陽(yáng)性水牛、黃牛IgG篩選日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)噬菌體展示cDNA文庫(kù)

馮金濤，韓 愉，袁 煒，張 欣，許 瑞，李 浩，陸 珂，金亞美，林矯矯，程國(guó)鋒，劉金明

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 國(guó)家防治動(dòng)物血吸蟲(chóng)病專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，上海200241）

·研究論文·

陽(yáng)性水牛、黃牛IgG篩選日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)噬菌體展示cDNA文庫(kù)

馮金濤，韓 愉，袁 煒，張 欣，許 瑞，李 浩，陸 珂，金亞美，林矯矯，程國(guó)鋒，劉金明

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 國(guó)家防治動(dòng)物血吸蟲(chóng)病專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，上海200241）

為尋找有效的家畜日本血吸蟲(chóng)病診斷抗原，從感染日本血吸蟲(chóng)的水牛、黃牛血清中純化IgG，以親和淘洗方法篩選日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)（44日齡）噬菌體展示 cDNA 文庫(kù)。經(jīng)每種動(dòng)物IgG三輪（總計(jì)六輪）篩選后, 隨機(jī)挑取 53 個(gè)陽(yáng)性噬菌體克隆進(jìn)行序列測(cè)定及生物信息學(xué)分析。獲得了9個(gè)EST 序列，其中7個(gè)EST序列與已知基因或表達(dá)序列標(biāo)簽同源，2個(gè) EST 序列與已知基因或表達(dá)序列標(biāo)簽均無(wú)同源性，以噬菌體展示載體的 10B 衣殼蛋白開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）為依據(jù)，對(duì)上述 7個(gè)與 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)資料同源的 EST 進(jìn)行對(duì)碼分析，結(jié)果 7個(gè)EST序列能和噬菌體展示載體閱讀框?qū)Υa，為有效展示序列。其中3個(gè)EST具有較高的重復(fù)度，在51個(gè)有效克隆中，25個(gè)為HSP70 homolog基因，15個(gè)為Keratin9基因有重復(fù)，6個(gè)為Ornithine--oxo-acid transaminase基因。研究結(jié)果顯示，HSP70 homolog基因、Keratin9基因和Ornithine--oxo-acid transaminase基因作為診斷家畜血吸蟲(chóng)病候選抗原基因，值得進(jìn)一步開(kāi)展克隆、表達(dá)和診斷效果評(píng)估方面的研究。

日本血吸蟲(chóng)；水牛；黃牛；篩選；噬菌體展示 cDNA 文庫(kù)

血吸蟲(chóng)病發(fā)生在熱帶和亞熱帶，是世界范圍內(nèi)最重要的寄生蟲(chóng)病，血吸蟲(chóng)病的防控具有重要的社會(huì)經(jīng)濟(jì)意義[1]。血吸蟲(chóng)病在74個(gè)國(guó)家流行，大約1億2千萬(wàn)人為有癥狀性感染，2千萬(wàn)人受到嚴(yán)重影響[2]。盡管在低感染度下血吸蟲(chóng)很少引起死亡，但是它的復(fù)發(fā)特性使血吸蟲(chóng)感染成為終身失調(diào)的慢性病[3]。日本血吸蟲(chóng)病在中國(guó)長(zhǎng)江中下游沿岸5?。ê鲜?、湖北省、江西省、安徽省和江蘇?。┮约八拇ㄊ　⒃颇鲜?省流行。雖然我國(guó)血吸蟲(chóng)病防控已取得顯著成效，但迄今為止仍然是主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。2013年底全國(guó)仍有血吸蟲(chóng)病患者約184 943例，其中急性血吸蟲(chóng)感染病例9例，當(dāng)年死亡1700例[4]。2012年在湖南省、湖北省、江西省、安徽省、江蘇省、四川省、云南省7個(gè)流行省，牛血吸蟲(chóng)病的糞便毛蚴孵化法檢測(cè)陽(yáng)性率為0.58%，推算的理論病牛數(shù)為5284頭[5]。

