副流感病毒5型的分子生物學(xué)研究進(jìn)展

高菽蔓，靳紅亮,2，馬 嫄,3，扈榮良

（1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，長春130122；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春130118；3.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，長春130021）

·綜述·

副流感病毒5型的分子生物學(xué)研究進(jìn)展

高菽蔓1，靳紅亮1,2，馬 嫄1,3，扈榮良1

（1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，長春130122；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春130118；3.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，長春130021）

副流感病毒5型（Parainfl uenza virus 5，PIV5）為一類不分節(jié)段單股負(fù)鏈RNA病毒，可引起多種動物呼吸道感染，尤其可致犬病發(fā)“犬窩咳”。本文圍繞PIV5病毒特征、基因組特征、編碼蛋白、病毒的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制以及PIV5相關(guān)疫苗的研究做一綜述，旨在為PIV5疾病監(jiān)測和PIV5相關(guān)疫苗研究提供科學(xué)依據(jù)。

副流感病毒5型（PIV5）；RNA病毒；分子生物學(xué)特征

副流感病毒5型（Parainfluenza virus 5，PIV5）為單股負(fù)鏈不分節(jié)段RNA病毒，屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae），最初因猴病毒5型（Simian virus 5，SV5）而著稱[1]。PIV5與SV5、同屬的猴病毒41（Simian virus 41，SV41）和人副流感病毒II型（human paramyxovirus type 2，hPIV2）等同源性較高[2]。PIV5是犬病原體之一，通過呼吸道途徑可引起急性自我限制性支氣管炎，甚至繼發(fā)肺炎和機(jī)會菌等感染，引發(fā)“犬窩咳”[3]，故獸醫(yī)領(lǐng)域通常稱其為犬副流感病毒（Canine parainfluenza virus，CPIV）[4]。幼犬最易感該病毒，發(fā)病急，傳播快，病毒呈世界性分布。此外，貓、倉鼠、豚鼠、豬、人等均有感染報道，但多不發(fā)病，呈隱性感染[5]。

1 病毒特性

PIV5屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae），副黏病毒亞科（Paramyxovirinae），腮腺炎病毒屬（Rubulavirus），病毒粒子直徑為150～200 nm，通常呈圓形[6]。PIV5可以感染包括人類細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞，且在大多數(shù)細(xì)胞中均可獲得高滴度的病毒，其中在非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero細(xì)胞）培養(yǎng)滴度高于1010PFU / mL[7]，為該病毒的疫苗生產(chǎn)創(chuàng)造了有利條件[8]。PIV5生命周期中不存在DNA階段，只在感染細(xì)胞的胞漿中增殖，且該種病毒幾乎不產(chǎn)生細(xì)胞病變[8]，可通過基因表達(dá)引起廣泛的非炎性、非致病性的免疫反應(yīng)[9,10]。PIV5感染的細(xì)胞在4℃具有紅細(xì)胞吸附作用，常用的紅細(xì)胞如豚鼠的紅細(xì)胞；該病毒可以凝集豚鼠、雞、猴等的紅細(xì)胞，在4℃下對雞紅細(xì)胞的血凝效價最高[6]。

2 PIV5的基因組特征

PIV5基因組為單股負(fù)鏈不分節(jié)段的RNA，長15 246 bp，在副黏病毒科病毒中最小，遵循“六堿基原則”，其結(jié)構(gòu)式為3'-NP-V/P-M-F-(SH)-HN-L-5'，其中兩側(cè)為3'端非編碼區(qū)（即前導(dǎo)序列，leader sequence）和5'端非編碼區(qū)（即尾隨序列，trailer sequence），病毒每個基因都具有轉(zhuǎn)錄起始信號（gene start，GS）和轉(zhuǎn)錄終止信號（gene end，GE）序列，各基因之間均含有一段長短不一的短間隔區(qū)（intergenic region，IGR），但不構(gòu)成mRNA成分，使各基因互不重疊，分別以單獨(dú)的mRNA進(jìn)行表達(dá)[11]，這些保守序列參與mRNA的起始和終止，是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控信號[12]。各基因編碼產(chǎn)生蛋白分別為核衣殼蛋白（neucleocapsid protein，NP）、磷酸化蛋白（phosphoprotein，P）、V蛋白（V protein，V）、膜基質(zhì)蛋白（matrix protein，M）、小疏水性蛋白（small hydrophobic protein，SH）、血凝素-神經(jīng)氨酸酶（hemagglutininneuraminidase，HN）、聚合酶蛋白（large polymerase protein，L）（見圖1）。

