日本血吸蟲(chóng)不同發(fā)育階段蟲(chóng)體超微結(jié)構(gòu)觀(guān)察

鄧玲玲，張向前，馮新港，賈英英，許靜秀，史永紅，李 浩，陸 珂，林矯矯,4，苑純秀

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春130118； 3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030；4.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州225009）

·研究論文·

日本血吸蟲(chóng)不同發(fā)育階段蟲(chóng)體超微結(jié)構(gòu)觀(guān)察

鄧玲玲1，張向前2，馮新港1，賈英英2，許靜秀3，史永紅1，李 浩1，陸 珂1，林矯矯1,4，苑純秀1

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春130118； 3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030；4.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州225009）

為探尋不同發(fā)育階段及不同性別間血吸蟲(chóng)生物學(xué)反應(yīng)差異性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，本研究對(duì)不同發(fā)育階段及雌、雄蟲(chóng)體間的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較觀(guān)察。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，血吸蟲(chóng)的體被和腸上皮兩個(gè)直接跟外界接觸的界面均在童蟲(chóng)階段薄而致密，而成蟲(chóng)階段這兩個(gè)界面都更厚而稀疏。雌蟲(chóng)體被比同一發(fā)育階段的雄蟲(chóng)體被致密，基膜比雄蟲(chóng)厚。了解血吸蟲(chóng)不同發(fā)育階段及雌雄蟲(chóng)體間超微結(jié)構(gòu)的差異性，有助于解釋其生物學(xué)反應(yīng)的差異性。

日本血吸蟲(chóng)；發(fā)育；超微結(jié)構(gòu)

血吸蟲(chóng)是雌雄異體吸蟲(chóng)，在尾蚴鉆入宿主皮膚后，要經(jīng)歷由童蟲(chóng)逐漸發(fā)育為成蟲(chóng)的過(guò)程。不同發(fā)育階段的蟲(chóng)體或同一發(fā)育階段的雌、雄蟲(chóng)體，對(duì)于體外培養(yǎng)的適應(yīng)性[1,2]、藥物的反應(yīng)[3,4]、抗原性[5-7]等方面都存在差異。功能是以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的，不同發(fā)育階段或不同性別蟲(chóng)體在結(jié)構(gòu)上的差異性是不是造成生物學(xué)反應(yīng)差異性的原因之一，帶著這個(gè)問(wèn)題，本文對(duì)不同發(fā)育階段間及雌、雄蟲(chóng)體間超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較觀(guān)察。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和日本血吸蟲(chóng)尾蚴 BALB/c小鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；日本血吸蟲(chóng)安徽株尾蚴由上海獸醫(yī)研究所血吸蟲(chóng)病研究室的釘螺室提供。

1.2 不同發(fā)育階段日本血吸蟲(chóng)日本血吸蟲(chóng)（安徽株）尾蚴感染BALB/c小鼠，40～1000條尾蚴/只小鼠，腹部貼片。分別在感染后d7、14、18、23、35、42剖殺，用含有抗凝劑的滅菌PBS溶液從肝門(mén)靜脈灌注沖出蟲(chóng)體，PBS洗滌蟲(chóng)體3次，去除粘附的血細(xì)胞等其它雜質(zhì)。在解剖鏡下將14、18 d蟲(chóng)體雌雄分開(kāi)，肉眼手工將23、35、42 d的蟲(chóng)體進(jìn)行雌雄分開(kāi)。將收集的蟲(chóng)體浸泡于2.5%的戊二醛（Sigma）溶液中進(jìn)行前固定，4℃保存。

1.3 不同發(fā)育階段日本血吸蟲(chóng)透射電鏡樣品 取出前固定樣品，用0.1 mol/L PBS buffer（pH 7.2）沖洗3次，每次15 min。后固定：加入1%鋨酸處理到樣品變黑。再用0.1 mol/L PBS buffer（pH 7.2）沖洗3次，每次15 min。脫水：室溫下，丙酮30%→50% →70%→80%→90%，每級(jí)作用30 min，純丙酮再作用3次，每次作用30 min。滲透：無(wú)水丙酮/包埋劑＝5:1，作用12 h；無(wú)水丙酮/包埋劑＝3:1，作用12 h；無(wú)水丙酮/包埋劑＝1:1，作用12 h；無(wú)水丙酮/包埋劑＝1:3，作用12 h；無(wú)水丙酮/包埋劑＝1:5，作用12 h；純包埋劑45℃作用12 h。包埋：用牙簽將滲透好的樣品挑到包埋板中，45℃聚合12 h，60℃聚合36～48 h。超薄切片：在超薄切片機(jī)上進(jìn)行超薄切片，因7 d蟲(chóng)體比較小，無(wú)法定位，隨機(jī)切片外，其他階段的雌雄蟲(chóng)體均分別選擇腹吸盤(pán)下及蟲(chóng)體后端1/3處進(jìn)行切片。正染色：超薄切片先醋酸鈾染色30 min，去二氧化碳的雙蒸水清洗3次，再用檸檬酸鉛染色10 min，雙蒸水清洗3次，超薄切片干燥后，進(jìn)行透射電鏡觀(guān)察。透射電鏡型號(hào)為：FEI T12。

