基于解離度控制的桑枝生物堿樹脂分離工藝優(yōu)化*

牛安松，劉志華，金毅群，朱向陽，劉玉玲

（1.中國醫(yī)學科學院藥物研究所，天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室，北京 100050；2.中國醫(yī)學科學院藥物研究所，藥物傳輸技術(shù)及新型制劑北京重點實驗室，北京 100050；3.北京五和博澳藥業(yè)有限公司，北京 102600）

·中藥研究·

基于解離度控制的桑枝生物堿樹脂分離工藝優(yōu)化*

牛安松1，2，劉志華1，2，金毅群3，朱向陽3，劉玉玲1，2

（1.中國醫(yī)學科學院藥物研究所，天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室，北京 100050；2.中國醫(yī)學科學院藥物研究所，藥物傳輸技術(shù)及新型制劑北京重點實驗室，北京 100050；3.北京五和博澳藥業(yè)有限公司，北京 102600）

［目的］基于生物堿解離常數(shù)（pKa）與氨基酸等電點（pI）的差異，篩選樹脂處理的活化劑種類，優(yōu)化桑枝生物堿分離純化工藝。［方法］分別采用常規(guī)的鹽酸及不同pH值的緩沖液為活化劑對732陽離子樹脂進行處理，柱前衍生化-高效液相色譜（HPLC）法對生物堿及氨基酸進行分析，比較桑枝水提液經(jīng)吸附交換后的生物堿與氨基酸泄漏曲線，測定1-脫氧野尻霉素（DNJ）吸附量，考察氨水洗脫后產(chǎn)物中生物堿的色譜純度。［結(jié)果］常規(guī)的鹽酸活化劑處理樹脂，生物堿及總氨基酸均未泄漏，而采用pH 5.6及4.6的緩沖液作為活化劑，總氨基酸提前泄漏；與pH 5.6緩沖液相比，pH降至4.6時，生物堿吸附量由1.84 mg/g（DNJ質(zhì)量/樹脂質(zhì)量）提高至2.23 mg/g；緩沖液處理后的生物堿提取物，色譜純度由23.6%提高至79.6%。［結(jié)論］通過調(diào)節(jié)樹脂的pH值環(huán)境，可使生物堿和氨基酸以不同的解離狀態(tài)存在，減少氨基酸吸附，提高陽離子樹脂吸附選擇性，提高生物堿分離純化效果。

桑枝生物堿；1-脫氧野尻霉素；陽離子交換樹脂；解離常數(shù)；吸附選擇性

文獻報道［8-9］，桑枝中所含的氨基酸與桑葉類似，以天冬氨酸（pI=2.77）、谷氨酸（pI=3.15）、脯氨酸（pI=6.3）、丙氨酸（pI=6.0）和精氨酸（pI=10.76）為主。其中除精氨酸為堿性外，其余均為中性或酸性氨基酸，pI在2.77±6.3之間，均低于生物堿的pKa值。

前期曾有學者根據(jù)氨基酸等電點不同，對混合氨基酸進行分離純化［10］。但基于生物堿pKa值與氨基酸pI值的差異，通過控制藥物的解離度，優(yōu)化桑枝生物堿樹脂分離純化工藝，國內(nèi)外均未見報道。為此，本研究擬利用生物堿pKa與中性和酸性氨基酸pI的差異，通過對樹脂活化劑的優(yōu)選，將樹脂分離的pH值環(huán)境調(diào)節(jié)至低于生物堿的pKa值，且控制在氨基酸的等電點范圍內(nèi)，以確保生物堿解離為陽離子狀態(tài)，而氨基酸則更多以［HOOC-RH-NH3］分子或［OOC-RH-NH3］-形式存在?；谥行院退嵝园被岬膒I范圍，考察不同pH值環(huán)境對樹脂吸附生物堿的影響，為提高樹脂吸附選擇性、優(yōu)化桑枝生物堿分離純化工藝提供支持。

1 實驗材料及儀器

高效液相色譜儀Angilent1100；電子天平MS104S（萬分之一，梅特勒-托利多北京有限公司）；桑枝（藥材采自廣西）；鈉型市售732陽離子交換樹脂（國藥集團化學試劑有限公司，批號20140922）；DNJ對照品（自制，純度在98%以上）；FA對照品（MedChem Express，批號HY-13005）；9-氯甲酸芴甲酯（FOMC-Cl，Sigma公司）；乙腈為色譜純；氨基酸、二水合檸檬酸三鈉、鹽酸、乙酸鈉、乙酸磷酸氫二鈉、檸檬酸均為分析型。

