馬香芹 劉 芳 盧澤愷 趙汴霞 趙 娜 馬 莉 楊紅梅
(河南醫(yī)學高等專科學校,河南 鄭州 451191)
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替米沙坦聯(lián)合氨氯地平對乳鼠轉(zhuǎn)化生長因子-β1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達的影響
馬香芹 劉 芳 盧澤愷 趙汴霞 趙 娜 馬 莉 楊紅梅
(河南醫(yī)學高等??茖W校,河南 鄭州 451191)
目的 探討替米沙坦聯(lián)合氨氯地平對血管緊張素(Ang)Ⅱ誘導的乳鼠心肌成纖維細胞增殖及細胞中轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達的影響。方法 對Wistar乳鼠心肌成纖維細胞行體外原代及傳代培養(yǎng),將培養(yǎng)好的細胞分為5組:對照組(加入15%小牛血清DEME培養(yǎng)液)、AngⅡ組(15%小牛血清DEME培養(yǎng)液+1×10-6mol/L AngⅡ),替米沙坦組(TE組,在AngⅡ組基礎(chǔ)上加入10 μmol/L替米沙坦),氨氯地平組(AM組,AngⅡ組基礎(chǔ)上加入1 μmol/L氨氯地平)及替米沙坦+氨氯地平組(TE+AM組),在AngⅡ組基礎(chǔ)上加入10 μmol/L替米沙坦+1 μmol/L氨氯地平),每組3份。觀察各組細胞不同時期增殖情況及TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白、p27蛋白表達情況。結(jié)果 與對照組相比,AngⅡ組心肌成纖維細胞在S期時增殖率較高,而在G0/G1期、G2/M期時增殖率下降(P<0.05),TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白、p27蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。與AngⅡ組相比,TE組、AM組及TE+AM組心肌成纖維細胞在S期時增殖率顯著下降,而在G0/G1期、G2/M期時增殖率升高(P<0.05),TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白、p27蛋白表達水平下降(P<0.05),其中TE+AM組心肌成纖維細胞在G0/G1期、G2/M期增殖較TE組、AM組顯著,而TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白、p27蛋白表達水平低于TE組、AM組。結(jié)論 替米沙坦聯(lián)合氨氯地平能有效抑制AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞增殖,其可能機制與抑制TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白及p27蛋白過度表達有關(guān)。
替米沙坦;氨氯地平;血管緊張素Ⅱ;心肌成纖維細胞
心肌纖維化是心肌功能衰退的重要表現(xiàn),與心源性猝死、心力衰竭及心律失常等多種終末期心臟病發(fā)生有密切的關(guān)系〔1〕。成纖維細胞活化是心肌纖維化的重要誘因,而在這過程中血管緊張素(Ang)Ⅱ起到重要的作用。Ang Ⅱ可刺激心肌膠原合成,促使成纖維細胞增殖,介導心肌纖維化〔2〕。近年有研究指出,轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1異常表達是引起心肌纖維化的重要通路,在心肌纖維化中起到重要的作用〔3〕。替米沙坦屬于Ang Ⅱ受體拮抗劑,能有效預防心肌纖維化;氨氯地平可有效舒張血管,改善心肌供血并抑制心肌纖維化〔4〕。本研究將探討替米沙坦聯(lián)合氨氯地平對AngⅡ誘導的乳鼠心肌成纖維細胞增殖及細胞中TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達的影響。
1.1 實驗動物 新生1~3 d Wistar 大鼠,雌雄不拘,由河南省實驗動物中心提供。
1.2 實驗試劑 新生胎牛血清(北京雅安達生物技術(shù)有限公司);DEME培養(yǎng)液(美國Sigma公司);AngⅡ(北京方程生物科技有限公司);胰蛋白酶消化液(北京索萊寶科技有限公司);雙抗(青霉素+鏈霉素);Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白試劑盒〔卡邁舒(上海)生物科技有限公司〕;p27蛋白試劑盒(上海撫生實業(yè)有限公司);TGF-β1(美國 HyClone 公司);替米沙坦(生產(chǎn)日期:H201502036;北京萬生藥業(yè)有限責任公司);氨氯地平(批號:H201509123;蘇州第壹制藥有限公司)。