2 結(jié)果

2.1 不同發(fā)育階段血吸蟲(chóng)體壁超微結(jié)構(gòu)的比較

2.1.1 不同發(fā)育階段蟲(chóng)體背部體壁的超微結(jié)構(gòu) 圖1示不同發(fā)育階段血吸蟲(chóng)的背部體壁的超微結(jié)構(gòu)。體壁由體被、基膜及體被下層構(gòu)成[8]。隨著蟲(chóng)體的生長(zhǎng)發(fā)育，體壁的超微結(jié)構(gòu)也隨之變化。體壁最外層是體被（ 示體被），體被是細(xì)胞連體，由體被下層的體被細(xì)胞通過(guò)胞質(zhì)小管將其內(nèi)含物送到蟲(chóng)體表層形成。14 d（1B）、18 d（1D）、23 d（1F）至42 d （1H）雄蟲(chóng)間體被逐漸增厚，42 d雄蟲(chóng)的體被厚度約是18 d雄蟲(chóng)體被的2倍。體被的組成和結(jié)構(gòu)也在變化，由體被下層運(yùn)輸?shù)襟w被的分泌小體逐漸增多，如形態(tài)比較規(guī)則的環(huán)形體（ring body，Rb）。電鏡下14 d雄蟲(chóng)的體被下層能見(jiàn)到少量的環(huán)形體，體被上少量分布。至18 d雄蟲(chóng)的體被下層環(huán)形體增多，并可見(jiàn)體被細(xì)胞（tegumental cell，Tc）分泌的環(huán)形體向體被運(yùn)輸（1D），體被上的環(huán)形體數(shù)量較14 d增多，至23 d及42 d雄蟲(chóng)體被上的環(huán)形體數(shù)量繼續(xù)增多。另外還有一些形態(tài)不規(guī)則的顆粒狀或者多膜囊分泌小體也逐漸增多，使得體被由致密逐漸變得疏松。不同發(fā)育階段雌蟲(chóng)間的體被增厚幅度比相應(yīng)階段雄蟲(chóng)間小。體被下是基膜，由基質(zhì)膜、基底膜和間質(zhì)層構(gòu)成，它完整地包裹著整個(gè)蟲(chóng)體。圖2中所示的膠原纖維樣結(jié)構(gòu)即為基膜。相同發(fā)育階段的雌蟲(chóng)基膜明顯厚于雄蟲(chóng)，18 d（2A）、23 d（2C）至42 d（2E）雌蟲(chóng)基膜逐漸增厚，而相應(yīng)階段的雄蟲(chóng)基膜厚度差別不大?；は乱来畏植纪猸h(huán)肌、內(nèi)縱肌及體被細(xì)胞等，隨著蟲(chóng)體的不斷生長(zhǎng)發(fā)育肌肉層逐漸增厚。同一發(fā)育階段的雄蟲(chóng)一般較雌蟲(chóng)肌肉層厚；雌蟲(chóng)外環(huán)肌肌纖維束間連接比雄蟲(chóng)緊密，雄蟲(chóng)（2B、2D、2F）的外環(huán)肌肌纖維束間連接相對(duì)松散，在電鏡下呈淡染。

圖1 日本血吸蟲(chóng)背部體壁超微結(jié)構(gòu)Fig.1 Ultrastructure of dorsum body wall of Schistosoma japonicum

2.2.2 不同發(fā)育階段蟲(chóng)體間腹面體壁的超微結(jié)構(gòu) 圖3示14 d（3A）、18 d（3B）、23 d（3C）及42 d （3D）雄蟲(chóng)的腹面抱雌溝處體壁。血吸蟲(chóng)的腹面體壁超微結(jié)構(gòu)與背部超微結(jié)構(gòu)有明顯的區(qū)別。腹面抱雌溝內(nèi)長(zhǎng)有體棘，不同部位分布的體棘密度及大小不同，中段體棘密布，前、后段體棘較稀疏。腹面體被厚度比背部體被略薄，結(jié)構(gòu)比背部體被緊密。腹面體被上多見(jiàn)大小和形狀不規(guī)則的顆粒狀或囊泡樣的分泌小體，而在背部體被上較多分布的環(huán)形體在腹面較少見(jiàn)到。被腹面體被下的外環(huán)肌纖維束也存在差異，腹面的明顯比被部的細(xì)小。

