豬群混合感染偽狂犬病毒及乙型腦炎病毒的鑒定與分離

劉 寧，宋 聰，高 林，謝佳芮，李華春，王靜林，姚 俊，王生奎

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明650201；2.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，昆明650224）

·簡報·

豬群混合感染偽狂犬病毒及乙型腦炎病毒的鑒定與分離

劉 寧1，宋 聰1，高 林2，謝佳芮2，李華春2，王靜林2，姚 俊2，王生奎1

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明650201；2.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，昆明650224）

云南省文山市某規(guī)模化豬場2015年7～8月頻繁發(fā)生以種公豬一側(cè)睪丸腫大，母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎及弱仔為主要臨床癥狀的繁殖障礙疫情。為了查明病因，對送檢流產(chǎn)胎豬進行病理解剖，采集胎豬及胎盤病料進行豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒歐洲型及美洲型毒株、豬細小病毒、偽狂犬病毒、乙型腦炎病毒、豬流產(chǎn)衣原體、布氏桿菌及弓形蟲PCR和realtime PCR檢測，同時應(yīng)用豬腎原代細胞及BHK-21傳代細胞進行病毒分離鑒定以及細菌分離鑒定。檢測結(jié)果顯示，從流產(chǎn)胎豬內(nèi)臟器官、大腦及胎盤組織擴增出乙型腦炎病毒prM基因及偽狂犬病毒gE基因目的條帶。序列分析結(jié)果顯示，擴增的乙型腦炎病毒prM基因序列與NCBI GenBank中的參考毒株（Accession no.AB594829.1）序列同源性達99%；偽狂犬病毒gE基因核苷酸序列與NCBI GenBank 中的參考毒株（Accession no.KT936475.1）序列同源性達100%。應(yīng)用BHK-21傳代細胞盲傳分離獲得1株可致細胞病變（cytopathic effect，CPE）的病毒株，鑒定為乙型腦炎病毒，并命名為JEV-2015-WS-YN。由此推測，引起此次豬群繁殖障礙極有可能為日本乙型腦炎病毒和偽狂犬病毒共同感染造成。

日本乙型腦炎病毒；偽狂犬病毒；混合感染

偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）屬于皰疹病毒科、皰疹病毒亞科，又稱豬皰疹病毒Ⅰ型，可引起牛、羊、貓、馬等家畜和多種野生動物產(chǎn)生以發(fā)熱、奇癢（豬除外）及腦脊髓炎為特征的急性致死性傳染病[1]，又名奧葉茲基病（Aujeszkys disease，AD）。豬是PRV主要的貯存宿主和傳染源，也可感染多種家畜和野生動物，PRV屬于典型且極難防疫的自然疫源性疾病病原之一。匈牙利學(xué)者Aujeszky在1902年對偽狂犬病首先進行了報道，隨后，Schniedhoffer證明了本病是由病毒引起的。1935年，Shope發(fā)現(xiàn)了豬在偽狂犬病的傳播過程中起到了至關(guān)重要的作用。我國研究人員1947年首次從貓身上分離到PRV[2]?，F(xiàn)在PRV感染已經(jīng)遍及全國大多數(shù)省市，給畜牧業(yè)的發(fā)展造成了重大影響。豬感染PRV后出現(xiàn)的癥狀因日齡不同而異，妊娠母豬感染后可引起流產(chǎn)，產(chǎn)木乃伊胎和死胎；哺乳仔豬感染出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，麻痹、衰竭死亡，死亡率幾乎高達100%；成年豬一般為隱性感染，不表現(xiàn)臨床癥狀，但病毒可在豬體內(nèi)保存很長時間，導(dǎo)致成年豬長期處于帶毒和排毒狀態(tài)，成為最為危險的傳染源[3]。偽狂犬病在豬群中具有傳播快、死亡率高、流行范圍廣、傳播途徑多、病原體頑固等特點，是長期以來影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的主要疫病之一，對我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失，嚴重影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展[4]。