1.3 實驗儀器 光學顯微鏡(型號:DMLP-MP30;日本RICOH公司);微量移液器(20、200、1 000 μl)購自DragonMed公司;臺式微量離心機(型號H1650-W;美國Sigma公司);高速冷凍離心機(型號:A1330103;美國Beckman公司);臺式低溫高速離心機(型號:TD-35M/TD35;德國Hettich公司);CO2培養(yǎng)箱(型號:MCO-20AIC;德國Heraeus公司);電子天平(BP211D型;Sartorius公司);酶聯(lián)免疫檢測儀(型號:DG-3022型,國營華東電子管廠產(chǎn)品);流式細胞儀(規(guī)格型號:1401-X-20R;貝克曼庫爾特有限公司)。
1.4 方法
1.4.1 心肌成纖維細胞的培養(yǎng) 在無菌操作條件下取30只Wistar乳鼠,將其左心室取出并剪碎成1 mm3大小,應(yīng)用磷酸鹽緩沖液(PBS)反復沖洗3次,依次加入0.01% Ⅱ型膠原酶、0.08%胰蛋白酶消化10 min,反復消化直至組織塊消失。收集懸浮液離心過濾后留取沉淀物,并置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。由于成纖維細胞與心肌細胞生長時間不同,采用差速貼壁2 h獲得心肌成纖維細胞,待細胞生長至滿瓶后應(yīng)用0.25% 胰酶消化傳代培養(yǎng),培養(yǎng)2~3代后收集成纖維細胞。
1.4.2 心肌成纖維細胞鑒定 將傳代成纖維細胞接種至玻片中,待細胞爬滿玻片后,將玻片取出,PBS沖洗3遍,室溫下加入4% 多聚甲醛固定,恒溫水浴箱中孵育30 min,采用山羊血清封閉,室溫下以1∶50加入鼠抗波形蛋白抗體工作液恒溫孵育3 h,依次加入經(jīng)生物素標記山羊抗小鼠免疫球蛋白及辣根酶標記鏈霉卵白素工作液于室溫孵育。應(yīng)用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑顯色,PBS沖洗,蘇木素復染,酒精梯度脫水,中性樹脂封固,并于倒置顯微鏡下觀察心肌成纖維細胞形態(tài)。
1.4.3 樣本分組及處理 對照組(加入15%小牛血清DEME培養(yǎng)液),AngⅡ組(15%小牛血清DEME培養(yǎng)液+1×10-6mol/L AngⅡ),替米沙坦組(TE組,在AngⅡ組基礎(chǔ)上加入10 μmol/L替米沙坦),氨氯地平組(AM組,AngⅡ組基礎(chǔ)上加入1 μmol/L氨氯地平)、替米沙坦+氨氯地平組(TE+AM組,在AngⅡ組基礎(chǔ)上加入10 μmol/L替米沙坦+1 μmol/L氨氯地平),每組3份。
1.4.4 心肌成纖維細胞增長率測定 預處理各組細胞,應(yīng)用流式細胞儀測定各組在G0/G1期、S期、G2/M期細胞懸浮液,測定前以70%酒精固定細胞,加入500 μl碘化丙啶綜合染色,加蒸餾水至100 ml,室溫下放置30 min后上機檢測,重復操作3次。
1.4.5 免疫熒光法測定TGF-β1 蛋白 每組隨機抽取3張已制備好的心肌組織石蠟切片,酒精梯度脫水,PBS洗3遍,室溫下加入3% H2O2,常溫下孵育10 min抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性,PBS沖洗3遍,明火低溫加熱8 min,待水溫下降至室溫后采用PBS洗滌3次,依次加入10%山羊血清常溫下孵育30 min,加入一抗4℃孵育過夜后PBS沖洗,加入熒光二抗,室溫避光孵育30 min,PBS沖洗。樣品制備完畢后于熒光分析儀下觀察細胞蛋白表達情況。
1.4.6 免疫組化法測定TGF-β1蛋白 取100 mg細胞搗碎,4℃ 14 000 r/min 離心10 min,留取上清液,準確移取樣液10 μl加入SDS-PAGE凝膠電泳孔中,轉(zhuǎn)膜、封閉,加入兔抗鼠TGF-β1與β-actin,4℃封閉過夜,應(yīng)用經(jīng)辣根過氧化氫酶標記的山羊抗鼠免疫球蛋白,曝光、掃描,計算蛋白表達量。
1.4.7 酶聯(lián)法測定Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白、p27蛋白 酶聯(lián)反應(yīng)板每孔中依次加入100 μl待測樣品,加入100 μl一抗工作液,應(yīng)用PBS反復洗滌反應(yīng)板,37℃中恒溫加熱60 min,每孔加入100 μl酶標抗體工作液,37℃下水浴加熱30 min,每孔加入100 μl終止液混勻,應(yīng)用酶標儀于450 nm處測定吸光值。
2.1 心肌成纖維細胞鑒定 在倒置顯微鏡下可觀察到心肌成
纖維細胞胞體較大,胞質(zhì)透明,細胞呈梭形,細胞核呈橢圓形,通常含2~3個核,細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒,細胞純度高達98%,見圖1。
2.2 各組心肌成纖維細胞不同細胞時期增殖情況 與對照組相比,AngⅡ組心肌成纖維細胞在S期時增殖率較高,而在G0/G1期、G2/M期時增殖率下降(P<0.05);與AngⅡ組相比,TE組、AM組及TE+AM組心肌成纖維細胞在S期時增殖率顯著下降,而在G0/G1期、G2/M期時增殖率升高(P<0.05),見表1。
2.3 免疫熒光法檢測 TGF-β1 蛋白表達 與對照組相比,AngⅡ組心肌組織中TGF-β1 蛋白熒光強度較強,而TE組、AM組及TE+AM組心肌成纖維細胞熒光強度依次減弱,見圖2。
圖1 倒置顯微鏡下觀察心肌成纖維細胞(×200)