圖1 PIV5的基因組結(jié)構(gòu)[13]Fig.1 Genetic maps of PIV5

3 PIV5基因編碼蛋白

3.1 核衣殼相關(guān)蛋白 NP、P、L三種蛋白和基因組RNA均為PIV5病毒粒子的重要組成部分，為核衣殼的裝配和指導(dǎo)病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制所必需，相互結(jié)合可形成核糖核蛋白體（ribonucleoprotein complex，RNPs）[14]。

3.1.1 NP蛋白 NP蛋白又稱N蛋白，含有510個氨基酸，NP蛋白單體在形成核衣殼之前，以可溶性復(fù)合物的形式與P相結(jié)合。NP蛋白氨基端（N端）占NP蛋白的75%，高度保守，與上述可溶性復(fù)合物的形成以及核衣殼的組裝均有關(guān)；羧基端（C端）占NP蛋白的25%，高度可變，含有大量磷酸化位點(diǎn)，并非為核衣殼的組裝必需，但對病毒復(fù)制非常重要[15,16]。有報道稱，NP蛋白C端可能能夠結(jié)合P蛋白或P/L蛋白復(fù)合物[14]。NP蛋白與基因組和反基因組RNA相互結(jié)合包裝成高度穩(wěn)定且具有RNA酶抑制作用的螺旋狀核衣殼，即形成NP蛋白-RNA復(fù)合物，這不僅能夠促使RNA復(fù)制過程鏈的延伸，而且有可能能夠避免3'端未發(fā)生多聚腺苷酸化、5'端未發(fā)生加帽的基因組/反基因組發(fā)生降解，或者避免被胞漿RIG-I（helicases retinoic acid-inducible gene 1）和MDA5（melanoma differentiation-associated protein 5）所識別，這兩個因子可識別三磷酸化RNA、雙鏈RNA，并且能夠激活I(lǐng)RF3和NF-?B，進(jìn)而產(chǎn)生IFN-I和促炎因子[17-19]。

3.1.2 P蛋白 P蛋白并非高度保守。P蛋白包含N端和C端兩個功能性模塊，一個橫跨RNA編輯位點(diǎn)的變異間隔區(qū)將二者隔開[16]。有報道稱，P蛋白為高度磷酸化蛋白，以同源四聚體形式存在[19]。P蛋白的N端模塊可與游離的NP蛋白結(jié)合，可使NP蛋白以可溶性單體形式存在，這是RNA復(fù)制過程中核衣殼的形成所必需的[20,21]。P蛋白的C端模塊含有同寡聚化結(jié)構(gòu)域（homo-oligomerization domain）和聚合酶輔助因子結(jié)構(gòu)域（the polymerase co-factor domain），二者是P蛋白中唯一為轉(zhuǎn)錄所必需的區(qū)域。另外，P蛋白與核衣殼的結(jié)合離不開其C端模塊的介導(dǎo)作用，它還可與L蛋白結(jié)合，介導(dǎo)L蛋白與核衣殼的結(jié)合[22,23]。

3.1.3 L蛋白 L蛋白為多功能大蛋白，含有2256個氨基酸，分子量最大，但在病毒中表達(dá)量最低，與核苷酸的聚合作用、mRNA的加帽以及甲基化等均有關(guān)[24]。L蛋白的N端約占L蛋白的一半，其氨基酸高度保守，被認(rèn)為是聚合酶結(jié)構(gòu)域[25,21]。L蛋白可與P蛋白結(jié)合形成具有RNA聚合酶作用的復(fù)合物[22,23]。