豬乙型腦炎病毒又稱日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV），屬黃病毒科、黃病毒屬，主要以三帶喙庫蚊為傳播媒介。JEV感染是一種急性傳染病，嚴重危害人畜健康[5]。本病具有明顯的季節(jié)性和地理分布區(qū)域，常以蚊蟲較多的夏秋季多發(fā)，屬于典型的自然疫源性疾病，主要分布在南亞、東南亞、東亞以及澳大利亞等地[6,7]。豬是JEV最重要的傳染源和儲存宿主，目前JEV多為隱性感染或呈散發(fā)性。JEV在環(huán)境中不穩(wěn)定，易被消毒劑滅活[8]。據(jù)不完全統(tǒng)計，在我國大約有90%的病例發(fā)生在7～9月[9]。育肥豬感染后表現(xiàn)為持續(xù)高熱，新生仔豬主要呈現(xiàn)腦炎。妊娠母豬感染后主要的臨床表現(xiàn)為流產(chǎn)和產(chǎn)死胎，產(chǎn)下的胎兒大小不一，即使同窩差別也比較明顯，如果體內(nèi)的胎兒木乃伊化而不能排除體外，長期滯留子宮內(nèi)可誘發(fā)母豬子宮內(nèi)膜炎，引起母豬繁殖障礙。公豬感染的主要臨床癥狀是睪丸炎，常表現(xiàn)為一側(cè)睪丸腫脹，一側(cè)睪丸正常，若發(fā)現(xiàn)比較及時進行治療，可得到治愈并且繼續(xù)留為種用，從而減少經(jīng)濟損失，若經(jīng)過一定時間治療發(fā)現(xiàn)不能產(chǎn)生具有活性的精子，應(yīng)淘汰另引種公豬[10]。JEV感染對豬場造成的經(jīng)濟損失主要表現(xiàn)在母豬繁殖障礙，因此在日常的管理和免疫過程中不容忽視。

云南省文山市某規(guī)?；i場存欄經(jīng)產(chǎn)母豬365頭，后備母豬56頭，種公豬9頭。豬群經(jīng)過豬瘟、仔豬副傷寒、口蹄疫O、A型二聯(lián)滅活疫苗、豬細小病毒疫苗免疫，但未免疫豬繁殖與呼吸綜合征、偽狂犬、乙型腦炎、圓環(huán)病毒病及喘氣病疫苗。該場豬群于2014年7～8月頻繁發(fā)生以種公豬一側(cè)睪丸腫大、母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎及弱仔為主要臨床表現(xiàn)的繁殖障礙疫情，期間共發(fā)生流產(chǎn)、死產(chǎn)、木乃伊胎及產(chǎn)弱仔窩數(shù)為39窩，有5頭種公豬發(fā)生一側(cè)睪丸腫大。為了查明病因，對送檢的流產(chǎn)胎豬進行病理解剖，可見腎臟有針尖大小出血點及出血斑，腦膜充血、出血及水腫（見圖1），其余臟器未見異常。遂采集流產(chǎn)胎豬內(nèi)臟及胎盤病料進行豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬細小病毒、偽狂犬病毒、日本乙型腦炎病毒、豬流產(chǎn)衣原體、布氏桿菌及崗地弓形蟲PCR和real-time PCR檢測，同時應(yīng)用豬腎原代細胞及BHK-21傳代細胞對送檢樣品進行病毒及細菌的分離鑒定。最終從送檢的3頭流產(chǎn)胎兒的大腦及內(nèi)臟組織檢測出偽狂犬野毒gE基因及乙型腦炎病毒prM基因，測序后序列與NCBI GenBank中參考毒株序列同源性分別達99%及96%以上，并應(yīng)用BHK-21細胞系分離獲得1株JEV流行毒株。

圖1 流產(chǎn)豬胎兒及病理變化Fig.1 Aborted fetuses and pathological change

1 材料與方法

1.1 樣品 送檢1份胎盤組織及2頭流產(chǎn)胎兒（剖檢后采集大腦、肺臟、脾臟、肺門淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、腎臟進行檢測），每頭流產(chǎn)胎兒的上述內(nèi)臟組織混合勻漿后作為1份待檢樣品，大腦組織單獨勻漿后作為1份樣品，胎盤組織單獨勻漿后作為1份待檢樣品，總共制備5份待檢樣品。

1.2 細胞 豬腎原代細胞由云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室制備、凍存；BHK-21傳代細胞系由云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室凍存。

