[J].國際神經(jīng)病學神經(jīng)外科學雜志, 2013,40(5):412-417.

[8]Edelmayer R,Brederson J,Jarvis M,et al.Biochem ical and pharmacological assessment of MAP-kinase signaling along pain pathways in experimental rodentmodels:a potential tool for the discovery of novelantinociceptive therapeutics[J].Biochem Pharmacol,2014,87(3):390-398.

[9]Zhang N,Wen Q,Ren L,etal.Neuroprotective effectof arctigenin via upregulation of P-CREB in mouse primary neurons and human SH-SY5Y neuroblastoma cells[J].Int JMol Sci, 2013,14(9):18657-18669.

[10]Longa EC,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversiblemiddle serebral artery occulusion without craniectomy in rats[J]. Stroke,1989,20(1):84-91.

[11]李忠仁.實驗針灸學[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2007: 327-329.

[12]王相斌,宋福聰,郭鵬,等.卒中后認知功能障礙與神經(jīng)元特異性烯醇化酶相關(guān)性研究[J].河北醫(yī)藥,2010,32(11):45-46.

[13]Chunag CM,Hsieh CL,Li TC,etal.Acupuncture stimulation at Baihuiacupoint reduced cerebral infarctand increased dopam ine levels in chronic cerebral hypoterfusion and ischem ia-reperfusion injured Sprague-Daw ley rats[J].Am JChin Med, 2007,35(5):779-791.

[14]Zhu Y,Zeng Y.Electroacupuncture protected pyram idal cells in hippocampal CA1 region of vascular dementia ratsby inhibiting the expression of p53 and Noxa[J].CNSNeurosci Ther, 2011,17(6):599-604.

[15]Feng XD,Yang SL,Liu J,et al.Electroacupuncture ameliorates cognitive impairment through inhibition of NF-kappa B mediated neuronal cell apoptosis in cerebral ischem ia reperfusion injured rats[J].MolMed Rep,2013,7(5):1516-1522.

[16]朱長庚.神經(jīng)解剖學[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2009: 563-565.

[17]熊麗,曾進勝.大腦中動脈供血區(qū)梗死后遠隔部位繼發(fā)性損害的研究進展[J].國外醫(yī)學腦血管疾病分冊,2005,13(11): 835-838.

[18]Kumaran D,Udayabanu M,Nair RU.Benzam ide protects delayed neuronal death and behavioural impairment in a mouse model of global cerebral ischem ia[J].Behav Brain Res,2008, 192(2):178-184.

[19]M cAuliffe JJ,Miles L,Vorhees CV.Adult neurological function follow ing neonatal hypoxia-ischemia in amousemodel of the term neonate:watermaze performance is dependenton separable cognitive and motor components[J].Brain Res,2006, 1118(1):208-221.

[20]Kim J,Kwon J,Kim H,et al.CREB and neuronal selection formemory trace[J].FrontNeuralCircuits,2013,7:44.

[21]Toyoda H,Zhao M,Mercaldo V,etal.Calcium/calmodulin-dependent kinase IV contributes to translation-dependent early synaptic potentiation in the anterior cingulate cortex of adult m ice[J].Mol Brain,2010,3:27.

[22]Sandkuhler J,Lee J.How to erasememory traces of pain and fear[J].TrendsNeurosci,2013,36(6):343-352.

[23]Ren X,Lutfy K,MangubatM,etal.A lterations in phosphorylated CREB expression in different brain regions follow ing shortand long-term morphine exposure:relationship to food intake[J].JObes,2013,2013:1-11.

Ef fects of Electroacupuncture at Shenting and Baihuion Learning and Memory,and Expression of Cyclic AMP Response Element Binding Protein and Phosphorylation in Ratswith Cerebral Ischem ia-reperfusion

ZHANG Yun1,LINRu-hui2,LIZuan-fang2,TAO Jing3,CHEN Li-dian4
1.ClinicalMedicine Department,Fujian Health College,Fuzhou,Fujian 350101,China;2.Institute of Integrative Medicine,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou,Fujian 350122,China;3.College of Rehabilitation Medicine,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou,Fujian 350122,China;4.Fujian University of TraditionalChineseMedicine,Fuzhou,Fujian 350122,China

Objective To explore the effects of electroacupuncture at Shenting(DU24)and Baihui(DU20)on cognitive dysfunction after stroke.Methods Forty-five Sprague-Daw ley ratswere random ly divided into control group(n=15),model group(n=15)and electroacupuncture group(n=15).The latter two groupswere occluded theirmiddle cerebral artery for two hours and reperfused.The electroacupuncture group accepted electroacupuncture at Shenting and Baihui24 hours aftermodeling for seven days.They were assessed with Morriswatermaze once a day since the second day of intervention.Theirbrainswere stained with TTC staining tomeasure cerebral infarction volume after treatment,while the expression of cyclic AMP response elementbinding protein(CREB)and phosphorylation(p-CREB)in hippocampal CA1 areawere detected with immunohistochem istry.Results The escape latency and sw imm ing distance of place navigation shortened in the electroacupuncture group compared with those in themodelgroup(P＜0.05)from the fourth day of intervention.The number of cross platform of spatial probe increased(P＜0.05).The infarction volumewas less in the electroacupuncture group than in themodel group(P＜0.05),with increased expression of CREB and p-CREB in hippocampalCA1 area(P＜0.05).Conclusion Electroacupuncture at Shenting and Baihui can increase the expression of CREB and phosphorylation in hippocampal CA1 area in rats after cerebral ischemia-reperfusion,to protect theneurons from ischemiaand improve the learning andmemory function.

cerebral ischem ia-reperfusion;learning and memory;electroacupuncture;cyclic AMP response element binding protein; phosphorylation;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.11.001

R743.3

A

1006-9771(2016)11-1241-05

2016-05-03

2016-07-19)

2016年福建省中青年教師教育科研項目(No.科技類JAT160802)。

1.福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院臨床醫(yī)學系，福建福州市350101；2.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州市350122；3.福建中醫(yī)藥大學康復醫(yī)學院，福建福州市350122；4.福建中醫(yī)藥大學，福建福州市350122。作者簡介：張?zhí)N(1985-)，女，漢族，湖北宜昌市人，博士，講師，主要研究方向：針刺對腦血管疾病的研究。E-mail:413295808@qq.com。