患病家畜特別是病牛，是我國(guó)血吸蟲(chóng)病的最重要傳染源，因此及時(shí)發(fā)現(xiàn)病畜并給予治療是有效控制傳染源的重要途徑。長(zhǎng)期以來(lái)，家畜血吸蟲(chóng)病的診斷和監(jiān)測(cè)主要采用病原學(xué)診斷技術(shù)—糞便毛蚴孵化法。隨著我國(guó)血吸蟲(chóng)病防控和疫情控制取得巨大成就，我國(guó)家畜血吸蟲(chóng)感染率和感染度越來(lái)越低，傳統(tǒng)的病原學(xué)診斷技術(shù)在發(fā)現(xiàn)病畜和確定治療對(duì)象方面越來(lái)越困難。免疫學(xué)診斷技術(shù)主要采用蟲(chóng)卵可溶性抗原（soluble egg antigen，SEA）檢測(cè)抗體的技術(shù)，包括ELISA、IHA等，但SEA抗原和其他吸蟲(chóng)如片型吸蟲(chóng)感染血清有較高的交叉反應(yīng)[6]。雖然在基因工程診斷抗原研究方面已有不少報(bào)道，但目前還沒(méi)有一種基因工程抗原可以開(kāi)展大規(guī)模的應(yīng)用，繼續(xù)篩選敏感特異的診斷抗原是我國(guó)血吸蟲(chóng)病防治的一大需求。本研究用感染日本血吸蟲(chóng)家畜的IgG篩選日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng) T7 噬菌體展示 cDNA 文庫(kù)，以期發(fā)現(xiàn)能用于后續(xù)研究的家畜日本血吸蟲(chóng)病診斷抗原基因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)（Sj44d）噬菌體展示 cDNA 文庫(kù)由本研究室構(gòu)建、保存，庫(kù)容量為4.98×106pfu，重組率為93.8%，其中95.6%的插入片段大于300 bp[7]。血吸蟲(chóng)尾蚴由本研究室釘螺室提供；水牛、黃牛血吸蟲(chóng)陽(yáng)性血清（糞檢陽(yáng)性）為本研究室用日本血吸蟲(chóng)尾蚴攻擊感染后采集、保存。

1.1.2 主要試劑 Protein G親和層析柱購(gòu)自GE公司；鹽酸胍購(gòu)自華美生物工程公司；BSA（Fraction Ⅴ）購(gòu)自 BBI公司；binding/wash buffer和elution buffer購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司；T7噬菌體載體引物序列由 T7 Select 10-3b Cloning Kit 說(shuō)明書(shū)提供，Invitrogen公司合成，上游引物序列為5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'，下游引物序列為5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'。

1.2 方法

1.2.1 水牛、黃牛日本血吸蟲(chóng)陽(yáng)性血清抗體純化 按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，用Protein G親和層析柱親和層析純化IgG。主要步驟如下：分別取實(shí)驗(yàn)室保存的水牛、黃牛兩種動(dòng)物陽(yáng)性血清各10份，4℃融化過(guò)夜后，每份取100 μL合并，用日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵可溶性抗原（SEA）進(jìn)行常規(guī)ELISA驗(yàn)證血清為陽(yáng)性后，加入1倍體積結(jié)合緩沖液，上下顛倒10次混勻，4℃、12 000×g離心6 min，小心吸取上清，用0.45 μm濾器過(guò)濾。將Protein G柱（1 mL）在室溫平衡5 min，用5倍柱體積的滅菌二級(jí)水洗柱后，加入5倍柱體積結(jié)合緩沖液平衡。待結(jié)合緩沖液流盡后，加入上述過(guò)濾血清。待血清樣品流盡，分別加入10倍柱體積結(jié)合緩沖液和0.5 mL 洗脫緩沖液洗滌，流盡后再加入5倍柱體積洗脫緩沖液洗脫，用EP管收集洗脫液，每管1 mL。以空白洗脫緩沖液作空白對(duì)照，用紫外分光光度計(jì)初步測(cè)定各收集管蛋白濃度。將洗脫純化后的抗體，用12%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，測(cè)定純化抗體純度，將高蛋白濃度且純度達(dá)到要求的各管抗體合并，按照說(shuō)明書(shū)以BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，用BCA法檢測(cè)洗脫純化后抗體濃度。

