• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    替米沙坦聯(lián)合氨氯地平對乳鼠轉(zhuǎn)化生長因子-β1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達的影響

    2016-11-28 00:44:34馬香芹盧澤愷趙汴霞楊紅梅
    中國老年學雜志 2016年20期
    關(guān)鍵詞:增殖率米沙坦膠原蛋白

    馬香芹 劉 芳 盧澤愷 趙汴霞 趙 娜 馬 莉 楊紅梅

    (河南醫(yī)學高等專科學校,河南 鄭州 451191)

    ?

    替米沙坦聯(lián)合氨氯地平對乳鼠轉(zhuǎn)化生長因子-β1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達的影響

    馬香芹 劉 芳 盧澤愷 趙汴霞 趙 娜 馬 莉 楊紅梅

    (河南醫(yī)學高等??茖W校,河南 鄭州 451191)

    目的 探討替米沙坦聯(lián)合氨氯地平對血管緊張素(Ang)Ⅱ誘導的乳鼠心肌成纖維細胞增殖及細胞中轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達的影響。方法 對Wistar乳鼠心肌成纖維細胞行體外原代及傳代培養(yǎng),將培養(yǎng)好的細胞分為5組:對照組(加入15%小牛血清DEME培養(yǎng)液)、AngⅡ組(15%小牛血清DEME培養(yǎng)液+1×10-6mol/L AngⅡ),替米沙坦組(TE組,在AngⅡ組基礎(chǔ)上加入10 μmol/L替米沙坦),氨氯地平組(AM組,AngⅡ組基礎(chǔ)上加入1 μmol/L氨氯地平)及替米沙坦+氨氯地平組(TE+AM組),在AngⅡ組基礎(chǔ)上加入10 μmol/L替米沙坦+1 μmol/L氨氯地平),每組3份。觀察各組細胞不同時期增殖情況及TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白、p27蛋白表達情況。結(jié)果 與對照組相比,AngⅡ組心肌成纖維細胞在S期時增殖率較高,而在G0/G1期、G2/M期時增殖率下降(P<0.05),TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白、p27蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。與AngⅡ組相比,TE組、AM組及TE+AM組心肌成纖維細胞在S期時增殖率顯著下降,而在G0/G1期、G2/M期時增殖率升高(P<0.05),TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白、p27蛋白表達水平下降(P<0.05),其中TE+AM組心肌成纖維細胞在G0/G1期、G2/M期增殖較TE組、AM組顯著,而TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白、p27蛋白表達水平低于TE組、AM組。結(jié)論 替米沙坦聯(lián)合氨氯地平能有效抑制AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞增殖,其可能機制與抑制TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白及p27蛋白過度表達有關(guān)。

    替米沙坦;氨氯地平;血管緊張素Ⅱ;心肌成纖維細胞

    心肌纖維化是心肌功能衰退的重要表現(xiàn),與心源性猝死、心力衰竭及心律失常等多種終末期心臟病發(fā)生有密切的關(guān)系〔1〕。成纖維細胞活化是心肌纖維化的重要誘因,而在這過程中血管緊張素(Ang)Ⅱ起到重要的作用。Ang Ⅱ可刺激心肌膠原合成,促使成纖維細胞增殖,介導心肌纖維化〔2〕。近年有研究指出,轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1異常表達是引起心肌纖維化的重要通路,在心肌纖維化中起到重要的作用〔3〕。替米沙坦屬于Ang Ⅱ受體拮抗劑,能有效預防心肌纖維化;氨氯地平可有效舒張血管,改善心肌供血并抑制心肌纖維化〔4〕。本研究將探討替米沙坦聯(lián)合氨氯地平對AngⅡ誘導的乳鼠心肌成纖維細胞增殖及細胞中TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達的影響。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物 新生1~3 d Wistar 大鼠,雌雄不拘,由河南省實驗動物中心提供。

    1.2 實驗試劑 新生胎牛血清(北京雅安達生物技術(shù)有限公司);DEME培養(yǎng)液(美國Sigma公司);AngⅡ(北京方程生物科技有限公司);胰蛋白酶消化液(北京索萊寶科技有限公司);雙抗(青霉素+鏈霉素);Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白試劑盒〔卡邁舒(上海)生物科技有限公司〕;p27蛋白試劑盒(上海撫生實業(yè)有限公司);TGF-β1(美國 HyClone 公司);替米沙坦(生產(chǎn)日期:H201502036;北京萬生藥業(yè)有限責任公司);氨氯地平(批號:H201509123;蘇州第壹制藥有限公司)。

