日本血吸蟲(chóng)鈣網(wǎng)質(zhì)蛋白活化宿主巨噬細(xì)胞的初步研究

馬麗貞，李丹丹,2，苑純秀，艾 敏，史曉娜,2，塔 娜，馮新港

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)重點(diǎn)開(kāi)發(fā)實(shí)驗(yàn)室，上海200241；2.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234）

·研究論文·

日本血吸蟲(chóng)鈣網(wǎng)質(zhì)蛋白活化宿主巨噬細(xì)胞的初步研究

馬麗貞1，李丹丹1,2，苑純秀1，艾 敏1，史曉娜1,2，塔 娜1，馮新港1

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)重點(diǎn)開(kāi)發(fā)實(shí)驗(yàn)室，上海200241；2.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234）

為研究日本血吸蟲(chóng)鈣網(wǎng)質(zhì)蛋白（Schistosoma japonicum calreticulin protein，SjCRT）活化小鼠巨噬細(xì)胞的功能，利用桿狀病毒昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá)的真核重組的SjCRT蛋白與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)72 h，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞表面趨化因子受體CCR7的表達(dá)。收集SjCRT蛋白刺激72 h后的巨噬細(xì)胞，抽提RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用RT-PCR檢測(cè)環(huán)加氧酶（cyclooxygenase，COX-2）、磷脂酶A2 （phospholipases A2，PLA2）、TNF-α和IL-1β基因的表達(dá)。SjCRT與巨噬細(xì)胞共孵育72 h后收集上清，ELISA檢測(cè)上清中TNF-α的含量，Griess法測(cè)上清中NO的含量。流式結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，SjCRT蛋白刺激組的巨噬細(xì)胞表面CCR7的表達(dá)量增高且差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，SjCRT蛋白刺激組巨噬細(xì)胞的COX-2、cPLA2、TNF-α和IL-1β表達(dá)量顯著升高。ELISA結(jié)果顯示，SjCRT能夠刺激巨噬細(xì)胞分泌致炎性因子TNF-α。Griess法表明SjCRT能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌NO。本研究結(jié)果表明SjCRT能活化小鼠巨噬細(xì)胞，為闡明其在RA血吸蟲(chóng)疫苗中的功能等提供基礎(chǔ)資料。

日本血吸蟲(chóng)；鈣網(wǎng)質(zhì)蛋白；巨噬細(xì)胞；趨化因子受體；細(xì)胞因子

日本血吸蟲(chóng)病目前仍是嚴(yán)重威脅我國(guó)人畜健康、制約我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的一大疾病[1]。開(kāi)發(fā)高效、安全、實(shí)用的抗血吸蟲(chóng)疫苗是實(shí)現(xiàn)控制血吸蟲(chóng)病的保障[2]。大量研究表明，通過(guò)模擬輻照致弱血吸蟲(chóng)尾蚴或童蟲(chóng)疫苗（radiation attenuated vaccine，RAV）誘導(dǎo)的高保護(hù)性效應(yīng)機(jī)理來(lái)研發(fā)高效而又安全的分子疫苗可能是一條值得探索的新途徑，因此探索RAV的高保護(hù)性效應(yīng)機(jī)制成為學(xué)者們關(guān)注的熱點(diǎn)課題，其中RAV的免疫原性分子與細(xì)胞基礎(chǔ)及機(jī)制等問(wèn)題尤其受到重視[3]。研究表明，RA血吸蟲(chóng)疫苗能夠誘生高保護(hù)性免疫效果，其機(jī)制可能是通過(guò)RA 血吸蟲(chóng)來(lái)源的分子刺激宿主免疫細(xì)胞在肺部形成了以Th1為主的致炎性環(huán)境而實(shí)現(xiàn)的[4]。發(fā)現(xiàn)和鑒定這些保護(hù)性分子并闡明其免疫生物學(xué)功能，對(duì)研發(fā)高效安全的抗血吸蟲(chóng)分子疫苗具有重要的指導(dǎo)意義。

