黃芪預(yù)處理對大鼠腸系膜缺血/再灌注損傷的影響及機制

裴志萍，牛文革，柴靜波，孟 潔

（1.邯鄲市第二醫(yī)院外一科，邯鄲 056001；2.邯鄲市第二醫(yī)院產(chǎn)科，邯鄲 056001）

黃芪預(yù)處理對大鼠腸系膜缺血/再灌注損傷的影響及機制

裴志萍1，牛文革1，柴靜波2，孟 潔1

（1.邯鄲市第二醫(yī)院外一科，邯鄲 056001；2.邯鄲市第二醫(yī)院產(chǎn)科，邯鄲 056001）

［目的］研究黃芪預(yù)處理對大鼠腸系膜缺血/再灌注損傷的影響并探討其機制。［方法］取120只實驗用大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、銀杏葉提取物（3.15 mg/kg）預(yù)處理組和黃芪（5、10、20 g/kg）預(yù)處理組，每組20只，術(shù)前7 d開始腹腔注射給藥（每日1次），采用夾閉腸系膜上動脈45 min的方法制備腸系膜缺血再灌注大鼠模型。再灌注2 h后，取腸組織觀察并測定腸組織含水量，蘇木精-伊紅（HE）染色觀察腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化并進行Chiu's評分。檢測腸組織中抗氧化酶［超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）］活性、丙二醛（MDA）含量、C反應(yīng)蛋白（CRP）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）含量、細胞凋亡狀況并計算凋亡指數(shù)（AI）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（Caspase-9）活性、NF-κB蛋白表達并進行半定量分析。［結(jié)果］與模型組比較，黃芪預(yù)處理組大鼠腸組織外觀明顯紅潤、水腫狀況明顯改善，腸組織病變明顯較輕。黃芪（10、20 g/kg）預(yù)處理組腸組織含水量顯著降低，Chiu's評分顯著低于模型組，腸組織中SOD、CAT活性顯著升高且MDA含量顯著降低，CRP、TNF-α、IL-6含量顯著降低，其中20 g/kg預(yù)處理組IL-1β含量顯著降低且IL-10含量顯著升高。黃芪預(yù)處理各組腸系膜細胞凋亡狀況明顯較輕，其中黃芪（10、20 g/kg）預(yù)處理組AI顯著降低，腸組織中Caspase-3、Caspase-9活性顯著降低、NF-κB蛋白表達顯著下調(diào)，上述差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。［結(jié)論］黃芪預(yù)處理具有抑制大鼠腸系膜缺血/再灌注損傷的作用，其作用機制可能與黃芪能夠降低氧化應(yīng)激損傷、抑制炎癥反應(yīng)和細胞凋亡有關(guān)。

黃芪預(yù)處理；腸系膜；缺血再灌注；影響；機制

腸系膜缺血/再灌注損傷是腸道手術(shù)中常見的并發(fā)癥之一，是嚴(yán)重創(chuàng)傷、休克、心肺功能不全等救治過程中共有的病理過程。近年來，隨著病理生理學(xué)研究的深入，發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)以及繼發(fā)的腸系膜細胞凋亡是腸系膜缺血/再灌注損傷發(fā)生發(fā)展的重要病理機制之一［1-4］。黃芪為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有補氣固表，利尿托毒，排膿，斂瘡生肌之功效，為常用中藥之一?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，黃芪預(yù)處理對腦組織和心肌組織缺血/再灌注損傷均具有顯著的保護作用［5-7］，但是否對腸系膜缺血/再灌注損傷具有保護作用仍未見文獻報道。本實驗采用黃芪預(yù)處理7 d后，通過夾閉腸系膜上動脈45 min后去夾恢復(fù)血流再灌注的方法制備的腸系膜缺血/再灌注大鼠模型，研究黃芪預(yù)處理對大鼠腸系膜缺血/再灌注損傷的保護作用，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物與試劑 黃芪注射液（成都地奧九泓制藥廠，20 g：10 mL，批號：20141209）；銀杏葉提取物（神威藥業(yè)集團有限公司，17.5 g：5 mL，批號：140725）；蘇木精-伊紅（HE）試劑盒、原位末端標(biāo)記（TUNEL）試劑盒，C反應(yīng)蛋白（CRP）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）試劑盒，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（Caspase-9）酶聯(lián)免疫（ELISA）試劑盒購自北京博奧森生物工程有限公司；核因子-κB（NF-κB）單抗購自碧云天公司；抗氧化酶活性 ［超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）］試劑盒和丙二醛（MDA）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 動物 清潔級雄性Wistar大鼠（8周齡，180～220 g），由河北省實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（冀）2008-1-003。