    1.3 實驗儀器 光學顯微鏡(型號:DMLP-MP30;日本RICOH公司);微量移液器(20、200、1 000 μl)購自DragonMed公司;臺式微量離心機(型號H1650-W;美國Sigma公司);高速冷凍離心機(型號:A1330103;美國Beckman公司);臺式低溫高速離心機(型號:TD-35M/TD35;德國Hettich公司);CO2培養(yǎng)箱(型號:MCO-20AIC;德國Heraeus公司);電子天平(BP211D型;Sartorius公司);酶聯(lián)免疫檢測儀(型號:DG-3022型,國營華東電子管廠產(chǎn)品);流式細胞儀(規(guī)格型號:1401-X-20R;貝克曼庫爾特有限公司)。

    1.4 方法

    1.4.1 心肌成纖維細胞的培養(yǎng) 在無菌操作條件下取30只Wistar乳鼠,將其左心室取出并剪碎成1 mm3大小,應(yīng)用磷酸鹽緩沖液(PBS)反復沖洗3次,依次加入0.01% Ⅱ型膠原酶、0.08%胰蛋白酶消化10 min,反復消化直至組織塊消失。收集懸浮液離心過濾后留取沉淀物,并置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。由于成纖維細胞與心肌細胞生長時間不同,采用差速貼壁2 h獲得心肌成纖維細胞,待細胞生長至滿瓶后應(yīng)用0.25% 胰酶消化傳代培養(yǎng),培養(yǎng)2~3代后收集成纖維細胞。

    1.4.2 心肌成纖維細胞鑒定 將傳代成纖維細胞接種至玻片中,待細胞爬滿玻片后,將玻片取出,PBS沖洗3遍,室溫下加入4% 多聚甲醛固定,恒溫水浴箱中孵育30 min,采用山羊血清封閉,室溫下以1∶50加入鼠抗波形蛋白抗體工作液恒溫孵育3 h,依次加入經(jīng)生物素標記山羊抗小鼠免疫球蛋白及辣根酶標記鏈霉卵白素工作液于室溫孵育。應(yīng)用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑顯色,PBS沖洗,蘇木素復染,酒精梯度脫水,中性樹脂封固,并于倒置顯微鏡下觀察心肌成纖維細胞形態(tài)。

    1.4.3 樣本分組及處理 對照組(加入15%小牛血清DEME培養(yǎng)液),AngⅡ組(15%小牛血清DEME培養(yǎng)液+1×10-6mol/L AngⅡ),替米沙坦組(TE組,在AngⅡ組基礎(chǔ)上加入10 μmol/L替米沙坦),氨氯地平組(AM組,AngⅡ組基礎(chǔ)上加入1 μmol/L氨氯地平)、替米沙坦+氨氯地平組(TE+AM組,在AngⅡ組基礎(chǔ)上加入10 μmol/L替米沙坦+1 μmol/L氨氯地平),每組3份。

    1.4.4 心肌成纖維細胞增長率測定 預處理各組細胞,應(yīng)用流式細胞儀測定各組在G0/G1期、S期、G2/M期細胞懸浮液,測定前以70%酒精固定細胞,加入500 μl碘化丙啶綜合染色,加蒸餾水至100 ml,室溫下放置30 min后上機檢測,重復操作3次。

    1.4.5 免疫熒光法測定TGF-β1 蛋白 每組隨機抽取3張已制備好的心肌組織石蠟切片,酒精梯度脫水,PBS洗3遍,室溫下加入3% H2O2,常溫下孵育10 min抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性,PBS沖洗3遍,明火低溫加熱8 min,待水溫下降至室溫后采用PBS洗滌3次,依次加入10%山羊血清常溫下孵育30 min,加入一抗4℃孵育過夜后PBS沖洗,加入熒光二抗,室溫避光孵育30 min,PBS沖洗。樣品制備完畢后于熒光分析儀下觀察細胞蛋白表達情況。

    1.4.6 免疫組化法測定TGF-β1蛋白 取100 mg細胞搗碎,4℃ 14 000 r/min 離心10 min,留取上清液,準確移取樣液10 μl加入SDS-PAGE凝膠電泳孔中,轉(zhuǎn)膜、封閉,加入兔抗鼠TGF-β1與β-actin,4℃封閉過夜,應(yīng)用經(jīng)辣根過氧化氫酶標記的山羊抗鼠免疫球蛋白,曝光、掃描,計算蛋白表達量。