1.3 主要試劑、培養(yǎng)基及儀器 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、顯色指示劑、革蘭氏染液購自杭州濱和微生物試劑有限公司；Gico新生犢牛血清、反轉(zhuǎn)錄試劑盒AgPath-IDTMone-step RT-PCR Kit（AM1005）購自美國生命技術(shù)有限公司（Life Technologies）；病毒DNA提取試劑盒（Viral DNA Kit）、病毒RNA提取試劑盒（Viral RNA Kit）購自美國OMEGA生物技術(shù)有限公司；熒光定量qPCR及qRT-PCR試劑盒、2×Plus Taq酶、DNA Marker 2000均購自天根生物技術(shù)（北京）有限公司；一步法RT-PCR試劑盒（One Step RT-PCR Kit）購自大連寶生物（TaKaRa）生物技術(shù)有限公司。普通光學(xué)顯微鏡為OLYMPUS CX31顯微鏡；CO2培養(yǎng)箱為THERMO SCIENTIFIC公司產(chǎn)品；生物安全柜為ESCO CLASS II TYPE A2；PCR 儀 Gene Amp PCR System 9700、梯度PCR儀均購自ABI（Applied Biosystems Inc）公司。

1.4 實驗動物 昆明成年小白鼠41只，購自昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.5 引物、探針 豬瘟病毒、偽狂犬病毒、乙型腦炎病毒及豬細小病毒檢測引物及探針由云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室設(shè)計。檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒歐洲型毒株及美洲型毒株、經(jīng)典毒株及通用型引物和探針，以及豬流產(chǎn)（鸚鵡熱）衣原體，布氏桿菌，剛地弓形蟲的檢測引物及探針參考文獻[11-16]合成。以上引物及探針分別由上海Invitrogen生物科技有限公司、上海GENEray生物科技有限公司及昆明碩擎生物科技有限公司合成，詳細信息見表1。

1.6 病毒核酸的抽提 取流產(chǎn)胎兒大腦、肺臟、脾臟、肺門淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、腎臟及胎盤組織勻漿，反復(fù)凍融3次后，4500×g離心10 min，取上清液按美國OMEGA生化試劑公司的病毒基因組DNA、RNA提取試劑盒說明書操作，提取的病毒核酸－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 豬繁殖與呼吸綜合征病毒歐洲型及美洲型高致病性及經(jīng)典毒株、豬瘟病毒、豬細小病毒、豬流產(chǎn)衣原體、布氏桿菌及弓形蟲PCR及real-time PCR檢測運用云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室建立的豬瘟病毒real-time PCR和豬細小病毒PCR檢測方法，以及參考相關(guān)發(fā)表文獻中的豬繁殖與呼吸綜合征病毒歐洲型及美洲型高致病性毒株、經(jīng)典毒株，豬流產(chǎn)衣原體，布氏桿菌及剛地弓形蟲PCR及實時熒光定量PCR檢測方法對送檢樣品進行檢測[11-16]。豬瘟病毒real-time PCR反應(yīng)體系25 μL：2×One step RT-PCR buffer 12.5 μL，上下游引物CSFV-F、R（10 μmol/mL）及探針CSFV-P（10μmol/mL）各1 μL，50×Detection Enhancer 0.5 μL，25×Enzyme Mix 1 μL，模板DNA 4 μL，用無核酸酶的PCR級無離子水補足至25 μL，混勻，短暫離心后進行擴增。反應(yīng)條件：45℃ 10 min，95℃10 min，95℃3 s、60℃ 30 s運行45個循環(huán)。豬細小病毒PCR反應(yīng)體系25 μL：2×Taq Plus PCR Master mix 12.5 μL，上下游引物PPV-VP2-F、R（10 μmol/mL）各1 μL，模板DNA4 μL，用無核酸酶的PCR級無離子水補足至25 μL，混勻，短暫離心后進行擴增。反應(yīng)條件為94℃5 min，95℃ 30 s、57℃ 30 s、72℃40 s運行35個循環(huán)，72℃ 7 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 引物、探針Table1 Primers and probes

1.8 偽狂犬病毒、日本乙型腦炎病毒PCR檢測、測序及序列分析 偽狂犬病毒 PCR擴增反應(yīng)體系按照25 μL進行：2×Taq Plus PCR Master mix 12.5 μL，上下游引物PRV-gE-F、R（10 μmol/mL）各1 μL，模板DNA 3 μL，用無核酸酶的PCR級無離子水補足至25 μL，混勻，短暫離心后進行PCR擴增。反應(yīng)條件為95℃ 5 min，95℃ 40 s、58℃ 40 s、72℃ 90 s運行35個循環(huán)，72℃ 5 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