3.2 囊膜蛋白

3.2.1 非糖基化囊膜蛋白-M蛋白 M蛋白為高度保守的非糖基化蛋白，含有378個氨基酸，在病毒蛋白中含量最高，位于病毒囊膜的內(nèi)表面。在被感染細(xì)胞中，M蛋白可與細(xì)胞膜內(nèi)表面接觸，在病毒裝配、出芽和釋放中起關(guān)鍵作用[26,27]，在指導(dǎo)病毒成分轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜過程中也有一定作用[27,28]。M蛋白與N、HN或F蛋白的共表達(dá)對PIV5病毒樣粒子的形成和釋放有一定作用[29,30]。有研究表明，PIV5的M蛋白含有一個在病毒出芽后期可介導(dǎo)宿主泛素-蛋白酶體通路相互作用的結(jié)構(gòu)域[26]。

3.2.2 囊膜糖蛋白

3.2.2.1 F蛋白 F蛋白含有552個氨基酸，是病毒附著宿主細(xì)胞后，病毒核衣殼釋放到胞漿前與宿主細(xì)胞表面脂蛋白膜融合的主要因子。F蛋白是典型的I型跨膜糖蛋白，N端有游離的疏水信號肽，近C端錨定在膜上。F蛋白先以無活性前體F0的形式存在，在宿主細(xì)胞內(nèi)肽酶的作用下裂解產(chǎn)生兩個亞基F1和F2，其中N端20%為F2亞基，其余分子為錨定在膜上的F1亞基，二者以二硫鍵連接[31,32]。F1亞基氨基酸末端為疏水性結(jié)構(gòu)域，具有嵌入細(xì)胞膜的融合作用。F0的裂解是病毒感染的先決條件，與病毒組織嗜性和致病力有關(guān)[33,34]，其裂解位點(diǎn)含有弗林蛋白酶裂解基序（furin cleavage motif），并且病毒的體外復(fù)制不需要額外添加蛋白酶[35]。HN蛋白與F蛋白特異性相互結(jié)合是病毒-細(xì)胞和細(xì)胞-細(xì)胞融合的必要條件。研究發(fā)現(xiàn)，PIV5的F蛋白上含有一個富含疏水殘基的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域（immunoglobulin-like （Ig-like）domain），該結(jié)構(gòu)域可能能夠介導(dǎo)F-HN蛋白相互作用[36]。

3.2.2.2 HN蛋白 HN蛋白含有566個氨基酸，HN蛋白單體通過二硫鍵聚合而成的同源四聚體具有血凝素（hemagglutinin activity，HA）和神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase activity，NA）雙重生物學(xué)活性。其中HA活性的存在使HN蛋白能夠與宿主細(xì)胞外的神經(jīng)氨酸酶（又稱唾液酸）受體以高親和力結(jié)合，受胞外鹵離子濃度和pH的正作用，故PIV5具有凝集紅細(xì)胞的能力。NA活性的存在使HN蛋白能夠催化神經(jīng)氨酸酶水解，受胞外鹵離子濃度和pH的負(fù)作用[37]。HN蛋白是II型寡聚跨膜糖蛋白，含有一個短胞內(nèi)域和一個大胞外域，胞外域含有長螺旋形頸部結(jié)構(gòu)和大球形的頭部結(jié)構(gòu)，其中頸部易被胰蛋白酶裂解，頭部結(jié)構(gòu)具有HA和NA生物學(xué)活性，為主要的抗原位點(diǎn)[38]。研究發(fā)現(xiàn)，HN蛋白與神經(jīng)氨酸酶受體結(jié)合會引起HN蛋白構(gòu)象改變，使空間約束得以釋放，從而有助于HN蛋白頸部殘基與F蛋白相結(jié)合[38]。