Perona-Wright等[5]鑒定了曼氏血吸蟲(chóng)的鈣網(wǎng)質(zhì)蛋白（calreticulin，CRT）是輻照致弱血吸蟲(chóng)疫苗的一種免疫顯性T細(xì)胞抗原。本實(shí)驗(yàn)室陳雷等[6]發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲(chóng)的鈣網(wǎng)質(zhì)蛋白（Schistosoma japonicum calreticulin protein，SjCRT）含有一個(gè)雜合型的Th1細(xì)胞表位。李瑩等[7]的研究結(jié)果也顯示SjCRT在RA日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)（7日齡）來(lái)源的細(xì)胞中呈現(xiàn)出高表達(dá)，且可以刺激小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞的表型成熟。據(jù)此，我們初步推斷SjCRT可能是RA血吸蟲(chóng)來(lái)源的候選保護(hù)性分子，并且在誘導(dǎo)宿主形成致炎性環(huán)境中發(fā)揮一定的作用。相關(guān)的研究還顯示，巨噬細(xì)胞在介導(dǎo)殺滅肺期童蟲(chóng)和形成肺部炎性反應(yīng)環(huán)境中發(fā)揮重要作用[8]。本研究以小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7為模型，檢測(cè)其在SjCRT刺激下致炎性細(xì)胞因子及趨化因子受體等的分泌表達(dá)情況，為進(jìn)一步鑒定SjCRT的致炎性免疫生物學(xué)特性、闡明其在RA血吸蟲(chóng)疫苗中的功能等提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 蛋白 SjCRT蛋白為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存的桿狀病毒昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá)[7]。

1.2 巨噬細(xì)胞 RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞株為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen公司；胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；PE標(biāo)記的抗CCR7單抗購(gòu)自BD公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；Mouse TNF-α ELISA Ready-SET-Go Kit購(gòu)自eBioscience公司；GoTaq?qPCR Master Mix Kit 購(gòu)自Promega中國(guó)公司；NO檢測(cè)試劑盒購(gòu)自普利萊基因技術(shù)有限公司；引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司引物合成；其他試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)小鼠GAPDH、cPLA2、COX-2、TNF-α、IL-1β的基因序列，利用primer5.0軟件分別設(shè)計(jì)針對(duì)這幾個(gè)基因的特異性引物，由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成，其序列見(jiàn)表1。

表1 擴(kuò)增基因所用引物Table1 Primers used in RT-PCR

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 巨噬細(xì)胞的培養(yǎng) RAW264.7細(xì)胞復(fù)蘇后，用含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清和1%雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，并置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中定期傳代。實(shí)驗(yàn)時(shí)采用處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞。

1.5.2 SjCRT蛋白刺激巨噬細(xì)胞 調(diào)整巨噬細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/mL，加入48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（100 μL/孔），實(shí)驗(yàn)組加入真核表達(dá)蛋白SjCRT，調(diào)節(jié)濃度為 50 μg/mL，同時(shí)設(shè)未刺激組和LPS（50 ng/mL）對(duì)照組，補(bǔ)充培養(yǎng)基至1 mL/孔。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5.3 ELISA檢測(cè)SjCRT刺激巨噬細(xì)胞后TNF-α的分泌情況 按照上述方法處理巨噬細(xì)胞并收集培養(yǎng)細(xì)胞的上清。按照說(shuō)明書(shū)要求稀釋各種溶液，將包被抗體加至96孔酶標(biāo)板中（100 μL/孔），4℃包被過(guò)夜；0.05% PBST洗3遍，用200 μL assay diluent室溫封閉1 h；0.05%PBST洗3遍，將樣品及標(biāo)準(zhǔn)品加到96孔板合適的孔中室溫孵育2 h（100 μL/孔）；0.05% PBST洗3遍，每孔加入100 μL 檢測(cè)抗體室溫孵育1 h；0.05%PBST洗3遍，每孔加入100μL 酶標(biāo)二抗，室溫避光孵育30 min；0.05%PBST洗3遍，加入底物顯色液（100 μL/孔），室溫避光孵育15 min；每孔加入50 μL 終止緩沖液終止顯色后測(cè)OD450值。

1.5.4 RT-PCR檢測(cè)TNF-α和IL-1β轉(zhuǎn)錄水平的變化 繼續(xù)培養(yǎng)巨噬細(xì)胞72 h后，收集細(xì)胞，PBS洗2遍，加入800 μL RNAiso plus將細(xì)胞懸起，室溫放置5 min；4℃、10 800×g離心5 min后，將上層液體轉(zhuǎn)移到新的離心管中；加入200 μL 氯仿大力渦旋2 min左右使其成乳狀，室溫放置5 min。4℃、10 800×g離心15 min，將上層液體轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入500 μL 異丙醇混勻后置-80℃冰箱3 h；4℃、10 800×g離心10 min，棄上清后加入700 μL 75%酒精沖洗RNA；4℃、7500×g離心5 min，棄干凈上清，置空氣中干燥；用20 μL 滅菌蒸餾水溶解并測(cè)濃度。利用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照GoTaq?qPCR Master Mix Kit（Promega，China）說(shuō)明書(shū)使用ABI 7900HT Real-Time PCR System進(jìn)行如下反應(yīng)：95℃預(yù)變性2 min；95℃預(yù)變性15 s和60℃退火1 min，40個(gè)循環(huán)。添加擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線來(lái)確定反應(yīng)的特異性。利用2-△△CT法計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)。