日本乙型腦炎病毒P C R擴增反應(yīng)體系按照25 μL進行：PrimeScript 1 step Enzyme Mix 12.5 μL，上下游引物JEV-PrM-F、R（10 μm/ mL）各1 μL，模板DNA 3 μL，用無核酸酶的PCR級無離子水補足至25 μL，混勻，短暫離心后進行PCR擴增。反應(yīng)條件為50℃ 30 min，95℃ 5 min，95℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 1 min運行35個循環(huán)，72℃5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，對目的條帶切膠回收、純化，送昆明碩擎生物科技有限公司進行測序，采用Blast在線比對分析。

1.9 細菌分離、鑒定 將送檢流產(chǎn)胎兒內(nèi)臟器官及大腦組織樣品劃線接種于血清瓊脂平板后，置于普通培養(yǎng)箱及厭氧發(fā)生器，37℃培養(yǎng)24～48 h后，觀察有無菌落生長，有菌落生長則取少許菌落染色鏡檢并觀察形態(tài)。將細菌純化后，接種細菌生化編碼鑒定管進行鑒定。

1.10 病毒分離、鑒定 取5份內(nèi)臟及大腦組織勻漿樣品反復(fù)凍融3次后，4500×g離心10 min，取上清經(jīng)0.2 μm針頭式濾頭過濾除菌，分別接種于25 cm2豬腎原代細胞及BHK-21傳代細胞單層培養(yǎng)瓶各5瓶，同時每種細胞各設(shè)立1瓶正常細胞對照。37℃孵育90 min后，移除吸附液，換為含2%胎牛血清（FBS）的1×MEM，37℃培養(yǎng)7～9 d，每天觀察細胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE），盲傳3～5代，若培養(yǎng)細胞出現(xiàn)規(guī)律性CPE時則反復(fù)凍融3次后，抽提病毒DNA和RNA進行PCR檢測及測序、序列分析。

1.11 昆明小白鼠細菌致病性實驗 將分離純化后的細菌混懸于無菌生理鹽水中，經(jīng)菌數(shù)測定后稀釋為1.5×108個細菌/mL，每只小白鼠腹腔接種0.1 mL，共接種20只作為實驗組，同時設(shè)立5只陰性對照，腹腔接種同等劑量無菌生理鹽水。接種后觀察、記錄發(fā)病及死亡情況，解剖死亡小白鼠觀察病理變化，并無菌采集心血及肝臟回收分離病原菌。

1.12 昆明小白鼠病毒致病性實驗 將分離鑒定的病毒分離株細胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次后，4500×g離心10 min，取上清腦內(nèi)接種40 μL/只，共接種6只作為實驗組，同時設(shè)立2只陰性對照，腦內(nèi)接種同等劑量無菌生理鹽水。接種后觀察、記錄發(fā)病及死亡情況。

2 結(jié)果和討論

2.1 豬繁殖與呼吸綜合征病毒歐洲型及美洲型高致病性毒株、經(jīng)典毒株，豬瘟病毒，豬細小病毒，豬流產(chǎn)衣原體，布氏桿菌，崗地弓形蟲PCR及real-time PCR檢測結(jié)果 5份待檢樣品經(jīng)豬繁殖與呼吸綜合征病毒歐洲型及美洲型高致病性毒株、經(jīng)典毒株，豬瘟病毒，豬流產(chǎn)衣原體，布氏桿菌及崗地弓形蟲real-time PCR及豬細小病毒PCR檢測，結(jié)果全為陰性，見圖2。

2.2 偽狂犬病毒PCR擴增及序列分析結(jié)果 5份待檢樣品經(jīng)偽狂犬病毒PCR擴增后，2份腦及1份組織勻漿樣品PCR擴增出PRV gE基因目的條帶，大小約800 bp（見圖3）。序列分析顯示其核苷酸序列與NCBI GenBank中偽狂犬病毒參考毒株（登錄號：KT936475.1）序列同源性達100%。

2.3 乙型腦炎病毒RT-PCR擴增及序列分析結(jié)果 5份待檢樣品經(jīng)乙型腦炎病毒RT-PCR擴增后，2份腦組織勻漿樣品擴增出JEV prM基因目的條帶，大小約600 bp（圖4）。序列分析顯示其核苷酸序列與NCBI GenBank中的乙型腦炎病毒參考毒株序列（登錄號：AB594829.1）同源性達99%。

