鵝掌楸苷和光甘草定協(xié)同抗氧化作用研究*

馮倩茹，葉柳青，劉園園，龔又明，李紅艷，王 艷

（1.廣東省中醫(yī)院藥學(xué)部，廣州 510120；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 300193；3.南開大學(xué)藥學(xué)院，天津 300071）

鵝掌楸苷和光甘草定協(xié)同抗氧化作用研究*

馮倩茹1，葉柳青2，劉園園2，龔又明1，李紅艷3，王 艷2

（1.廣東省中醫(yī)院藥學(xué)部，廣州 510120；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 300193；3.南開大學(xué)藥學(xué)院，天津 300071）

［目的］研究鵝掌楸苷和光甘草定協(xié)同抗氧化作用。［方法］采用1，1-二苯基-2-苦苯肼（DPPH）和2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）自由基清除實驗，測定鵝掌楸苷和光甘草定單獨及不同濃度配比的抗氧化活性，等輻射分析法（Isobologram）對協(xié)同作用結(jié)果進行分析。［結(jié)果］鵝掌楸苷和光甘草定配比為3∶1時對DPPH自由基清除表現(xiàn)為協(xié)同作用，1∶1表現(xiàn)為相加作用，1∶3表現(xiàn)為拮抗作用。ABTS實驗結(jié)果顯示復(fù)配為1∶1、1∶3和3∶1時均有協(xié)同作用，并且復(fù)配組合中協(xié)同作用強弱為：1∶3＞1∶1＞3∶1。［結(jié)論］鵝掌楸苷和光甘草定按一定比例復(fù)配后具有協(xié)同抗氧化作用。

鵝掌楸苷；光甘草定；協(xié)同作用；抗氧化活性

根據(jù)文獻報道，中藥多種成分均具有抗氧化活性，現(xiàn)已應(yīng)用于油脂食品的抗氧化，藥品和化妝品的抗氧化、抗衰老及抗腫瘤作用。筆者在研究鵝掌楸苷和光甘草定抗氧化活性的基礎(chǔ)上，將兩者進行配伍，研究兩者的抗氧化協(xié)同作用，以期達到在相同藥效下降低成本的目的，對藥品和化妝品的臨床應(yīng)用具有重要意義。同時為本課題組后期篩選兩者最佳配比及制劑研究提供一定的數(shù)據(jù)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料和儀器

1.1 材料與試劑 鵝掌楸苷（實驗室自制），光甘草定（中國藥品生物制品鑒定所，純度＞98%）；1，1-二苯基-2-苦苯肼（DPPH，天津市康科德科技有限公司）；2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS，南京奧多福尼生物科技有限公司）；甲醇、無水乙醇、過硫酸鉀（天津市康科德科技有限公司）。

1.2 儀器 多功能微孔板檢測儀infinite 200PRO［帝肯（上海）貿(mào)易有限公司］；調(diào)速振蕩器HY-1型（上海亞榮生化儀器廠）；精密分析天平BP121S型（瑞士托雷斯公司）。

2 方法

2.1 溶液及樣品的制備

2.1.1 鵝掌楸苷的制備 大血藤烘干，粉碎，過40目篩。取粉末1 kg，95%乙醇回流提取90 min，重復(fù)2次。合并濾液，過濾濃縮得到浸膏。浸膏中加入去離子水，3 000 r/min條件下離心30 min，上清液經(jīng)X-5型大孔樹脂初步純化，重結(jié)晶得到含量為97.48%的鵝掌楸苷樣品［3］。

2.1.2 DPPH溶液的制備 稱取DPPH粉末，精確稱定，以甲醇為溶劑，定容于500 mL容量瓶內(nèi)，配制濃度為9.8×10-5mol/L的DPPH溶液，0～4℃避光保存，備用［5］。

2.1.3 ABTS溶液的制備 將7 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L的過硫酸鉀1∶1混合，在室溫避光條件下靜置過夜，將生成的ABTS溶液用乙醇稀釋，使其在30℃，734 nm波長下的吸光度為0.70±0.02，即得到ABTS工作液［6］。

對Y17aM3和Y17進行碳源同化試驗，結(jié)果如圖9。Y17aM3除了對大豆蛋白胨的同化能力提高了，對其余幾種氮源同化能力與Y17出發(fā)菌大致相同。因此在糖蜜培養(yǎng)基中加入大豆蛋白胨可以促進Y17aM3的生長。