2 實驗方法

2.1 桑枝生物堿及氨基酸分離與檢測

2.1.1 色譜條件 參考文獻［11］，按柱前衍生化-高效液相（HPLC）色譜方法，DIKMA C18柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流速：1.5 mL/min；柱溫32℃；進樣量10 μL；檢測波長：264 nm。

表1 HPLC梯度洗脫程序Tab.1 HPLC gradient eluted program

2.1.2 系統(tǒng)適用性 1）對照溶液制備：分別精密稱取DNJ、FA及20種不同氨基酸10 mg，置50 mL量瓶中，加水適量，超聲5 min，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過。2）系統(tǒng)適用性：精密量取上述對照溶液各1 mL，置具塞試管中，精密加入200 mmol/L碳酸氫鈉1 mL，搖勻，再精密加入5 mmol/L FMOC-Cl丙酮溶液2 mL，搖勻，30℃加熱30 min，精密加入0.1%乙酸4 mL，搖勻，濾過，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，依法測定，記錄色譜圖，考察分離檢測效果。

2.2 樹脂活化劑選擇及樹脂再生處理 1）樹脂裝柱：取鈉型732陽離子交換型濕樹脂90 g，分裝于2.5 cm×30 cm層析柱中，加入過量去離子水，反復(fù)沖洗樹脂。2）活化劑選擇及樹脂再生處理：采用如下不同pH值的活化劑，對樹脂柱進行再生處理。常規(guī)活化劑處理：以2 mol/L鹽酸為活化劑，以1.5個柱體積（BV）/h的流速洗脫樹脂，用量約2.5 BV，最后用水沖洗至出水pH=5左右，備用。改良活化劑處理：以pH=5.6及pH=4.6的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（CNa+=0.2 mol/L）代替常規(guī)的鹽酸，進行樹脂活化處理，備用。

2.3 不同pH值的樹脂環(huán)境對桑枝生物堿吸附與分離的影響

2.3.1 桑枝水提液的制備及柱前衍生化-HPLC測定 取桑枝5 kg，加入6倍水，煎煮2次，分別1.5 h、 1 h，合并煎煮液，濾過，離心濃縮。取濃縮液，精密量取1 mL，照2.1項下方法進行衍生化處理和HPLC測定，記錄色譜圖中DNJ、FA及總氨基酸的峰面積，另根據(jù)DNJ對照溶液結(jié)果，按外標法計算濃縮液中DNJ的含量。

2.3.2 樹脂上樣吸附與洗脫 取2.3.1項下的桑枝水提濃縮液280 mL共3份，分別上樣于2.2.2項下不同活化劑處理得到的3種樹脂柱，流速3 BV/h，按50 mL收集流份，共5份，約280 mL，用0.5 mol/L氨水洗脫至酸性硅鎢酸試劑無反應(yīng)，合并洗脫液并蒸干，得“生物堿純化產(chǎn)物”。

2.3.3 不同pH值的樹脂環(huán)境對吸附選擇性的影響 1）泄漏曲線考察：取2.3.2項下的流份各1 mL，照2.1項下方法進行衍生化處理和HPLC測定，記錄色譜圖中DNJ、FA及總氨基酸的峰面積。以流份數(shù)為X軸，以泄漏液中生物堿（以DNJ、FA計）及總氨基酸峰面積Y軸，分別繪制泄漏曲線。2）樹脂對DNJ的吸附量考察：根據(jù)2.3.1項下的桑枝水提液DNJ的含量測定結(jié)果，按280 mL上樣體積，計算樹脂對DNJ的吸附量：樹脂吸附量（mg/g）=（上樣量-流份體積×流份DNJ濃度）/樹脂質(zhì)量。3）生物堿提取物的色譜純度考察：取2.3.2項下氨水洗脫后的“生物堿純化產(chǎn)物”約10 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加水適量，超聲5 min，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量續(xù)濾液1 mL，照2.1項下方法進行衍生化處理和HPLC測定，記錄色譜圖中DNJ、FA的峰面積，以及除溶劑峰及衍生化試劑峰以外的色譜峰面積的總和，歸一化法按下式計算生物堿占總峰面積的相對百分比例，考察以“DNJ與FA”計的生物堿色譜純度。生物堿百分比例=（DNJ+FA）峰面積/除溶劑峰及衍生化試劑峰以外的色譜峰面積總和。另根據(jù)DNJ對照溶液結(jié)果，按外標法計算產(chǎn)物中DNJ的含量。