1.3 動物分組與模型制備 將120只實驗用大鼠按照隨機數(shù)字表法隨機分為假手術(shù)組、模型組、銀杏葉提取物（3.15 mg/kg）預(yù)處理組和黃芪（5、10和20 g/kg）預(yù)處理組。各預(yù)處理組于術(shù)前7 d開始腹腔注射給藥，每日1次，其中假手術(shù)組和模型組分別給予等體積的生理鹽水。參照朱枝祥等［8］報道的實驗方法制備腸系膜缺血/再灌注大鼠模型，造模結(jié)果的判定：夾閉腸系膜上動脈后腸管顏色變暗，松開動脈夾后顏色逐漸變紅，即可判定造模成功。

1.4 腸組織觀察及含水量的測定 麻醉后開腹觀察回盲部腸管外觀并取回盲部10 cm以上的相同部位4 cm的腸管，稱量濕質(zhì)量（W1）；置于107℃烘烤72 h后稱量干質(zhì)量（W2），計算腸組織含水量：含水量（%）=［（W1-W2）/W1］×100

1.5 腸組織病變的觀察及Chiu's評分 取大鼠腸管組織并置于4%多聚甲醛溶液固定后，經(jīng)石蠟包埋、切片（厚度約5 μm）后，行常規(guī)HE染色，通過光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠腸組織病理性形態(tài)學(xué)變化；然后參照Chiu等［9］報道的方法進行腸組織損傷評分（Chiu's6級評分標(biāo)準(zhǔn)）：0分：結(jié)構(gòu)正常；1分：腸黏膜絨毛頂端上皮下間隙增寬；2分：絨毛尖端上皮抬高與固有層剝離；3分：絨毛兩側(cè)上皮成塊脫落；4分：上皮完全脫落，僅存固有層結(jié)構(gòu)；5分：黏膜固有層崩解、出血和潰瘍。

1.6 腸組織中SOD、CAT活性，MDA含量及CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量的測定 取腸組織、研磨勻漿，經(jīng)3 000 r/min離心10 min后取上清液，按照試劑盒說明進行操作，通過紫外-可見分光光度計測定腸組織中SOD、CAT活性和MDA含量；按照ELISA試劑盒說明進行操作，通過酶標(biāo)儀測定腸組織中CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量水平。

1.7 細胞凋亡狀況的觀察及凋亡指數(shù)的測定 石蠟組織切片經(jīng)脫蠟水化處理后，按照TUNEL試劑盒方法依步進行處理，通過光學(xué)顯微鏡進行觀察（細胞核黃染為陽性著色）。凋亡指數(shù)（AI）的計算：每張染色切片隨機選取6個視野，計數(shù)每個視野中總細胞數(shù)和陽性細胞數(shù)，然后計算AI值：AI（%）=（陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)）×100

1.8 腸組織中Caspase-3和Caspase-9活性的測定

參照陳良金等［10］報道的方法：取腸管組織，加入適量冷裂解液后行研磨勻漿，經(jīng)3000 r/min離心10min后取上清液，各組均取等量蛋白加入5μLCaspase-3作為底物，經(jīng)37℃避光孵育4 h后，測定405nm處A值，以“實驗組A值/對照組A值”表示Caspase-3的活性；Caspase-9活性檢測方法同Caspase-3活性檢測方法。

1.9 腸組織中NF-κB蛋白表達的檢測及半定量分析 取1.8制備的腸組織勻漿液，經(jīng)12 000 r/min低溫（4℃）離心20 min后取沉淀，采用BCA法行蛋白定量，變性后上樣、電泳（待溴酚藍接近膠底部時停止）、轉(zhuǎn)膜、春紅溶液染色，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗（NF-κB，β-actin）4℃過夜；洗膜，二抗室溫搖床上孵育1 h后經(jīng)增強化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯色，實驗結(jié)果應(yīng)用Quantity One軟件進行分析。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法 運用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 18.0進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett's T3法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腸組織表觀及含水量 模型組大鼠腸組織明顯黑暗、呈水腫狀；較模型組，黃芪預(yù)處理組腸組織較為紅潤、水腫癥狀明顯較輕，以黃芪20 g/kg組效果最為顯著。計算含水量：模型組大鼠腸組織含水量較假手術(shù)組顯著升高（P＜0.01）；較模型組，黃芪（10、20 g/kg）預(yù)處理組腸組織含水量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），見表1。