2.2 DPPH自由基清除實驗 取96孔板，分別加入上述DPPH溶液100 μL和甲醇溶液，再加入不同濃度的鵝掌楸苷、光甘草定和復(fù)配后溶液100 μL［7］。復(fù)配的鵝掌楸苷和光甘草定的質(zhì)量比依次為1∶3，1∶1，3∶1。避光反應(yīng)30 min，使用多功能微孔板檢測儀測517 nm處的吸光度，計算清除率，用SPSS 17.0軟件計算IC50。實驗平行測定3次，保證準確性。

式中，D（λ）0為100 μL DPPH+100 μL甲醇的吸光度；D（λ）1為100 μL DPPH+100 μL樣品的吸光度；D（λ）2為100 μL樣品+100 μL甲醇的吸光度［8］。

2.3 ABTS自由基清除實驗 取96孔板，分別加入ABTS 100 μL，再加入不同濃度的鵝掌楸苷、光甘草定和復(fù)配后溶液100 μL［9］。復(fù)配的鵝掌楸苷和光甘草定的質(zhì)量比依次為1∶1，1∶3，3∶1。避光反應(yīng)6 min，使用多功能微孔板檢測儀測734 nm處的吸光度，計算清除率，用SPSS軟件計算IC50。實驗平行測定3次，保證準確性。

式中，D（λ）0為100 μL ABTS+100 μL水的吸光度；D（λ）1為100 μL ABTS+100 μL樣品的吸光度；D（λ）2為100 μL樣品+100 μL水的吸光度。

2.4 Isobologram分析法分析鵝掌楸苷和光甘草定的相互作用 根據(jù)鵝掌楸苷和光甘草定分別單獨作用得到IC50，為全面分析兩者相互作用選取掌楸苷和光甘草定的質(zhì)量比依次為1∶3，1∶1，3∶1［9］。復(fù)配后樣品稀釋不同濃度，分別測定對DPPH和ABTS自由基的清除作用。

2.5 數(shù)據(jù)分析

IC50Amix、IC50Bmix分別為復(fù)配組中A、B兩種抗氧化劑的IC50值；IC50A和IC50B分別為A、B單獨作用時的IC50值。若γ=1，表示相互作用為相加；若γ＜1，表示相互作用為協(xié)同作用，并且γ值越小說明協(xié)同作用越強；若γ＞1，表示相互作用為拮抗作用［10］。

3 結(jié)果與分析

3.1 鵝掌楸苷和光甘草定對DPPH自由基的清除作用

3.1.1 鵝掌楸苷和光甘草定單獨作用對DPPH自由基的清除作用 由圖1可知，鵝掌楸苷和光甘草定均對DPPH自由基有清除作用，并且隨著鵝掌楸苷和光甘草定質(zhì)量濃度的增加，對DPPH的清除率隨之增加。鵝掌楸苷和光甘草定的IC50分別為161.63 mg/L、79.81 mg/L，清除能力為光甘草定大于鵝掌楸苷，兩者對DPPH自由基均有較好的清除作用，表明兩者均具有較強的抗氧化能力。

圖1 光甘草定和鵝掌楸苷對DPPH的清除率Fig.1 DPPH radical scavenging capacity of GLA and LIR

3.1.2 鵝掌楸苷和光甘草定復(fù)配后對DPPH自由基的清除作用 由表1可知，鵝掌楸苷和光甘草定的復(fù)配比為1∶3、1∶1和3∶1時，隨光甘草定質(zhì)量濃度的增加，對DPPH的清除率隨之增加。復(fù)配后IC50值分別為374.12、99.68和59.34 mg/L。因此對DPPH的清除作用大小為：復(fù)配比3∶1＞1∶1＞1∶3。

表1 鵝掌楸苷和光甘草定復(fù)配后對DPPH的清除率Tab.1 DPPH radical scavenging capacity of GLA combined with LIR

3.1.3 鵝掌楸苷和光甘草定復(fù)配后對DPPH自由基清除作用Isobologram分析圖 由圖2結(jié)果顯示，復(fù)配比為3∶1的效應(yīng)點（IC50值）落在相加線和95%可信限的左邊，表示鵝掌楸苷和光甘草定復(fù)配比為3∶1為協(xié)同作用；復(fù)配比為1∶1的效應(yīng)點（IC50值）落在相加線和95%可信限之間，表示鵝掌楸苷和光甘草定復(fù)配比為1∶1為相加作用；復(fù)配比為1∶3的效應(yīng)點（IC50值）落在相加線和95%可信限的右邊，表示鵝掌楸苷和光甘草定復(fù)配比為1∶3為拮抗作用［11］。