2.4 細菌分離、鑒定結(jié)果 置于37℃有氧及厭氧條件下培養(yǎng)的血清瓊脂平板均無菌落生長，細菌分離培養(yǎng)結(jié)果見圖5。

2.5 病毒分離、鑒定結(jié)果 1份內(nèi)臟組織勻漿樣品接種BHK21細胞后，第1代培養(yǎng)至5～8 d，即觀察到細胞單層單個細胞脫落較對照細胞多，但無細胞集聚、皺縮及細胞融合現(xiàn)象（見圖6）。傳代至3～5代后CPE較為明顯和規(guī)律，收集第5代培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次后，4500×g離心5 min，抽提病毒DNA和RNA分別進行偽狂犬病毒及日本乙型腦炎病毒檢測，PCR僅擴增出600 bp大小的JEV prM基因目的條帶，經(jīng)測序及序列分析后確定為日本乙型腦炎病毒，將分離獲得的流行毒株命名為JEV WS-MT-2015-07株。其余4份勻漿樣品接種豬腎原代及BHK-21傳代細胞后盲傳7代，均未觀察到任何細胞病變，細胞培養(yǎng)物經(jīng)過偽狂犬病毒及乙型腦炎病毒PCR檢測也呈陰性，最后作無害化處理。

圖2 PCR及real-time PCR檢測結(jié)果Fig.2 The results of PCR and real-time PCR

圖3 偽狂犬病毒PCR擴增結(jié)果Fig.3 PCR results of PRV

圖4 日本乙型腦炎病毒擴增結(jié)果Fig.4 PCR result of JEV

本研究對送檢的流產(chǎn)豬胎兒大腦、內(nèi)臟及胎盤組織勻漿樣品進行病原學(xué)檢測，檢測出有乙型腦炎及偽狂犬病毒核酸同時存在。運用豬腎原代細胞及BHK-21傳代細胞系進行病毒分離、鑒定，結(jié)果從1份胎兒內(nèi)臟分離到1株乙型腦炎病毒，但通過幾次嘗試分離偽狂犬野毒均告失敗，提示送檢樣品中雖然有PRV核酸的存在，但可能沒有或者僅有極少量具有感染力的活病毒粒子存在。比較有意思的是，分離到乙型腦炎病毒的內(nèi)臟組織勻漿樣品卻沒有被RT-PCR方法擴增出有乙腦病毒核酸的存在，相反prM 基因RT-PCR擴增結(jié)果呈陽性的大腦組織勻漿樣品反而沒有分離到病毒，造成這種現(xiàn)象的原因可能是大腦組織殘留有大量乙型腦炎病毒核酸，但沒有足夠數(shù)量的具有感染力的活病毒粒子，內(nèi)臟組織雖然沒有檢測出病毒核酸的存在，但卻保留有一定數(shù)量的具有感染力的活病毒粒子，因而能感染最敏感的細胞株BHK-21細胞而被成功分離獲得，從另外一個角度也提示了PCR檢測靈敏度可能有時并沒有病毒分離的靈敏度高。

圖5 細菌分離培養(yǎng)結(jié)果Fig.5 The results of bacterial isolation and culture

圖6 乙型腦炎病毒分離株在BHK-21細胞上引起的細胞病變Fig.6 CPE caused by JEV isolate in BHK-21

2.6 昆明小白鼠病毒致病性實驗結(jié)果 JEV分離毒株腦內(nèi)接種成年昆明小白鼠，40 μL/只，共接種6只，均于攻毒后5～7 d內(nèi)死亡，2只陰性對照無異常表現(xiàn)（圖7）。

圖7 昆明小白鼠腦內(nèi)攻毒實驗結(jié)果Fig.7 The results of challenge infection with JEV isolate in Kunming mice

[1] 殷震,劉景華.動物病毒學(xué)[M].2版.北京: 科學(xué)出版社, 1997: 998.

[2] 吳發(fā)興, 鄭輝, 元傳德, 等.豬偽狂犬病病毒PCR檢測方法的建立與應(yīng)用[J].動物醫(yī)學(xué)進展, 2009, 30(5): 5-9.

[3] 李春華, 王英, 蔣鳳英, 等.豬偽狂犬病研究進展[J].動物醫(yī)學(xué)進展, 2008, 29(3): 68-72.

[4] 孔德江, 何曉玲, 易棟, 等.規(guī)模化豬場豬偽狂犬病的篩查與防控[J].中國獸醫(yī)學(xué)報, 2009, 10(5): 75-77.

[5] Solomon T, Ni H, Beasley D W, et a1.Origin and evolution of Japanese encephalitis virus insoutheast Asia[J].J Vitrol, 2003, 77(5): 3091-3098.