1.5.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞表面趨化因子受體CCR7的表達(dá) 繼續(xù)培養(yǎng)巨噬細(xì)胞72 h后，收集細(xì)胞。4℃、10 800×g離心5 min，沉淀用200 μL RPMI1640懸起，加入2 μL Rat Anti-Mouse CD16/ CD32 抗體，4℃封閉30 min消除抗體非特異性結(jié)合；加入PE標(biāo)記的Rat Anti-Mouse CCR7單抗，4℃避光孵育30 min；4℃、10 800×g離心5 min，用預(yù)冷的PBS洗2遍，加入400 μL PBS懸起轉(zhuǎn)至流式管中，上流式儀檢測(cè)。

1.5.6 Griess法檢測(cè)SjCRT刺激巨噬細(xì)胞后NO的分泌情況 收集上述培養(yǎng)細(xì)胞的上清。按照說(shuō)明書(shū)要求取50 μL標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入96孔板中，每孔加入50 μL Griess R1室溫避光放置5 min；每孔加入50 μL的Griess R2室溫避光放置5 min；540 nm測(cè)定吸光度。制備標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算NO的濃度。

1.6 數(shù)據(jù)處理 所有的數(shù)據(jù)利用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，借助GraphPad Prism 5等軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和繪圖。

2 結(jié)果

2.1 SjCRT誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞高表達(dá)前炎性細(xì)胞因子TNF-α 以ELISA檢測(cè)巨噬細(xì)胞分泌至上清中的TNF-α含量，由圖1可以看出，LPS刺激組和SjCRT刺激組中TNF-α的含量顯著高于對(duì)照組且差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。由此可知，SjCRT的刺激能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌前炎性因子TNF-α。

圖1 SjCRT刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子TNF-αFig.1 Cytokine TNF-α production of macrophagocyte stimulated by recombinant SjCRT

2.2 SjCRT促進(jìn)巨噬細(xì)胞上調(diào)表達(dá)COX-2、cPLA2、TNF-α和IL-1β mRNA 經(jīng)過(guò)SjCRT和LPS處理后的巨噬細(xì)胞COX-2、cPLA2、TNF-α和IL-1β的mRNA均上調(diào)，但上調(diào)的幅度有所不同。與對(duì)照組相比，SjCRT刺激組的COX-2 mRNA表達(dá)量是對(duì)照組的6.25倍，cPLA mRNA表達(dá)量增加了20.61倍，TNF-α mRNA表達(dá)量增加了6.87倍、IL-1β mRNA表達(dá)量上調(diào)了233.51倍（圖2）。

圖2 巨噬細(xì)胞表達(dá)COX-2、cPLA2、TNF-α和IL-1β的RT-PCR分析Fig.2 mRNA expression of the COX-2, cPLA2, TNF-α and IL-1β by RT-PCR

2.3 SjCRT促進(jìn)趨化因子受體CCR7在巨噬細(xì)胞上表達(dá) 由圖3的流式結(jié)果可知，未經(jīng)處理的巨噬細(xì)胞能表達(dá)一定水平的CCR7，但SjCRT和LPS的刺激能使巨噬細(xì)胞表面趨化因子受體CCR7的表達(dá)水平極顯著地增加。與對(duì)照組相比，SjCRT刺激組能促進(jìn)巨噬細(xì)胞表面高表達(dá)趨化因子受體CCR7且差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。SjCRT刺激組與LPS刺激組相比，巨噬細(xì)胞表面CCR7的表達(dá)差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05)。

2.4 SjCRT誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌NO 以Griess檢測(cè)巨噬細(xì)胞分泌到上清中的NO含量，由圖4可以看出，LPS和SjCRT的刺激能夠促使巨噬細(xì)胞分泌NO，且SjCRT刺激組的含量與對(duì)照組差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖3 流式細(xì)胞儀分析CCR7在巨噬細(xì)胞表面的表達(dá)Fig.3 FACS analysis of CCR7 expression on Macrophagocyte