2.2 各組大鼠腸系膜病變及Chiu's評分 模型組大鼠腸系膜較假手術(shù)組呈現(xiàn)明顯的病理性形態(tài)學(xué)變化：黏膜上皮細胞脫落，絨毛尖端上皮抬高與固有層分離，中性粒細胞浸潤等；而較模型組，黃芪預(yù)處理組大鼠腸組織病變明顯較輕，以20 g/kg組效果最為顯著，結(jié)果見圖1。Chiu's評分：模型組大鼠腸組織Chiu's評分較假手術(shù)組顯著升高（P＜0.01）；而較模型組，黃芪（10、20 g/kg）預(yù)處理組大鼠Chiu's評分顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），結(jié)果見表1。

圖1 各組大鼠腸系膜病變（HE×400）Fig.1 Histopathological changes of mesentery of rats in each group（HE×400）

表1 各組大鼠腸組織含水量、Chiu's評分（±s）Tab.1 Water content and Chiu's score in mesentery of rats in each group（±s）

表1 各組大鼠腸組織含水量、Chiu's評分（±s）Tab.1 Water content and Chiu's score in mesentery of rats in each group（±s）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

Chiu's評分（分）假手術(shù)組 73.0±5.2 0.35±0.14模型組 83.8±5.6**3.94±0.70**黃芪預(yù)處理組 82.9±5.1 3.62±0.75 78.4±4.6#2.78±0.54#76.3±4.8##1.86±0.43##銀杏葉提取物預(yù)處理組 78.7±4.1#2.65±0.57#組別 含水量（%）動物數(shù)10 10 10 10 10 10劑量（g/kg）--05 10 20 3.15×10-3

2.3 各組大鼠腸組織SOD、CAT活性和MDA含量 模型組大鼠腸組織中SOD、CAT活性較假手術(shù)組顯著降低且MDA含量顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，黃芪（10、20 g/kg）預(yù)處理組大鼠SOD、CAT活性顯著升高、MDA含量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠腸組織中SOD、CAT活性和MDA含量（±s）Tab.2 Activity of SOD，CAT and the contents of MDA in mesentery of rats in each group（±s）

表2 各組大鼠腸組織中SOD、CAT活性和MDA含量（±s）Tab.2 Activity of SOD，CAT and the contents of MDA in mesentery of rats in each group（±s）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 SOD（U/mg prot）假手術(shù)組 70.4±8.1模型組 36.5±5.3**黃芪預(yù)處理組 38.7±6.0 44.2±6.5#57.9±7.4##銀杏葉提取物預(yù)處理組 48.0±6.2#動物數(shù)10 10 10 10 10 10劑量（g/kg）--05 10 20 3.15×10-3CAT（U/mg prot）27.3±4.8 15.0±3.6** 17.1±3.5 21.0±4.2#25.3±4.8##22.1±3.7#MDA（nmol /mg prot）5.6±1.3 17.4±3.0** 14.9±2.8 11.3±2.4##08.2±1.7##07.4±1.9##

2.4 各組大鼠腸組織中CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量 模型組大鼠腸組織中CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6含量較假手術(shù)組顯著升高（P＜0.01），IL-10含量顯著降低（P＜0.01）；而較模型組，黃芪（10、20 g/kg）預(yù)處理組大鼠腸組織中CRP、TNF-α、IL-6含量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），20 g/kg預(yù)處理組IL-1β含量顯著降低且IL-10含量顯著升高（P＜0.05），結(jié)果見表3。

2.5 各組大鼠腸系膜細胞凋亡狀況及AI 模型組凋亡細胞數(shù)量較假手術(shù)組明顯增多，而經(jīng)黃芪預(yù)處理7 d能夠明顯降低腸系膜缺血/再灌注大鼠腸系膜細胞凋亡數(shù)量，結(jié)果見圖2。計算AI：假手術(shù)組AI為（2.2±0.4）%，模型組AI為（42.5±5.1）%，黃芪（5、10、20 g/kg）組AI分別為（37.4±5.3）%、（18.9±3.6）%、（12.5±2.4）%，銀杏葉提取物組AI為（21.7±3.3）%；模型組AI較假手術(shù)組顯著升高（P＜0.01）；較模型組，黃芪（10、20 g/kg）組AI顯著降低（P＜0.01）。