1.2.2 噬菌體文庫(kù)擴(kuò)增 將宿主菌BLT5403接種于M9LB 培養(yǎng)基（Amp+），于37℃、200 r/min 搖床培養(yǎng)至吸光度OD600=1.0。將超低溫冰箱中保存的原始文庫(kù)解凍后與宿主菌液按 100:250 比例混勻，37℃作用 10～20 min，再與頂層瓊脂混合，鋪于 120 mm LB 平板頂層，37℃倒置培養(yǎng) 3～4 h。然后每塊板加 10 mL 噬菌體提取緩沖液，4℃存貯過(guò)夜，d2收集噬菌體提取緩沖液，加入0.5 mL氯仿混合均勻，3000×g離心 5 min，收集上清。

1.2.3 噬菌體滴度測(cè)定 將文庫(kù)或每輪篩選獲得的噬菌體分別用1×TBS按1:10比例稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋度各取100 μL，加入250 μL BLT5403培養(yǎng)菌液（OD600=1.0）中，混勻后37℃孵育20 min，加入3 mL冷卻至55℃的頂層瓊脂，上下顛倒混勻后迅速平鋪含1‰氨芐（氨芐濃度為100 mg/mL）瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)3～4 h，將平板上的噬菌斑進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算噬菌體的滴度（pfu/mL=噬菌斑個(gè)數(shù)×10×稀釋倍數(shù)）。

1.2.4 噬菌體展示文庫(kù)的篩選 將洗脫純化后抗體用CB 稀釋至蛋白含量為 10 μg/mL，按每孔100 μL加至 96 孔酶標(biāo)板中，4℃過(guò)夜，TBST洗滌3次，每次置于搖床振蕩5 min。加入1%明膠（200 μL/孔），37℃封閉 1 h，TBST清洗5 次，每次置于搖床振蕩 5 min。將擴(kuò)增文庫(kù)按每孔100 μL 加入板中，37℃孵育 1 h。TBST清洗 5 次，每次置于搖床振蕩 5 min。每孔加 2 mol/L 鹽酸胍 200 μL，室溫孵育 20 min 后洗脫。收集洗脫液，按上述文庫(kù)擴(kuò)增方法用宿主菌BLT5403 擴(kuò)增并測(cè)定滴度后用于下一輪篩選。水牛純化抗體進(jìn)行3輪篩選后，洗脫下噬菌體，繼續(xù)用黃牛純化抗體進(jìn)行3輪篩選，共連續(xù)進(jìn)行6輪篩選。

1.2.5 插入片段的序列測(cè)定及生物信息學(xué)分析 從6 輪篩選后擴(kuò)增平板上隨機(jī)挑取噬菌斑，浸入噬菌體提取緩沖液，用 T7 噬菌體載體引物以PCR方法擴(kuò)增插入片段。PCR條件：94℃熱變性5 min；94℃變性50 s、50℃退火1 min、72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸6 min。 取5 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將 PCR 產(chǎn)物送 Invitrogen 公司用T7 噬菌體載體引物測(cè)序。

將測(cè)序所得序列用 DNAStar MegAlign 軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析，獲取非重復(fù)序列，用BLASTn（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)）在 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性搜索，對(duì)已搜索到同源性的序列，用 Protein Blast 和tblastn（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）以及 Translation To（http://www.expasy.org/tools/dna.htmL）分析所獲取序列與T7 噬菌體載體是否對(duì)碼。用InterProScan（http//www.ebi.ac.uk/interpro/）和PROSITE（http://www.expasorg/ prosite/）等數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)這些序列編碼蛋白可能參與的生物學(xué)過(guò)程、分子功能及包含的結(jié)構(gòu)域。

2 結(jié)果

2.1 水牛、黃牛日本血吸蟲(chóng)陽(yáng)性血清IgG純化 將收集的日本血吸蟲(chóng)的水牛、黃牛血清分別經(jīng)Protein G親和柱層析純化，各得到5管洗脫液，純化抗體經(jīng)SDS-PAGE電泳后在50 kDa和25 kDa有兩條明顯的條帶（圖1），無(wú)其他雜條帶，說(shuō)明經(jīng)Protein G親和柱層析純化血清后，得到了較純凈的抗體。 純化抗體濃度：水牛870 μg/mL，黃牛1500 μg/mL。

圖1 利用Protein G 純化兩種動(dòng)物IgGFig.1 Purifi ed IgG from the two animals by Protein G