3 結(jié)果與討論

3.1 生物堿及氨基酸分離檢測的系統(tǒng)適用性實驗 在2.1項中柱前衍生化-HPLC色譜條件下，桑枝生物堿的主要成分DNJ、FA，以及20種氨基酸的色譜圖如圖1所示，基于柱衍生化-HPLC檢測原理，化學結(jié)構(gòu)中含有氨基的成分均可發(fā)生衍生化反應(yīng)，因此，色譜圖除溶劑峰及衍生化試劑峰外，其余為生物堿和氨基酸的總色譜峰。圖1中，1號為溶劑峰；17號為衍生化試劑峰。18、19號分別為DNJ、FA峰，2-16為氨基酸。比較各色譜圖的保留時間，生物堿主要成分DNJ為10.7 min，F(xiàn)A為12.8 min，而氨基酸在相應(yīng)位置沒有色譜峰，提示氨基酸與生物堿的主要成分DNJ和FA可實現(xiàn)良好分離。

3.2 桑枝水提濃縮液柱前衍生化-HPLC測定結(jié)果 根據(jù)圖2結(jié)果，DNJ及FA的峰面積分別為9.54%、5.58%，氨基酸的總峰面積為84.88%，表明提取液中DNJ及FA含量較低，而氨基酸含量較高。根據(jù)對照溶液結(jié)果，按外標法計算，提取濃縮液中DNJ的質(zhì)量分數(shù)為0.80%。

3.3 不同pH的樹脂環(huán)境對生物堿吸附與分離效果的影響

3.3.1 不同活化劑的泄漏曲線比較 結(jié)果表明以鹽酸為活化劑，生物堿以及總氨基酸均未泄漏，幾乎完全被樹脂吸附，此時樹脂表現(xiàn)為對生物堿、氨基酸吸附選擇性較差；以pH 4.6、pH 5.6的緩沖液為活化劑時，泄漏液中存在大量氨基酸，而生物堿比例較少，此時樹脂表現(xiàn)為對生物堿具有選擇性吸附作用，且pH 4.6與pH 5.6的生物堿的選擇吸附效果接近。見圖3。

圖1 桑枝生物堿DNJ（A）、FA（B）和20種氨基酸（C）的柱前衍生化-HPLC色譜圖Fig.1 RP-HPLC with pre-column derivatization chromatograms of DNJ（A），F(xiàn)A（B）和20 amino acids（C）

圖2 桑枝提取濃縮液的色譜圖Fig.2 Chromatograms of concentrated solution extracted from mulberry branches

3.3.2 不同活化劑的DNJ吸附量比較 結(jié)果如表2所示，以鹽酸為活化劑的樹脂常規(guī)處理方法，DNJ的吸附量為2.93 mg/g，pH 5.6緩沖液處理后DNJ的吸附量為1.84 mg/g，pH 4.6緩沖液處理后DNJ的吸附量為2.23 mg/g。由此提示，緩沖液代替鹽酸，會使生物堿吸附量有所下降，pH越高，與生物堿的pKa值（7.53）差值相對較小，吸附量則越低。

圖3 不同活化劑處理樹脂生物堿（A，以DNJ、FA計）及總氨基酸（B）的泄漏曲線Fig.3 Leakage curves of alkaloids（A，DNJ，F(xiàn)A-based）and total amino acids（B）by regenerating agent

表2 不同活化方式對732陽離子樹脂吸附量影響（以DNJ計）Tab.2 Adsorption quantity of 732 resin（DNJ-based）by different regenerating reagent

圖4 不同活化劑處理樹脂后的生物堿提取物HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of products by different regenerating agent