圖2 各組大鼠腸系膜細胞凋亡狀況（TUNEL×400）Fig.2 Apoptosis of mesentery cells of rats in each group （TUNEL×400）

2.6 各組大鼠腸組織中Caspase-3、Caspase-9的活性 模型組大鼠腸組織中Caspase-3、Caspase-9活性較假手術(shù)組均顯著升高（P＜0.01），與模型組比較，黃芪（10、20 g/kg）預(yù)處理組Caspase-3、Caspase-9活性顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），結(jié)果見表4。

表3 各組大鼠腸組織中CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量（±s）Tab.3 Contents of CRP，TNF-α，IL-1β，IL-6 and IL-10 in mesentery of rats in each group（±s）

表3 各組大鼠腸組織中CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量（±s）Tab.3 Contents of CRP，TNF-α，IL-1β，IL-6 and IL-10 in mesentery of rats in each group（±s）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

CRP（mg/g）假手術(shù)組 44.2±5.3模型組 186.5±21.7**黃芪預(yù)處理組 159.1±26.4 134.8±23.0#97.5±16.8##銀杏葉提取物預(yù)處理組 128.4±20.9#組別動物數(shù)10 10 10 10 10 10劑量（g/kg）--05 10 20 3.15×10-3TNF-α（ng/g）10.2±1.6 46.3±5.8** 42.0±5.6 35.1±4.7#21.9±3.5##32.6±4.2#IL-1β（ng/g）46.2±5.8 93.5±10.7** 86.1±9.5 79.2±8.4 65.8±7.7#81.5±8.6 IL-6（ng/g）56.9±7.3 197.3±32.5** 172.8±39.0 145.0±31.2#102.6±30.7##157.1±36.0#IL-10（ng/g）78.6±7.4 50.7±6.3** 58.3±6.8 62.9±7.4 67.1±8.6#59.0±7.5

2.7 各組大鼠腸組織NF-κB蛋白表達 模型組大鼠腸組織NF-κB蛋白表達較假手術(shù)組顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪（10、20 g/kg）預(yù)處理組大鼠NF-κB蛋白表達顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），結(jié)果見圖3和表4。

圖3 各組大鼠腸組織NF-kB蛋白表達Fig.3 Expression of NF-kB protein in mesentery of rats in each group

表4 各組大鼠腸組織中Caspase-3、Caspase-9、NF-κB表達的影響（±s）Tab.4 Expression of Caspase-3，Caspase-9 and NF-κB in mesentery of rats in each group（±s）

表4 各組大鼠腸組織中Caspase-3、Caspase-9、NF-κB表達的影響（±s）Tab.4 Expression of Caspase-3，Caspase-9 and NF-κB in mesentery of rats in each group（±s）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 Caspase-3 （×10-3）假手術(shù)組 59.1±8.0模型組 113.5±12.4**黃芪預(yù)處理組 102.7±13.6 84.3±11.5##70.6±9.2##銀杏葉提取物預(yù)處理組 88.1±12.4#動物數(shù)10 10 10 10 10 10劑量（g/kg）--05 10 20 3.15×10-3Caspase-9 （×10-3）70.4±12.6 132.9±18.5** 117.8±22.4 104.1±17.5#85.2±15.0##97.4±16.2#NF-κB/ β-actin 0.18±0.05 0.62±0.14** 0.49±0.12 0.36±0.09#0.27±0.08##0.35±0.10#

3 討論

缺血/再灌注后，隨著氧的大量涌入而導(dǎo)致氧自由基的大量產(chǎn)生和過剩，為氧化應(yīng)激損傷的病理基礎(chǔ)。正常生理狀態(tài)下，體內(nèi)生成的氧自由基能夠在超氧化物歧化酶（SOD）作用下還原生成過氧化氫（H2O2），并在CAT催化作用下進一步被還原生成對人體無害的水（H2O）和氧氣（O2）［11-13］；脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA含量也能夠間接反映系膜細胞氧化損傷程度。細胞炎性因子CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6也是臨床上用來監(jiān)測體內(nèi)炎癥反應(yīng)的常用指標(biāo)［14-15］。