2.2 噬菌體展示文庫(kù)的篩選 用純化的水牛、黃牛IgG，依次對(duì)文庫(kù)進(jìn)行淘洗篩選，每種動(dòng)物進(jìn)行3輪篩選，每輪篩選之后檢測(cè)篩選洗脫液中的噬菌體滴度和擴(kuò)增之后測(cè)滴度。6輪篩選過(guò)程中噬菌體的投入、洗脫數(shù)量和富集程度結(jié)果見(jiàn)表1。從表中可以看出同種動(dòng)物IgG的第2輪篩選的富集度比第1輪高，第3輪篩選的富集度比第2輪略有提高，說(shuō)明與抗體結(jié)合的噬菌體量得到富集，經(jīng)過(guò)6輪篩選后去除了非特異性結(jié)合和低親和力的噬菌體。

2.3 插入片段的序列測(cè)定及生物信息學(xué)分析 從第 6輪篩選后擴(kuò)增平板上隨機(jī)挑取 53個(gè)陽(yáng)性菌體克隆進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)歸類(lèi)分析后得到9個(gè) EST序列。利用BLAST 軟件搜索這9個(gè) EST在GeneBank 中的同源序列，其中7個(gè)與已登錄的血吸蟲(chóng)已知基因相匹配，2個(gè)與數(shù)據(jù)庫(kù)中數(shù)據(jù)沒(méi)有同源性。以噬菌體展示載體的 10B 衣殼蛋白開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）為依據(jù)，對(duì)上述 7個(gè)與 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)資料同源的 EST 進(jìn)行對(duì)碼分析，結(jié)果 7個(gè)EST序列能和噬菌體展示載體閱讀框?qū)Υa，為有效展示序列。

在7個(gè)與已登錄的血吸蟲(chóng)已知基因相匹配的EST序列中，編碼HSP70 homolog的基因有25個(gè)重復(fù)，編碼Keratin 9的基因有15個(gè)重復(fù)，編碼Ornithine--oxo-acid transaminase的基因有6個(gè)重復(fù)，編碼Protein BUD31 homolog的基因有2個(gè)重復(fù)，為篩選出的重復(fù)較多的EST序列。篩選出的其他基因序列均沒(méi)有重復(fù)，其生物信息學(xué)分析結(jié)果如表2。

表1 6輪篩選的噬菌體富集結(jié)果Table1 The phages enrichment results by two kinds of serum after six rounds of biopanning

表2 陽(yáng)性克隆的生物信息學(xué)分析Table2 Bioinformatic analysis of the positive clones

3 討論

黃牛與水牛一直被認(rèn)為是我國(guó)血吸蟲(chóng)病傳播的重要宿主[8]。目前對(duì)血吸蟲(chóng)病診斷候選抗原基因的研究，大多數(shù)均以人群血吸蟲(chóng)病診斷為目的。由于動(dòng)物宿主在抗原遞呈方面存在差異，可能導(dǎo)致其在感染血吸蟲(chóng)后血清抗體對(duì)血吸蟲(chóng)抗原的反應(yīng)也存在差異。家畜血吸蟲(chóng)病診斷抗原的選擇應(yīng)考慮宿主免疫的差異性，一方面需對(duì)已報(bào)道的候選基因重組抗原進(jìn)行家畜血吸蟲(chóng)病診斷效果評(píng)估，另一方面還需篩選適合不同家畜品種的抗原基因。本研究分別從曾感染血吸蟲(chóng)的水牛和黃牛血清中純化IgG，篩選日本血吸蟲(chóng)噬菌體展示文庫(kù)，期望獲得能同時(shí)診斷水牛和黃牛日本血吸蟲(chóng)病的抗原基因。