圖4 SjCRT刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NOFig.4 NO production of Macrophagocyte stimulated by recombinant SjCRT

3 討論

近年來(lái)的研究顯示，輻照可引起免疫原性細(xì)胞死亡（immunogenic cell death，ICD）[9]。ICD的顯著特征是通過(guò)釋放或表面表達(dá)所謂的危險(xiǎn)信號(hào)分子如HSP70、HMGB1和CRT等分子來(lái)增強(qiáng)免疫應(yīng)答。本實(shí)驗(yàn)室前期研究也發(fā)現(xiàn)經(jīng)輻照的日本血吸蟲(chóng)尾蚴，體外轉(zhuǎn)化的早期童蟲(chóng)的細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的壞死表型，且SjCRT和SjHSP70能夠表達(dá)在RA尾蚴轉(zhuǎn)化的童蟲(chóng)細(xì)胞表面[10]，提示SjCRT和SjHSP70很可能在RA日本血吸蟲(chóng)疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫中發(fā)揮重要作用。研究揭示，RA血吸蟲(chóng)免疫小鼠后在宿主肺部和引流淋巴結(jié)誘導(dǎo)了偏向于Th1的保護(hù)性應(yīng)答，其中活化的免疫細(xì)胞如樹(shù)突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞等分泌的IFN-γ和TNF-α起了關(guān)鍵作用。但是，SjCRT是否也能夠活化巨噬細(xì)胞從而有利于宿主產(chǎn)生Th1的保護(hù)性應(yīng)答環(huán)境，尚有待研究驗(yàn)證。本研究通過(guò)測(cè)定經(jīng)SjCRT刺激的小鼠巨噬細(xì)胞的趨化因子受體和細(xì)胞因子的表達(dá)情況，初步證明SjCRT可誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生較高水平的TNF-α等致炎性細(xì)胞因子及趨化因子受體CCR7。

研究表明活化的巨噬細(xì)胞能合成和分泌大量細(xì)胞因子。因此，通過(guò)測(cè)定巨噬細(xì)胞分泌表達(dá)相關(guān)細(xì)胞因子的情況可以推斷其功能活性。本研究分別用ELISA法和RT-PCR法在蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平測(cè)定了受刺激的巨噬細(xì)胞TNF-α的含量，發(fā)現(xiàn)SjCRT可刺激巨噬細(xì)胞高表達(dá)前炎性細(xì)胞因子TNF-α。另外，我們也檢測(cè)到IL-1β mRNA在受刺激的巨噬細(xì)胞上呈現(xiàn)高表達(dá)。相關(guān)的研究顯示TNF-α和IL-1β是重要的誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子[11]，在炎癥發(fā)生早期，作為重要的早期炎癥因子，參與了固有免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。TNF-α具有刺激單核/巨噬細(xì)胞等合成、分泌細(xì)胞因子（IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α等），導(dǎo)致炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的殺傷作用。IL-1β是巨噬細(xì)胞激活 T 細(xì)胞的重要介質(zhì)，有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的作用。SjCRT能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞高表達(dá)TNF-α和IL-1β mRNA，分泌早期炎癥因子TNF-α，提示巨噬細(xì)胞被活化。至于被SjCRT活化的巨噬細(xì)胞是否在宿主體內(nèi)通過(guò)TNF-α和IL-1β誘導(dǎo)了早期炎癥反應(yīng)并參與了激活T細(xì)胞等免疫反應(yīng)，尚有待我們進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)功能的活化還可以通過(guò)測(cè)定與前列腺素類(lèi)炎癥介質(zhì)合成相關(guān)的誘導(dǎo)酶COX-2和胞漿性磷脂酶A2（cPLA2）表達(dá)情況來(lái)反映。通常炎癥的產(chǎn)生機(jī)制是機(jī)體在受到脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）等刺激后產(chǎn)生炎癥性細(xì)胞因子，刺激和活化PLA2，引發(fā)磷脂的水解并產(chǎn)生花生四烯酸，在COX的作用下進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)榍傲邢偎仡?lèi)炎癥介質(zhì)，進(jìn)而機(jī)體發(fā)生炎癥癥狀[12]。COX是前列腺素合成的限速酶，有COX-1和COX-2兩種結(jié)構(gòu)。COX-1是組成酶，在大部分組織中穩(wěn)定表達(dá)，參與體內(nèi)的正常代謝；COX-2是誘導(dǎo)酶，在正常組織中不表達(dá)，只有在被細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等刺激后才大量表達(dá)，從而導(dǎo)致前列腺素含量的增加，引起炎癥、疼痛等癥狀[13]。根據(jù)生物活性的不同，可將PLA2分為3類(lèi)：分泌性磷脂酶A2（sPLA2）、胞漿性磷脂酶A2（cPLA2）和Ca2+非依賴性磷脂酶A2 （iPLA2），但只有cPLA2對(duì)花生四烯酸的產(chǎn)生有調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)受SjCRT刺激的巨噬細(xì)胞具有上調(diào)cPLA2和COX-2基因表達(dá)的趨勢(shì)，提示巨噬細(xì)胞具有較強(qiáng)的炎癥反應(yīng)功能。