    1.4.7 酶聯(lián)法測定Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白、p27蛋白 酶聯(lián)反應(yīng)板每孔中依次加入100 μl待測樣品,加入100 μl一抗工作液,應(yīng)用PBS反復洗滌反應(yīng)板,37℃中恒溫加熱60 min,每孔加入100 μl酶標抗體工作液,37℃下水浴加熱30 min,每孔加入100 μl終止液混勻,應(yīng)用酶標儀于450 nm處測定吸光值。

    2 結(jié) 果

    2.1 心肌成纖維細胞鑒定 在倒置顯微鏡下可觀察到心肌成

    纖維細胞胞體較大,胞質(zhì)透明,細胞呈梭形,細胞核呈橢圓形,通常含2~3個核,細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒,細胞純度高達98%,見圖1。

    2.2 各組心肌成纖維細胞不同細胞時期增殖情況 與對照組相比,AngⅡ組心肌成纖維細胞在S期時增殖率較高,而在G0/G1期、G2/M期時增殖率下降(P<0.05);與AngⅡ組相比,TE組、AM組及TE+AM組心肌成纖維細胞在S期時增殖率顯著下降,而在G0/G1期、G2/M期時增殖率升高(P<0.05),見表1。

    2.3 免疫熒光法檢測 TGF-β1 蛋白表達 與對照組相比,AngⅡ組心肌組織中TGF-β1 蛋白熒光強度較強,而TE組、AM組及TE+AM組心肌成纖維細胞熒光強度依次減弱,見圖2。

    圖1 倒置顯微鏡下觀察心肌成纖維細胞(×200)

    組別G0/G1期S期G2/M期對照組70.23±1.2815.33±1.2017.33±2.12AngⅡ組57.22±2.451)33.58±4.691)9.33±2.451)TE組62.33±3.251)2)23.22±2.481)2)12.25±1.781)2)AM組62.98±3.351)2)23.69±2.381)2)12.63±1.691)2)TE+AM組65.98±2.181)2)3)4)19.33±3.141)2)3)4)14.66±2.021)2)3)4)

    與對照組比較:1)P<0.05;與AngⅡ組比較:2)P<0.05;與TE組比較:3)P<0.05;與AM組比較:4)P<0.05

    各圖右上為抗-TGF-β1免疫熒光,右下為 DAPI 染色核定位,左側(cè)為右上與右下重疊圖圖2 免疫熒光法檢測 TGF-β1 蛋白表達

    2.4 免疫組化法測定TGF-β1 蛋白 與對照組相比,AngⅡ組心肌組織中TGF-β1 蛋白表達較強,而TE組、AM組及TE+AM組心肌成纖維細胞表達隨劑量增加而減弱,條帶灰度依次減弱,見圖3和表2。

    2.5 各組TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白及p27蛋白定量分析 如表2所示,與對照組相比,AngⅡ組心肌成纖維細胞TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白、p27蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。與AngⅡ組相比,TE組、AM組及TE+AM組TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白、p27蛋白表達水平下降(P<0.05),其中TE+AM組心肌成纖維細胞中TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白、p27蛋白表達水平低于TE組、AM組(P<0.05),見表2。

    表2 各組TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白及p27蛋白定量分析

    與對照組相比:1)P<0.05;與AngⅡ組相:2)P<0.05;與TE組相比:3)P<0.05;與AM組相比:4)P<0.05

    圖3 免疫組化法測定TGF-β1 蛋白

    3 討 論

    心肌纖維化是多種心臟病的終末期表現(xiàn),在多種血管活性物質(zhì)及促纖維化因子的作用下可激活多種細胞信號通路,進而引起心肌細胞過度增殖并引起膠原蛋白沉積,增加心室僵硬度,進一步促進心肌纖維化發(fā)生〔5〕。

    Ang Ⅱ具有收縮血管作用,與Ang Ⅱ受體結(jié)合可促進基底細胞底物磷酸化,并可通過酪氨酸酶途徑激活絲裂霉素活化蛋白酶,從而促進及介導心肌成纖維化細胞增殖及轉(zhuǎn)化,在心臟病終末期病變中起到重要的作用。本研究結(jié)果進一步表明AngⅡ可破壞細胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài),促進膠原蛋白沉積,從而誘導心肌細胞纖維化〔6〕。

    相關(guān)研究指出〔7〕,TGF-β1可通過誘導纖維連接蛋白、蛋白寡糖及纖維膠原等成分從而誘導心肌細胞纖維化。本研究結(jié)果與Wang等〔8〕一致,表明TGF-β1可通過介導信號通路從而誘發(fā)心肌成纖維細胞增殖。p27是TGF-β1及其細胞外因子誘導細胞生長停滯的主要介質(zhì),在AngⅡ誘導下p27可參與血管、心臟細胞肥大,并可引起動脈粥樣硬化〔9〕。張平等〔10〕研究指出,AngⅡ可通過上調(diào)p27蛋白表達使得靜止期的血管平滑肌細胞從G1期進入S期,從而介導細胞平滑肌增生。