3.2.3 SH蛋白 SH蛋白含44個氨基酸，為跨膜蛋白，C端位于膜外側(cè)。并非所有PIV5都有SH蛋白，某些犬源和豬源的PIV5毒株因SH基因發(fā)生變異而無法編碼SH基因，也就不能產(chǎn)生SH蛋白，因此該蛋白對于病毒感染犬和豬是非必需的，犬和豬有可能不是PIV5的自然宿主[39,40]。有研究表明，SV5（含SH基因）缺失SH基因后的重組病毒（rSV5△SH）復(fù)制水平未受影響，但其細(xì)胞病變程度有所增加，并且病毒在動物體內(nèi)的致病力減弱，這與SH蛋白能夠抑制TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)[9,10]。

3.3 附屬蛋白-V蛋白 V蛋白為核衣殼的結(jié)構(gòu)成分之一，含有313個氨基酸，是PIV5 P基因發(fā)生RNA編輯導(dǎo)致框移而產(chǎn)生的蛋白，該蛋白并非病毒復(fù)制所必需的，故稱之為附屬蛋白（accessory protein），V蛋白也是PIV5基因組中唯一的附屬蛋白。V蛋白的C端含有與P蛋白融合的特異性區(qū)域，該區(qū)域含有7個高度保守半胱氨酸殘基，且每個蛋白分子都與兩個鋅原子結(jié)合。研究表明，V蛋白可能不與RIG-I結(jié)合，而是與MDA-5結(jié)合，從而抑制干擾素的產(chǎn)生。有研究者對PIV5介導(dǎo)的STAT1的降解進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)V蛋白能夠與泛素連接酶結(jié)合，并劫持該復(fù)合物使之靶向于STAT1，從而使之發(fā)生泛素化和蛋白酶體依賴的降解[17,41]。另外，V蛋白特異性結(jié)構(gòu)域必須按一定規(guī)則排列才能發(fā)揮抑制IFN產(chǎn)生及其相關(guān)信號通路的功能[42]。在病毒感染期，V蛋白還可延遲細(xì)胞凋亡，下調(diào)病毒轉(zhuǎn)錄和RNA復(fù)制水平[43]，并延長細(xì)胞周期[44]。研究發(fā)現(xiàn)，V蛋白抑制RNA復(fù)制水平的兩個關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域分別在N端和C端，且二者影響病毒RNA的機(jī)制不同，其中N端結(jié)構(gòu)域的L16、I17殘基為關(guān)鍵位點(diǎn)，可促進(jìn)病毒RNA轉(zhuǎn)錄，而C端結(jié)構(gòu)域可抑制病毒RNA轉(zhuǎn)錄[43]。

4 PIV5的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制

PIV5首先吸附到細(xì)胞相應(yīng)受體上，在中性pH環(huán)境下，通過病毒囊膜和細(xì)胞外膜融合實現(xiàn)病毒侵入，將病毒螺旋化的核衣殼釋放到胞漿中。病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制均在胞漿中進(jìn)行。病毒各基因都有其獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，即GS-IRG-GE，轉(zhuǎn)錄酶在該轉(zhuǎn)錄信號的指導(dǎo)下，以基因組（genome）RNA為模板，從基因組3'端到5'端依次進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生3'端多聚腺苷酸化、5'端加帽且甲基化的不重疊的多個單順反子mRNA，且轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的量從3'端到5'遞減。最終核糖體將病毒的各基因的mRNA翻譯成病毒蛋白，蛋白翻譯后再進(jìn)一步進(jìn)行加工和修飾。另外，也產(chǎn)生了3'端無多聚腺苷酸化、5'端不加帽的前導(dǎo)序列和尾隨序列mRNA轉(zhuǎn)錄本，但不翻譯為蛋白[37]。

RNA復(fù)制過程為病毒RNA聚合酶作用下，以基因組（genome）RNA（-RNA）為模板，合成不含GS/GE序列的反基因組（antigenome），反基因組（+RNA）作為復(fù)制中間體，合成子代病毒的負(fù)鏈基因組RNA。反基因組同基因組一樣，均為3'端無多聚腺苷酸化和5'端不加帽。病毒多聚酶（轉(zhuǎn)錄酶或復(fù)制酶）識別的真正模板是NP蛋白-RNA復(fù)合物。基因組復(fù)制后，又發(fā)生下一輪轉(zhuǎn)錄（次級轉(zhuǎn)錄）、翻譯和復(fù)制[6]。