圖2 鵝掌楸苷和光甘草定復(fù)配后DPPH自由基的清除作用的Isobologram分析圖Fig.2 Isobolographic plot of DPPH radical scavenging capacity of GLA combined with LIR

3.1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 根據(jù)鵝掌楸苷和光甘草定單體及復(fù)配后得到的IC50值，按照2.5項下統(tǒng)計方法進行統(tǒng)計，分別計算光甘草定實際 IC50值（ICGLA50mix），鵝掌楸苷實際IC50值（IC50LIRmix），復(fù)配后實際IC50值（IC50mix），復(fù)配后理論IC50值（IC50add）及相互作用指數(shù)γ，并對所得結(jié)果IC50mix和IC50add進行t檢驗，結(jié)果見表2。

表2 鵝掌楸苷和光甘草定復(fù)配后對DPPH清除率的統(tǒng)計分析結(jié)果Tab.2 Statistic analysis of DPPH radical scavenging capacity of GLA combined with LIR

由表2可知，在鵝掌楸苷和光甘草定清除DPPH的實驗中，在復(fù)配比為3∶1時IC50mix值小于IC50add，并且相互作用指數(shù)γ＜1，鵝掌楸苷和光甘草定配比為3∶1時表現(xiàn)為協(xié)同作用。在復(fù)配比為1∶1 時IC50mix值雖小于IC50add，但處在置信區(qū)間內(nèi)，因此復(fù)配比為1∶1表現(xiàn)為相加作用。在復(fù)配比為1∶3時IC50mix值大于IC50add，并且相互作用指數(shù)γ＞1，因此復(fù)配比為1∶3表現(xiàn)為拮抗作用。

3.2 鵝掌楸苷和光甘草定對ABTS自由基的清除作用

3.2.1 鵝掌楸苷和光甘草定單獨作用對ABTS自由基的清除作用 由圖3可知，鵝掌楸苷和光甘草定均對ABTS自由基有清除作用，鵝掌楸苷和光甘草定隨著質(zhì)量濃度的增加，對ABTS的清除率隨之增加。鵝掌楸苷和光甘草定的IC50分別為118.66、102.81 mg/L，表明兩者對ABTS自由基均有較好的清除作用。

圖3 鵝掌楸苷和光甘草定對ABTS的清除率Fig.3 ABTS radical scavenging capacity of GLA and LIR

3.2.2 鵝掌楸苷和光甘草定復(fù)配后對ABTS自由基的清除作用 由表3可知，鵝掌楸苷和光甘草定的復(fù)配比為1∶3、3∶1和1∶1時，隨光甘草定質(zhì)量濃度的增加，對ABTS的清除率隨之增加。復(fù)配后IC50值分別為10.07、24.64和17.13 mg/L。因此對DPPH的清除作用大小為：復(fù)配比1∶3＞1∶1＞3∶1。

3.2.3 鵝掌楸苷和光甘草定復(fù)配后對ABTS自由基清除作用的Isobologram分析圖 由圖4結(jié)果顯示，鵝掌楸苷和光甘草定復(fù)配比為1∶3、1∶1和3∶1的效應(yīng)點（IC50值）均落在相加線和95%可信限左邊，表示鵝掌楸苷和光甘草定復(fù)配比為1∶3、1∶1和3∶1均表現(xiàn)為協(xié)同作用。

3.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 根據(jù)鵝掌楸苷和光甘草定單體及復(fù)配后對ABTS自由基清除作用的IC50值，分別計算光甘草定實際IC50值（ICGLA50mix），鵝掌楸苷實際IC50值（IC50LIRmix），復(fù)配后實際 IC50值（IC50mix），復(fù)配后理論IC50值（IC50add）及相互作用指數(shù)γ，并對所得結(jié)果IC50mix和IC50add進行t檢驗，結(jié)果見表4。

由表4可知，在鵝掌楸苷和光甘草定清除ABTS的實驗中，IC50mix值均小于IC50add，并且相互作用指數(shù)γ均＜1，表明鵝掌楸苷和光甘草定在復(fù)配為1∶1、1∶3和3∶1時均對ABTS有協(xié)同作用，并且復(fù)配組合中協(xié)同作用強弱為：1∶3＞1∶1＞3∶1。