3.3.3 不同活化劑對生物堿提取物色譜純度的影響 對鹽酸及pH 5.6磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液為活化劑處理樹脂后的生物堿提取物按2.1方法進行測定，HPLC色譜圖如下圖4所示。桑生物堿以1-DNJ，F(xiàn)A為主，通過調(diào)節(jié)樹脂內(nèi)環(huán)境pH，保證生物堿以陽離子形式被吸附于酸性樹脂，當pH在4.6～5.6時，使其接近氨基酸pI后，酸性樹脂對氨基酸的吸附量急劇減小，非常有利于對氨基酸雜質(zhì)的去除。圖譜可見緩沖液預(yù)處理的產(chǎn)物雜質(zhì)峰明顯減少。根據(jù)圖4色譜圖，樹脂常規(guī)鹽酸活化后生物堿峰面積（以DNJ和FA計）占總峰面積的23.6%，DNJ質(zhì)量分數(shù)為7.05%。pH 5.6緩沖液活化后生物堿峰面積（以DNJ和FA計）占總峰面積的79.6%，DNJ質(zhì)量分數(shù)為13.96%，表明生物堿分離純化效果顯著提高。

4 結(jié)論

鹽酸是723強酸型陽離子樹脂再生的常規(guī)活化劑，由于交換過程的H+置換，樹脂內(nèi)環(huán)境成酸性，氨基酸與生物堿同時以陽離子形式存在，表現(xiàn)為樹脂對生物堿、氨基酸吸附?jīng)]有選擇性。調(diào)節(jié)樹脂環(huán)境pH在4.6～5.6時，接近氨基酸pI時，通過影響解離度使氨基酸在樹脂上的吸附降低。此時pH遠小于生物堿pKa，DNJ以陽離子形式被樹脂吸附；兩種pH的緩沖液相比，pH值由5.6調(diào)節(jié)至4.6時，對吸附選擇性沒有明顯影響，但生物堿吸附量明顯增加；通過緩沖液調(diào)節(jié)樹脂內(nèi)環(huán)境pH，對其進行活化處理，經(jīng)氨水洗脫得到的生物堿產(chǎn)物中，生物堿含量明顯提高。本研究基于氨基酸pI與生物堿pKa的差異，以緩沖液代替常規(guī)的鹽酸作為活化劑，通過調(diào)節(jié)樹脂的pH值環(huán)境，既可減少陽離子樹脂對氨基酸的吸附，又可確保生物堿的吸附量并提高吸附選擇性。研究取得的結(jié)果，為提高桑枝生物堿分離純化效果提供了理論基礎(chǔ)及實驗數(shù)據(jù)支持。

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（本文編輯：高 杉，于春泉）

Optimization the purification progress on mulberry alkaloids based on the dissociation constants

NIU An-song1，2，LIU Zhi-hua1，2，JIN Yi-qun3，ZHU Xiang-yang3，LIU Yu-ling1，2
（1.Chinese Academy of Medical Sciences，State Key Laboratory of Bioactive Substances and Function of Natural Medicines，Beijing 100050，China；2.Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing City Key Laboratory of Drug Delivery Technology and Novel Formulations，Beijing 100050，China；3.Beijing Wehand-Bio Pharmaceutical Co.LTD.，Beijing 102600，China）

［Objective］To select optimum regenerating agent of ion-exchange resin and optimize purification of mulberry alkaloids based on the pKa of the alkaloids and the pI of amino acids.［Methods］The 732 resins were regenerated with hydrochloric acid and different pH buffer solution，respectively.The productions were determined by RP-HPLC with pre-column derivatization.This article calculated the leakage amount of alkaloids and amino acids the adsorbing amount.Meanwhile it also determined the peak ratio of alkaloids in products.［Results］Ultimately，the total amino acids leaked in a short time with the buffer solution at pH 4.6 as regenerating agent.However，both of the alkaloids and amino acids didn't leak with hydrochloric acid as regenerating agent.The adsorption amount was increased from 1.84 to 2.23 mg/g with the buffer solution at pH 4.6 compared to pH 5.6.The relative peak ratio of the alkaloids in productions is 79.6%with the buffer solution at pH 5.6 as regenerating agent，and 23.6%with hydrochloric acid as regenerating agent.［Conclusion］Through adjusting the pH of resin separation and controlling the dissociation degree of the alkaloids and the amino acids，the purity of the production was improved with decreased adsorption of amino acids and increased selectivity of the resin.

mulberry alkaloids；1-deoxynojirimycin；cation exchange resin；dissociation constant；selective adsorption

R284.2

A

1672-1519（2016）10-0619-05

“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項（2013ZX09101-005）；“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（2012ZX09309002-001-008）；北京市科技計劃“十病十藥”研發(fā)（Z11100059011010）。

牛安松（1990-），男，碩士研究生在讀，研究方向為中藥有效組分提取分離及質(zhì)控。

劉玉玲，E-mail：ylliu@imm.ac.cn。

2016-05-25）

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.10.11