圖2 日本血吸蟲(chóng)背部體壁超微結(jié)構(gòu)Fig.2 Ultrastructure of dorsum body wall of Schistosoma japonicum

圖3 不同發(fā)育階段日本血吸蟲(chóng)腹面體壁超微結(jié)構(gòu)Fig.3 Ultrastructure of ventral body wall of Schistosoma japonicum from different developmental stage

2.3 不同發(fā)育階段蟲(chóng)體腸壁超微結(jié)構(gòu) 血吸蟲(chóng)通過(guò)口腔不斷吞噬宿主紅細(xì)胞，紅細(xì)胞在腸道中被蛋白分解酶所消化。圖4顯示不同發(fā)育階段的蟲(chóng)體腸壁的超微結(jié)構(gòu)，蟲(chóng)體腸上皮看似由網(wǎng)狀纖維分支互相交織連接而成，網(wǎng)孔中可見(jiàn)線(xiàn)粒體等細(xì)胞器，網(wǎng)狀纖維向腸腔內(nèi)突出纖維細(xì)絲，網(wǎng)狀纖維接近蟲(chóng)體實(shí)質(zhì)的一側(cè)分散鑲嵌著腸上皮細(xì)胞，腸上皮外由肌層環(huán)繞。隨著蟲(chóng)體的發(fā)育，腸上皮逐漸增厚，但密度減小，網(wǎng)狀纖維的結(jié)構(gòu)逐漸松散，突出入腸腔的纖維絲逐漸加長(zhǎng)加密，纖維絲間隙中充滿(mǎn)消化后的顆粒。由圖5顯示的結(jié)構(gòu)推測(cè)，腸上皮是通過(guò)兩條臨近的突出網(wǎng)狀纖維絲包繞消化物，末端彼此連接成閉合環(huán)狀，將消化物以?xún)?nèi)吞的形式進(jìn)行吸收，網(wǎng)狀纖維組織內(nèi)可見(jiàn)大小不等的含顆粒的內(nèi)吞小泡。

圖4 不同發(fā)育階段日本血吸蟲(chóng)腸上皮超微結(jié)構(gòu)Fig.4 Ultrastructure of intestinal epithelium of Schistosoma japonicum from different developmental stages

3 討論

圖5 日本血吸蟲(chóng)腸上皮超微結(jié)構(gòu)Fig.5 Ultrastracture of intestinal epithelium of Schistosoma japonicum

血吸蟲(chóng)為雌雄異體，整個(gè)蟲(chóng)體呈合抱狀。體被和基膜完整包裹蟲(chóng)體，體被下層的體被細(xì)胞通過(guò)胞質(zhì)小管向體被進(jìn)行物質(zhì)傳遞。蟲(chóng)體侵入終末宿主體內(nèi)后，不斷由宿主血液攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，經(jīng)過(guò)消化吸收轉(zhuǎn)變成自身的組成成分。隨著蟲(chóng)體的發(fā)育，體被的超微結(jié)構(gòu)也隨之變化，體被逐漸增厚但結(jié)構(gòu)越來(lái)越疏松，體被上的分泌小體逐漸增多，這些逐步增加的成分是以宿主物質(zhì)為原料產(chǎn)生的，因此體被結(jié)構(gòu)里逐漸增加了來(lái)源于宿主的成分，這或許是血吸蟲(chóng)免疫逃避或者抗原偽裝的物質(zhì)基礎(chǔ)。童蟲(chóng)階段的體被比成蟲(chóng)階段的明顯致密，在制備透射電鏡樣品時(shí)，固定液不易穿透，因此童蟲(chóng)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)沒(méi)有成蟲(chóng)看起來(lái)清晰。吡喹酮對(duì)血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)具有很強(qiáng)的殺滅效果，對(duì)早期鉆入皮膚的童蟲(chóng)效果差或無(wú)效。童蟲(chóng)階段和成蟲(chóng)階段體被結(jié)構(gòu)的差異性可能是造成這個(gè)結(jié)果的原因之一，童蟲(chóng)階段體被致密，吡喹酮難以透過(guò)，無(wú)法進(jìn)入蟲(chóng)體內(nèi)部，達(dá)不到損傷蟲(chóng)體的效果。而成蟲(chóng)階段體被疏松，吡喹酮易于滲透進(jìn)入蟲(chóng)體內(nèi)部，進(jìn)而殺傷蟲(chóng)體。體外培養(yǎng)中童蟲(chóng)比成蟲(chóng)更容易存活，也可能是由于致密的體被幫助童蟲(chóng)更好的屏障外界，維持自身的滲透壓和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定?；の挥隗w被之下，同一發(fā)育階段的雌蟲(chóng)基膜明顯比雄蟲(chóng)厚，而雌性蟲(chóng)體在體外培養(yǎng)中比雄蟲(chóng)更易存活，可能是因?yàn)榇葡x(chóng)的體被更緊密且基膜更厚，更好的屏障外界，減少自身的抗原物質(zhì)與外界接觸。