    替米沙坦作為新一代非肽類AngⅡ受體拮抗劑,能與AngⅡ受體結(jié)合從而阻斷腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAS)活性,抑制AngⅡ分泌〔11〕。宋占春等〔12〕研究認為,替米沙坦能有效降低心肌病大鼠炎癥標志物及心肌蛋白的表達,并能有效降低心肌相關(guān)膠原蛋白表達,抑制心肌纖維化。氯氨地平屬于鈣離子抑制劑,能有效改善心肌供血,降低心臟壓力負荷,抑制心肌膠原蛋白生成,進而抑制心肌纖維化〔13〕。

    本研究結(jié)果顯示替米沙坦聯(lián)合氯氨地平能有效抑制TGF-β1表達,阻斷Ⅰ、Ⅱ膠原蛋白、p27蛋白生成。這可能由于替米沙坦與氯氨地平聯(lián)合應(yīng)用時能起到藥物協(xié)同效果,能有效抑制RAS活性,從而抑制AngⅡ分泌,進而改善心肌纖維化。

    1 劉 源,唐其柱,李利娜,等.橙皮素對血管緊張素Ⅱ誘導的心肌成纖維細胞增殖及膠原蛋白合成的抑制作用〔J〕.中華醫(yī)學雜志,2014;94(36):2852-6.

    2 阮 滔,何學華,劉麗萍,等.黃芪對心肌成纖維細胞增殖及分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β1的影響〔J〕.臨床兒科雜志,2015;33(3):284-6.

    3 胡哲夫,唐其柱,劉 源,等.橙皮素對轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導心肌成纖維細胞增殖的影響〔J〕.疑難病雜志,2015;14(4):376-9.

    4 馬香芹,黃顯峰,盧澤愷,等.替米沙坦聯(lián)合氨氯地平對腎性高血壓大鼠左室重構(gòu)的對比研究〔J〕.天津醫(yī)藥,2013;43(11):1114-6.

    5 曾 翼,趙 誠,王 霏,等.二苯乙烯苷對TGF-β1誘導新生大鼠心肌成纖維細胞增殖和膠原合成的影響及其機制〔J〕.中國藥科大學學報,2014;45(3):362-7.

    6 Ding Y,Peng Y,Li J,etal.Gualou Xiebai Decoction prevents myocardial fibrosis by blocking TGF-beta/Smad signalling〔J〕.J Pharm Pharmac,2013;65(9):45-8.

    7 Beaumont J,López B,Hermida N,etal.microRNA-122 down-regulation may play a role in severe myocardial fibrosis in human aortic stenosis through TGF-β1 up-regulation〔J〕.Clin Sci,2014;126(8):96-8.

    8 Wang W,Wang B,Lu Q,etal.Inhibition of high-mobility group box 1 improves myocardial fibrosis and dysfunction in diabetic cardiomyopathy〔J〕.Int J Cardiol,2014;172(1):45-8.

    9 Lu Y,Liu J,Bi X,etal.Pyridostigmine ameliorates cardiac remodeling induced by myocardial infarction via inhibition of the transforming growth factor-β1/tgf-β1- activated kinase pathway〔J〕.J Cardiovasc Pharmacol,2014;63(5):82-8.

    10 張 平,張再偉,邵 靚,等.TGF-β1、CTGF對慢性心衰心肌纖維化進展的臨床意義〔J〕.昆明醫(yī)科大學學報,2014;35(11):45-7.

    11 Krmer J,Niemann M,Liu D,etal.Two-dimensional speckle tracking as a non-invasive tool for identification of myocardial fibrosis in Fabry disease〔J〕.Eur Heart J,2013;34(21):45-8.

    12 宋占春,白靜慧,張麗莉,等.替米沙坦對大鼠急性心肌梗死后炎癥反應(yīng)及纖維化的干預機制〔J〕.中華醫(yī)學雜志,2014;94(33):2628-33.

    13 Li M,Jiang Y,Jing W,etal.Quercetin provides greater cardioprotective effect than its glycoside derivative rutin on isoproterenol-induced cardiac fibrosis in the rat〔J〕.Can J Physiol Pharmacol,2013;91(11):120-4.