噬菌體展示技術(shù)可將編碼蛋白質(zhì)的 DNA 序列插入到噬菌體基因組中，使表達(dá)的目標(biāo)多肽或蛋白以與內(nèi)源蛋白融合的形式展示在噬菌體顆粒表面[9]，該技術(shù)使表達(dá)產(chǎn)物與其編碼基因在同一噬菌體顆粒上建立起一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系，并且被展示的外源肽或蛋白可保持相對(duì)獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性[10]，篩選出的噬菌體陽(yáng)性克隆，本身可以直接作為候選重組診斷抗原，用于診斷效果的評(píng)估，同時(shí)也可以得到具有診斷價(jià)值的候選靶基因。篩選出的噬菌體陽(yáng)性克隆，重復(fù)數(shù)量越多，表明該噬菌體陽(yáng)性克隆在逐級(jí)篩選過(guò)程中富集程度越高，更易篩選出的具有較高診斷價(jià)值的噬菌體陽(yáng)性克隆。本研究篩選出的HSP70 homolog 基因?yàn)楹Y選出的重復(fù)數(shù)最高的基因，日本血吸蟲(chóng)HSP70（Grp78）基因，曾被報(bào)道具有高度的抗原特異性，并具有一定的早期診斷與療效考核潛能[11]。Keratin9基因?yàn)槿毡狙x(chóng)的卵殼蛋白基因的一部分，唐小牛等[12]、張莉等[13]曾嘗試對(duì)此基因進(jìn)行原核克隆表達(dá)，研究其作為候選疫苗分子和診斷抗原的可能性，但未見(jiàn)后續(xù)報(bào)道。劉蘭英等[14]通過(guò)構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒，在Hela細(xì)胞中高效表達(dá)卵殼蛋白，表達(dá)的重組蛋白具有較強(qiáng)的免疫活性。鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶在血吸蟲(chóng)中的特性尚無(wú)報(bào)道，對(duì)脊椎動(dòng)物的研究發(fā)現(xiàn)，作為尿循環(huán)中的最后一個(gè)酶，鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶的主要作用是解毒，存在于血細(xì)胞中。Lu等[15]采用純化的抗血吸蟲(chóng)全蟲(chóng)蛋白的IgY 作為捕捉抗體，對(duì)感染血吸蟲(chóng)病患者的血清進(jìn)行篩選，獲得了4個(gè)可能具有診斷價(jià)值的循環(huán)抗原，其中包括Protein BUD31 homolog。

由于淘洗法篩選噬菌體文庫(kù)的假陽(yáng)性較高，難以用陰性血清IgG進(jìn)行扣除，本研究篩選獲得的基因的表達(dá)產(chǎn)物是否能用于家畜血吸蟲(chóng)病的診斷，還需后續(xù)對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行克隆、表達(dá)后驗(yàn)證。

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SCREENING OF A PHAGE DISPLAY CDNA LIBRARY OF SCHISTOSOMA JAPONICUM WITH IGG FROM INFECTED BUFFALO AND CATTLE

FENG Jin-tao, HAN Yu, YUAN Wei, ZHANG Xin, XU Rui, LI Hao, LU Ke, JIN Ya-mei, LIN Jiao-jiao, CHENG Guo-feng, LIU Jin-ming
(Key Laboratory of Animal Parasitology of Ministry of Agriculture, National Laboratory of Animal Schistosomiasis Control, Shanghai Veterinary Research Institute ,CAAS, Shanghai 200241, China)

In order to fi nd the effective diagnostic antigen for S.japonicum infection in domestic animals, IgG preparations were purifi ed from serum samples of infected buffalo and cattle and used to screen a phage display cDNA library from 44-day-old worms.After a total of six rounds of biopanning, 53 positive clones were randomly picked and sequenced and 9 ESTs including 2 unnamed ESTs were obtained.With open reading frame (ORF) of 10B capsid protein in phage display vector as the basis, 7 ESTs were determined to be effective display sequences.Among the 7 effectively displayed ESTs, 3 ESTs had higher multiplicity.Among the 51 positive clones sequenced, 25 clones were HSP70 homolog, 15 clones were Keratin 9 and 6 clones were Ornithine-oxo-acid transaminase.These results obtained here suggested that the genes encoding HSP70 homolog, Keratin 9 and Ornithine-oxo-acid transaminase might be relevant to the candidate diagnostic antigens for detection of S.japonicum infection in domestic animals.

Schistosoma japonicum; buffalo; cattle; screening; phage display cDNA library

S852.735

A

1674-6422（2016）02-0062-06

2015-12-28

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)（201303037）；農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫情監(jiān)測(cè)與防治

馮金濤，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)

劉金明，E-mail：jimyliu@shvri.ac.cn