5 PIV5相關(guān)疫苗研究

治療“犬窩咳”的活疫苗如四聯(lián)苗、五聯(lián)苗、六聯(lián)苗等已在市場上得到廣泛應(yīng)用[4]。隨著反向遺傳學(xué)研究的不斷深入，PIV5因其感染方式直接、宿主范圍廣泛等諸多優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注，先后成為流感病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒等重要病原的重組疫苗載體，具有廣泛的應(yīng)用價值和經(jīng)濟(jì)價值[8,45]。PIV5載體疫苗研究中，免疫前PIV5抗體水平是否影響PIV5重組疫苗的免疫效果問題不容忽視。有研究發(fā)現(xiàn)，已免疫過PIV5的犬再免疫表達(dá)甲型流感病毒H3蛋白的重組PIV5疫苗（rPIV5-H3），rPIV5-H3仍有免疫源性，此外，他們還對人群中PIV5抗體水平進(jìn)行了監(jiān)測，其中PIV5中和抗體陽性率為29%，且人的PIV5中和抗體水平低于免疫犬[4]。這項研究說明人體內(nèi)的PIV5中和抗體不影響重組PIV5疫苗的免疫效果，但我們?nèi)孕枰嗟难芯繑?shù)據(jù)來支撐這一說法。

6 結(jié)語

目前，除引發(fā)“犬窩咳”外，PIV5是否能引起人和其他動物疾病的問題一直存在爭議。2015年Liu 等[45]曾報道，在吉林省白城牛場死于呼吸困難和間質(zhì)性肺炎的犢牛肺組織中分離到一株與豬源KUN-11和SER株高度同源的PIV5（PIV5-BC14株），由于在健康牛中未檢測到PIV5，他們據(jù)此推測犢牛的疾病很有可能是由PIV5-BC14株引起的。一直以來，PIV5因其非常容易污染細(xì)胞培養(yǎng)基，而導(dǎo)致了關(guān)于PIV5的分離和相關(guān)疾病的報道屢遭質(zhì)疑，但這仍是一篇發(fā)人深省的報道，雖然尚無PIV5能夠引起其他疾病的確切報道，但其對人類和動物是否存在潛在威脅，以及PIV5載體疫苗是否存在潛在的安全隱患，確實有待長期監(jiān)測。

PIV5載體作為基因工程疫苗研究最具應(yīng)用前景的載體之一，目前，雖然已有眾多學(xué)者進(jìn)行了PIV5載體疫苗的相關(guān)研究，但其從試驗研究到成熟穩(wěn)定的臨床應(yīng)用，尚需對PIV5分子生物學(xué)、病毒嗜性、受體利用、免疫途徑以及安全性評價等諸多方面展開更加深入而廣泛的研究。

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ADVANCES IN THE STUDY OF MOLECULAR BIOLOGY OF PARAINFLUENZA VIRUS 5

GAO Shu-man1, JIN Hong-liang1,2, MA Yuan1,3, HU Rong-liang1
(1.Military Veterinary Institute, Academy of Military Medical Sciences, Changchun 130122, China; 2.College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 3.School of Public Health, Jilin University, Changchun 130021, China)

Parainfluenza virus 5 (PIV5) is nonsegmented negative-strand RNA virus which can infect various mammals including humans, especially causing kennel cough.This paper comprehensively introduces biological characteristics of PIV5 concerning their feature, genomic characteristics, proteins, transcription and replication, and research of vaccines based on PIV5, and aims at providing scientifi c basis about the study on the surveillance of PIV5-related diseases and PIV5 and PIV5-vectored vaccine.

Parainfl uenza virus 5 (PIV5); RNA virus; biological characteristics

S852.659.5

A

1674-6422（2016）02-0080-07

2015-12-08

國家高技術(shù)研究發(fā)展（863）計劃（2011AA10A212）

高菽蔓，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

扈榮良，E-mail：ronglianghu@hotmail.com