活化的巨噬細(xì)胞不僅分泌細(xì)胞因子，也能合成NO，通過(guò)測(cè)定巨噬細(xì)胞NO的含量變化可以反映其功能活化的狀態(tài)。另外，有研究顯示由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO在殺滅肺期血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)時(shí)起重要作用[14,15]。本研究結(jié)果顯示受SjCRT刺激的巨噬細(xì)胞分泌NO的能力顯著增強(qiáng)，提示巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)功能被活化。至于RA日本血吸蟲(chóng)來(lái)源的SjCRT在體內(nèi)是否也能通過(guò)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO來(lái)消除肺部的血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)，仍有待進(jìn)一步的鑒定。

募集免疫細(xì)胞至淋巴結(jié)器官對(duì)于誘導(dǎo)宿主保護(hù)性免疫反應(yīng)及免疫耐受的調(diào)節(jié)等至關(guān)重要，這一過(guò)程是表達(dá)在免疫細(xì)胞表面的CCR7受體以及表達(dá)于淋巴結(jié)細(xì)胞上的趨化因子配體CCL21 等介導(dǎo)的[16]。有關(guān)的研究表明在致炎性的M1巨噬細(xì)胞和成熟的樹(shù)突細(xì)胞表面CCR7呈現(xiàn)高表達(dá)，有利于這些細(xì)胞被募集到免疫效應(yīng)器官如肺部和引流淋巴結(jié)，進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)胞毒效應(yīng)或活化其他免疫細(xì)胞。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)SjCRT刺激后巨噬細(xì)胞上調(diào)表達(dá)CCR7，提示SjCRT刺激后的巨噬細(xì)胞可能具有致炎性的M1巨噬細(xì)胞的功能。

本研究結(jié)果表明SjCRT具有促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生致炎癥反應(yīng)的功能，為進(jìn)一步闡明SjCRT在RA血吸蟲(chóng)疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫中所發(fā)揮的功能及其機(jī)制提供了有價(jià)值的資料。

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PRELIMINARY STUDY ON EFFECT OF SCHISTOSOMA JAPONICUM CALRETICULIN PROTEIN ON ACTIVATION OF MACROPHAGOCYTES

MA Li-zhen1, LI Dan-dan1,2, YUAN Chun-Xiu1, AI Min1, SHI Xiao-na1,2, TA Na1, FENG Xin-gang1
(1.Key Laboratory of Animal Parasitology of Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2.College of Life and Environment Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China)

The objective of the present study was to investigate into the functions that Schistosoma japonicum calreticulin protein (SjCRT) activated mouse macrophagocytes.Insect cells Sf9 were used to express SjCRT.Macrophagocytes were stimulated with SjCRT for 72 h.The expression levels of macrophagocyte surface chemokine receptor CCR7 were assayed with fl ow cytometry.The expression levels of COX-2, cPLA2, TNF-α and IL-1β mRNAs were assayed in RT-PCR.The ELISA was used to assay the concentration of TNF-α and Griess to assay the concentration of NO in the surpernatant samples.The fl ow cytometry results show that SjCRT signifi cantly promoted up-regulation of the CCR7 expression (P＜0.05) in macrophagocytes.RT-PCR results indicated that SjCRT upregulated mRNA levels of COX-2, cPLA2, TNF-α and IL-1β.According to the results of ELISA and Griess, SjCRT signifi cantly stimulated macrophagocytes to secret NO.In brief, SjCRT activated mouse macrophagocytes that might be involved in the response to schistosomiasis vaccination.

Schistosoma japonicum; calreticulin protein; macrophagocyte; chemochines recepters; cytokine

S852.735

A

1674-6422（2016）02-0047-06

2016-12-18

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金

馬麗貞，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

馮新港，E-mail：xingangf62@yahoo.com.cn