表3 鵝掌楸苷和光甘草定復(fù)配后對ABTS的清除率Tab.3 ABTS radical scavenging capacity of GLA combined with LIR

圖4 鵝掌楸苷和光甘草定復(fù)配后對ABTS自由基清除作用的Isobologram分析圖Fig.4 Isobolographic plot of ABTS radical scavenging capacity of GLA combined with LIR

表4 鵝掌楸苷和光甘草定對ABTS清除率的統(tǒng)計分析結(jié)果Tab.4 Statistic analysis of ABTS radical scavenging capacity of GLA and LIR

4 結(jié)論與討論

筆者采用了常用的測定藥物抗氧化實驗方法：DPPH和ABTS清除實驗，測定了鵝掌楸苷和光甘草定在一定復(fù)配比例下的相互作用，并結(jié)合常用測定藥物相互作用的Isobologram分析法［12］，更加直觀的對相互作用進行分析。實驗結(jié)果顯示，鵝掌楸苷和光甘草定配比為3∶1時對DPPH自由基清除表現(xiàn)為協(xié)同作用，1∶1表現(xiàn)為相加作用，1∶3表現(xiàn)為拮抗作用。復(fù)配為1∶1、1∶3和3∶1時均對ABTS有協(xié)同作用，并且復(fù)配組合中協(xié)同作用強弱為：1∶3＞1∶1＞3∶1。

值得一提的是在復(fù)配中兩者只對ABTS表現(xiàn)出了極強的協(xié)同抗氧化效果，可能與DPPH和ABTS自由基清除實驗的機制不同有關(guān)。DPPH自由基清除實驗的機制是向DPPH自由基溶液中加入自由基清除劑，孤對電子被配對，深紫色的DPPH自由基被還原成黃色DPPH-H非自由基形式，其褪色程度與所接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系［13］。ABTS自由基清除實驗的機制ABTS在適當?shù)难趸瘎┳饔孟卵趸删G色的ABTS+，在抗氧化物存在時ABTS+的產(chǎn)生會被抑制［14］。而對于協(xié)同作用的機制，相關(guān)報道認為當兩種或者兩種以上的抗氧化劑復(fù)配使用時，單個抗氧化劑在氧化之后，很可能使得產(chǎn)生的游離基相互作用生成新的抗氧化物質(zhì)，繼續(xù)發(fā)揮抗氧化作用，使其抗氧化性能得以增強［15］。因此，對于鵝掌楸苷與光甘草定的抗氧化協(xié)同機制還需進一步研究。

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（本文編輯：高 杉，于春泉）

Study on synergistic antioxidant activities of Liriodendrin and Glabridin

FENG Qian-ru1，YE Liu-qing2，LIU Yuan-yuan2，GONG You-ming1，LI Hong-yan3，WANG Yan2
（1.Pharmaceutical Department of Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510120，China；2.School of Traditional Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；3.College of Pharmacy，Nankai University，Tianjin 300071，China）

［Objective］To evaluate the synergistic antioxidant activities of Liriodendrin and Glabridin.［Methods］The DPPH and ABTS radicals scavenging assay were established to detect the synergistic antioxidant activities of components.Isobologram method was also established to study the synergistic result.［Results］There was a synergistic antioxidant effect between Liriodendrin and Glabridin in DPPH radicals scavenging assay when the mass ratio was 3∶1，addictive effect when the mass ratio was 1∶1 and antagonistic effect when the mass ratio was 1∶3.There was a synergistic antioxidant effect between Liriodendrin and Glabridin in ABTS radicals scavenging assay when the mass ratio was 3∶1，1∶1 and 1∶3.And the synergistic antioxidant effect was 1∶3＞1∶1＞3∶1.［Conclusion］There was a synergistic antioxidant effect between Liriodendrin and Glabridin according to a certain proportion of compound.

Liriodendrin；Glabridin；synergistic effect；antioxidant activity

R285.5

A

1672-1519（2016）10-0624-05

西青區(qū)科技型中小企業(yè)發(fā)展專項資金項目（XQK H2013-011）。

馮倩茹（1976-），女，碩士研究生，副主任中藥師，研究方向為中藥學(xué)相關(guān)工作。

王 艷，E-mail：paozhijiaoxue@126.com。

2016-05-12）

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.10.12