血吸蟲(chóng)體被下的肌肉層在背、腹面呈不對(duì)稱(chēng)分布，背部的肌層特別是外環(huán)肌比腹面的明顯粗大，這個(gè)結(jié)構(gòu)決定蟲(chóng)體主要靠背部肌群的收縮和舒張完成前后的匍匐運(yùn)動(dòng)。血吸蟲(chóng)的肌肉中可能包含不隨意肌。新鮮收集的蟲(chóng)體剪斷后進(jìn)行培養(yǎng)，在長(zhǎng)達(dá)2周的時(shí)間里，蟲(chóng)體的每一個(gè)片段都可以進(jìn)行節(jié)律性的顫動(dòng)，這種顫動(dòng)可能來(lái)自于不受自主神經(jīng)控制的肌群。這樣看來(lái)蟲(chóng)體寄生在宿主體內(nèi)，在不進(jìn)行前后移位時(shí)，身體仍會(huì)不自主進(jìn)行節(jié)律性的收縮舒張運(yùn)動(dòng)，幫助蟲(chóng)體消化或者物質(zhì)的交換運(yùn)輸。

血吸蟲(chóng)主要靠在宿主體內(nèi)攝食紅細(xì)胞維持自身的物質(zhì)和能量供應(yīng)。腸壁的超微結(jié)構(gòu)比較顯示，伴隨著蟲(chóng)體的發(fā)育腸上皮逐漸增厚，但是結(jié)構(gòu)逐漸變得疏松。腸管是血吸蟲(chóng)直接與宿主接觸的界面，在對(duì)宿主進(jìn)行藥物治療時(shí)，是與藥物直接接觸的界面。吡喹酮對(duì)童蟲(chóng)的殺傷效果差，除了其體被的致密高，其腸壁的致密度高，藥物難以滲透也是需要考慮的原因。

本研究對(duì)血吸蟲(chóng)不同發(fā)育階段蟲(chóng)體的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較觀(guān)察，有助于從結(jié)構(gòu)上理解不同發(fā)育階段以及雌雄蟲(chóng)間在運(yùn)動(dòng)、體外培養(yǎng)、抗原性以及對(duì)藥物的反應(yīng)性等方面存在的差異性。

[1] 林建銀, 李瑛, 周述龍.日本血吸蟲(chóng)肺期童蟲(chóng)體外培養(yǎng)的初步研究[J].寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志, 1983, 1(3): 164-166.

[2] 周述龍, 華先欣, 李瑛, 等.長(zhǎng)期體外培養(yǎng)日本血吸蟲(chóng)的體被及消化道的透射電鏡觀(guān)察[J].中國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志, 1992, 10(1): 5-7.

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ULTRASTRUCTURAL COMPARISON OF SCHISTOSOMA JAPONICUM AT DIFFERENT DEVELOPMENTAL STAGES AND GENDERS

DENG Ling-ling1, ZHANG Xiang-qian2, FENG Xin-gang1, JIA Ying-ying2, XU Jing-xiu3, SHI Yong-hong1, LI Hao1, LU Ke1, LIN Jiao-jiao1,4, YUAN Chun-xiu1(1.Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2.College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 3.College of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 4.Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

To explore the structural basis that might cause diverse responses to biological treatments, the ultrastructures of worms at different developmental stages and genders of Schistosoma japonicum were compared in the present study.The teguments and intestinal epitheliums, through which worms contacted with the outside world directly, were thinner and more compact in schistosomulums than in adults.The teguments of female worms were more compact than in male worms at the same stage while the basal lamina of female worms were thicker than male worms at the same stage.The differences on ultrastructures may help explain different biological responses at different developmental stages or different genders of Schistosoma japonicum.

Schistosoma japonicum; development stages; ultrastructure

S852.735

A

1674-6422（2016）02-0042-05

2015-12-15

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)（201303037）；國(guó)家自然基金項(xiàng)目（31172315）

鄧玲玲，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)

苑純秀，E-mail：yuanchx@shvri.ac.cn