組別G0/G1期S期G2/M期對照組70.23±1.2815.33±1.2017.33±2.12AngⅡ組57.22±2.451)33.58±4.691)9.33±2.451)TE組62.33±3.251)2)23.22±2.481)2)12.25±1.781)2)AM組62.98±3.351)2)23.69±2.381)2)12.63±1.691)2)TE+AM組65.98±2.181)2)3)4)19.33±3.141)2)3)4)14.66±2.021)2)3)4)
與對照組比較:1)P<0.05;與AngⅡ組比較:2)P<0.05;與TE組比較:3)P<0.05;與AM組比較:4)P<0.05
各圖右上為抗-TGF-β1免疫熒光,右下為 DAPI 染色核定位,左側(cè)為右上與右下重疊圖圖2 免疫熒光法檢測 TGF-β1 蛋白表達
2.4 免疫組化法測定TGF-β1 蛋白 與對照組相比,AngⅡ組心肌組織中TGF-β1 蛋白表達較強,而TE組、AM組及TE+AM組心肌成纖維細胞表達隨劑量增加而減弱,條帶灰度依次減弱,見圖3和表2。
2.5 各組TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白及p27蛋白定量分析 如表2所示,與對照組相比,AngⅡ組心肌成纖維細胞TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白、p27蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。與AngⅡ組相比,TE組、AM組及TE+AM組TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白、p27蛋白表達水平下降(P<0.05),其中TE+AM組心肌成纖維細胞中TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白、p27蛋白表達水平低于TE組、AM組(P<0.05),見表2。
表2 各組TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白及p27蛋白定量分析
與對照組相比:1)P<0.05;與AngⅡ組相:2)P<0.05;與TE組相比:3)P<0.05;與AM組相比:4)P<0.05
圖3 免疫組化法測定TGF-β1 蛋白
心肌纖維化是多種心臟病的終末期表現(xiàn),在多種血管活性物質(zhì)及促纖維化因子的作用下可激活多種細胞信號通路,進而引起心肌細胞過度增殖并引起膠原蛋白沉積,增加心室僵硬度,進一步促進心肌纖維化發(fā)生〔5〕。
Ang Ⅱ具有收縮血管作用,與Ang Ⅱ受體結(jié)合可促進基底細胞底物磷酸化,并可通過酪氨酸酶途徑激活絲裂霉素活化蛋白酶,從而促進及介導心肌成纖維化細胞增殖及轉(zhuǎn)化,在心臟病終末期病變中起到重要的作用。本研究結(jié)果進一步表明AngⅡ可破壞細胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài),促進膠原蛋白沉積,從而誘導心肌細胞纖維化〔6〕。
相關(guān)研究指出〔7〕,TGF-β1可通過誘導纖維連接蛋白、蛋白寡糖及纖維膠原等成分從而誘導心肌細胞纖維化。本研究結(jié)果與Wang等〔8〕一致,表明TGF-β1可通過介導信號通路從而誘發(fā)心肌成纖維細胞增殖。p27是TGF-β1及其細胞外因子誘導細胞生長停滯的主要介質(zhì),在AngⅡ誘導下p27可參與血管、心臟細胞肥大,并可引起動脈粥樣硬化〔9〕。張平等〔10〕研究指出,AngⅡ可通過上調(diào)p27蛋白表達使得靜止期的血管平滑肌細胞從G1期進入S期,從而介導細胞平滑肌增生。
替米沙坦作為新一代非肽類AngⅡ受體拮抗劑,能與AngⅡ受體結(jié)合從而阻斷腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAS)活性,抑制AngⅡ分泌〔11〕。宋占春等〔12〕研究認為,替米沙坦能有效降低心肌病大鼠炎癥標志物及心肌蛋白的表達,并能有效降低心肌相關(guān)膠原蛋白表達,抑制心肌纖維化。氯氨地平屬于鈣離子抑制劑,能有效改善心肌供血,降低心臟壓力負荷,抑制心肌膠原蛋白生成,進而抑制心肌纖維化〔13〕。
本研究結(jié)果顯示替米沙坦聯(lián)合氯氨地平能有效抑制TGF-β1表達,阻斷Ⅰ、Ⅱ膠原蛋白、p27蛋白生成。這可能由于替米沙坦與氯氨地平聯(lián)合應(yīng)用時能起到藥物協(xié)同效果,能有效抑制RAS活性,從而抑制AngⅡ分泌,進而改善心肌纖維化。
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〔2016-04-12修回〕
(編輯 李相軍)
河南省2014年基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃項目(142300410467)
楊紅梅(1969-),女,碩士,教授,主要從事氧化與抗氧化研究。
馬香芹(1977-),女,碩士,副教授,主要從事心血管藥理學研究。
R969.4
A
1005-9202(2016)20-4963-03;
10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.010