[6] Weaver S C,Barrett A D T.Transmission cycles,host range,evolution and emergence of arboviral disease[J].Nat Rev Microbiol, 2004, 2(10): 789-801.

[7] Gbler D J.Resurgent arboviral diseases as a global public health problem[M].Xl Vth.International congress for tropical medicine and malaria.1996, 40.

[8] 王守義.流行性乙型腦炎的診斷與治療[J].華夏醫(yī)藥, 2008, 3(6): 406-408.

[9] 蔡寶祥.動物傳染病診斷學(xué)[M].南京: 江蘇科技出版社, 1992: 93-94.

[10] 鄧永, 徐高原.豬乙型腦炎研究進展[J].養(yǎng)殖與飼料, 2007(6): 43-46.

[11] Xiao S, Chen Y,Wang L, et al.Simultaneous detection and differentiation of highly virulent and classical Chinese-type isolation of PRRSV by real-time RTPCR[J].J Immunol Res, 2014: 809656.

[12] Kleiboeker S B, Schommer S K, Lee S M, et al.Simultaneous detection of North American and European porcine reproductive and respiratory syndrome virus using realtime quantitative reverse transcriptase-PCR[J].J Vet Diagn Invest, 2005, 17(2): 165-170.

[13] Pantchev A, Sting R, Tyczka J, et al.New real-time PCR tests for species-specific detection of Chlamydophila psittaci and Chlamydophila abortus from tissue samples[J].Vet J, 2009, 181(2): 145-150.

[14] Hini? V, Brodard I, Thomann A, et al.Novel identification and differentiation of Brucella melitensis, B.abortus, B.suis, B.ovis, B.canis, and B.neotomae suitable for both conventional and real-time PCR systems[J].J Microbiol Methods, 2008, 75(2): 375-378.

[15] 孔得翔, 王素華, 曲道峰, 等.弓形蟲半巢式PCR檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)學(xué)報, 2009, 29(1): 52-54.

[16] 邵國青, 楊莉莉, 王繼春, 等.弓形蟲ITS-1序列PCR診斷方法的建立[J].中國人獸共患病學(xué)報, 2008, 24(5): 446-450.

DUAL INFECTION OF SWINE PSEUDORABIES VIRUS AND JAPANESE ENCEPHALITIS VIRUS IN PIGS

LIU Ning1, SONG Cong1, GAO Lin2, XIE Jia-rui2, LI Hua-chun2, WANG Jing-lin2, YAO Jun2, WANG Sheng-kui1
(1.College of Animal Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201,China; 2.Yunnan Tropical and Subtropical Animal Virus Diseases Laboratory, Yunnan Animal Science and Veterinary Institute, Kunming 650224, China )

A reproductive disease with clinical manifestations of boar testicle swelling, sow abortion, stillbirth, mummy and weak offspring occurred on a large-scale pig farm from July to August of 2015 in city of Wenshan, Yunnan province.In order to identify the etiological agent(s), CSFV, PRRSV (American/EU type/), PPV, PRV, JEV, Chlamydia psittaci, Toxoplasma gondii, Brucella suis were examined using PCR, real-time PCR and bacterial isolation.As a result, 600 bp fragments of PrM gene of JEV and 810 bp fragments of gE gene of PRV were amplified in RT-PCR or PCR.Sequence analysis showed that the homology of nucleotide sequences of the amplicons was 99% with the reference strains of JEV (Accession:AB594829.1) and 100% with PRV (Accession:KT936475.1) from GenBank.In addition, primary pig kidney cells and BHK21 cells were used for virus isolation.One virus isolate of JEV was obtained from aborted fetal tissue and designated as JEV-2015-WS-YN.Although PRV detection in PCR was positive, isolation of PRV failed after5 blind passages in primary pig kidney cells and BHK21 cells.According to the animal pathogenicity, epidemiology and etiology analysis, this reproductive failure was most likely caused by dual infection of JEV and PRV.After immunization with Japanese encephalitis attenuated live vaccine (SA14-14-2 strain) and pseudorabies gene deletion vaccine (Bartha K61 strain), the reproductive problem was prevented and controlled successfully in pig herds.

Swine psdeudorabies virus; Japanese encephalitis virus; dual infection

S852.659.1

B

1674-6422（2016）02-0068-08

2015-12-01

云南省科技廳重大科技專項（2012ZA017）

劉寧，男，碩士研究生，臨床獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

姚俊，E-mail：810535839@qq.com；王生奎，E-mail：544628182@qq.com