細胞凋亡是由多種蛋白參與調(diào)控的程序性死亡過程，其中Caspases蛋白家族參與細胞凋亡啟動以及整個過程的調(diào)節(jié)，Caspase-3被認為是各種凋亡刺激因子激活的關(guān)鍵蛋白酶［16］，而Caspase-9為Caspase-3的活化刺激因子［17］。細胞凋亡具有多種誘發(fā)因素，氧化應(yīng)激損傷便為其中非常重要的因素之一［10］，NF-κB為多效能核轉(zhuǎn)錄因子，是連接氧化應(yīng)激損傷和細胞凋亡的“橋梁”。Angkeow P等［18］和Deshpande SS等［19］研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激或氧自由基可直接或間接激活NF-κB，活化的NF-κB將轉(zhuǎn)位進入細胞核內(nèi)，與凋亡相關(guān)基因如c-myc等NF-κB調(diào)控元件結(jié)合，促進基因轉(zhuǎn)錄并誘導(dǎo)細胞凋亡。

本實驗通過夾閉腸系膜上動脈45 min后去夾的方法制備的腸系膜缺血/再灌注損傷大鼠模型并以銀杏葉提取物作為陽性對照進行研究發(fā)現(xiàn)，黃芪預(yù)處理能夠有效降低腸組織含水量，改善腸系膜組織病變、降低Chiu's評分，抑制腸系膜細胞凋亡；能夠改善腸組織SOD、CAT活性并降低MDA含量，降低腸組織CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6含量并提高IL-10含量，降低Caspase-3、Caspase-9活性，下調(diào)NF-κB蛋白表達，提示黃芪預(yù)處理對大鼠腸系膜缺血/再灌注損傷具有保護作用，作用機制可能與黃芪能夠有效改善抗氧化酶活性、提高自由基清除能力、抑制炎癥細胞因子表達、降低促凋亡蛋白表達有關(guān)。

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（本文編輯：馬 英，高 杉）

Effects and mechanism of astragalus on mesentery in ischemia-reperfusion rats

PEI Zhi-ping1，NIU Wen-ge1，CHAI Jing-bo2，MENG Jie1
（1.NO.1 Department of Surgery，Second Hospital of Handan，Handan 056001，China；2.Department of Obstetrics，Second Hospital of Handan，Handan 056001，China）

［Objective］To investigate the effects and mechanism of astragalus on mesentery in ischemia-reperfusion rats.［Methods］The 120 excremental rats were randomly divided into six groups：sham operation group，model group，Ginkgo biloba extract（GB，3.15 mg/kg）pretreatment group and astragalus （5，10，20 g/kg）pretreatment groups.Severn days before surgery，the drugs were given by intraperitoneal injection，once a day.The rat models were made by clipping superior mesenteric artery.Two hours later，the appearance of mesentery tissue was observed and the water content was detected.The histopathological changes of mesentery tissue was observed by HE staining and the Chiu's score was detected，the activity of SOD，CAT and the contents of MDA in mesentery tissue were detected.The levels of CRP，TNF-α，IL-1β，IL-6 and IL-10 in mesentery tissue were detected.Tthe apoptosis of mesentery cells was observed by TUNEL staining and the apoptosis index（AI）was calculated.The activity of Caspase-3 and Caspase-9 in mesentery tissue were detected，and the expression of NF-κB was detected by Western Blot.［Results］Compared with model group，the appearance of mesentery tissue in astragalus pretreatment groups were improved，and the water content in astragalus（10，20 g/kg）pretreatment groups were significantly decreased The histopathological changes of mesentery tissue in astragalus pretreatment groups were significantly improved.The Chiu's score in astragalus（10，20 g/kg）pretreatment groups were significantly decreased.The activity of SOD and CAT in mesentery tissue was significantly increased and the contents of MDA were significantly decreased.The level of CRP，TNF-α and IL-6 in mesentery tissue of astragalus（10，20 g/kg）pretreatment groups were significantly decreased，and the level of IL-1β in 20 g/kg pretreatment group was significantly decreased and the IL-10 was significantly increased.The mesentery cells apoptosis in astragalus pretreatment groups were significantly improved and the AI in astragalus（10，20 g/kg）pretreatment groups was significantly decreased and the activity of Caspase-3，Caspase-9 in mesentery tissue were significantly decreased，and the expression of NF-κB was significantly decreased；all of the difference above were significant（P＜0.05 or P＜0.01）.［Conclusion］Astragalus had inhibitive effects on mesentery in ischemia-reperfusion rats，which perhaps related to its effects of enhancing the activity of depressing oxidative stress，inhibiting inflammation and apoptosis.

astragalus pretreatment；mesentery；ischemia-reperfusion；effect；mechanism

R543

A

1672-1519（2016）10-0614-05

2016-04-27）

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.10.10作者簡介：裴志萍（1979-），女，主治醫(yī)師，研究方向為普外科疾病診治。