    〔2016-04-12修回〕

    (編輯 李相軍)

    河南省2014年基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃項目(142300410467)

    楊紅梅(1969-),女,碩士,教授,主要從事氧化與抗氧化研究。

    馬香芹(1977-),女,碩士,副教授,主要從事心血管藥理學研究。

    R969.4

    A

    1005-9202(2016)20-4963-03;

    10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.010

    猜你喜歡
    增殖率米沙坦膠原蛋白
    氫氯噻嗪聯(lián)合替米沙坦用于高血壓治療的有效性分析
    亞硒酸鈉對小鼠脾臟淋巴細胞體外增殖及細胞因子分泌的影響
    提高室內(nèi)精養(yǎng)褶皺臂尾輪蟲增殖率的技術(shù)要點
    手術(shù)創(chuàng)傷對在體口腔黏膜細胞狀態(tài)的影響研究
    想不到你是這樣的膠原蛋白
    Coco薇(2017年12期)2018-01-03 21:27:09
    美國肉參膠原蛋白肽對H2O2損傷PC12細胞的保護作用
    膠原蛋白在食品中的應(yīng)用現(xiàn)狀及其發(fā)展前景分析
    梭魚骨膠原蛋白的提取及其性質(zhì)
    藜麥愈傷組織誘導體系優(yōu)化研究
    替米沙坦對慢性腎臟病患者血清BMP-7的影響
    免费观看的影片在线观看| 熟女电影av网| 欧美日韩视频精品一区| 搡老乐熟女国产| 国产人妻一区二区三区在| 少妇熟女欧美另类| 青春草视频在线免费观看| h日本视频在线播放| av免费观看日本| 久久人人爽人人爽人人片va| 我要看日韩黄色一级片| av免费在线看不卡| 麻豆乱淫一区二区| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 免费看不卡的av| 熟女电影av网| av免费观看日本| 欧美精品国产亚洲| 91在线精品国自产拍蜜月| 久久精品夜色国产| 欧美成人午夜免费资源| 一个人看视频在线观看www免费| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产一区二区三区av在线| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产成人精品婷婷| 丰满迷人的少妇在线观看| 视频中文字幕在线观看| 中文字幕亚洲精品专区| 黑丝袜美女国产一区| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 美女内射精品一级片tv| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 一个人看的www免费观看视频| 国产精品福利在线免费观看| 国产黄片视频在线免费观看| 99久久人妻综合| 久久久久久久久久久免费av| 高清日韩中文字幕在线| 国产片特级美女逼逼视频| 免费少妇av软件| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 我的女老师完整版在线观看| 男人和女人高潮做爰伦理| 免费黄频网站在线观看国产| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 亚洲内射少妇av| 男人爽女人下面视频在线观看| 日韩视频在线欧美| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 大片电影免费在线观看免费| 最近的中文字幕免费完整| 日韩欧美一区视频在线观看 | 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 激情五月婷婷亚洲| 免费看日本二区| 不卡视频在线观看欧美| 一区在线观看完整版| 久久99热这里只频精品6学生| 国产精品久久久久久精品古装| 高清视频免费观看一区二区| 99热国产这里只有精品6| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 直男gayav资源| 黑丝袜美女国产一区| 日日撸夜夜添| 女性被躁到高潮视频| 涩涩av久久男人的天堂| 国产色爽女视频免费观看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜 | 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 中国三级夫妇交换| 国产亚洲最大av| 精品少妇久久久久久888优播| 日日摸夜夜添夜夜爱| 毛片女人毛片| 国产69精品久久久久777片| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲av二区三区四区| 亚洲精品视频女| 国产成人91sexporn| 久久久久人妻精品一区果冻| 精品久久久久久久末码| 99热6这里只有精品| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产成人午夜福利电影在线观看| 亚洲成人av在线免费| 国产精品成人在线| av免费在线看不卡| 久久人人爽人人片av| 亚洲国产精品999| 亚洲精品日韩av片在线观看| 性色avwww在线观看| 日日啪夜夜爽| 男女啪啪激烈高潮av片| 天堂8中文在线网| 亚洲成人一二三区av| 人妻制服诱惑在线中文字幕| xxx大片免费视频| 日韩成人伦理影院| 亚洲熟女精品中文字幕| 一本久久精品| kizo精华| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 精品久久久精品久久久| 人人妻人人看人人澡| av在线观看视频网站免费| 国产综合精华液| 国产精品久久久久久久久免| 久久久久久久久久久免费av| 精品久久国产蜜桃| 欧美xxxx性猛交bbbb| 久久亚洲国产成人精品v| 精品人妻视频免费看| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 婷婷色麻豆天堂久久| 视频中文字幕在线观看| 亚洲av成人精品一区久久| 久久久久久九九精品二区国产| 国产亚洲最大av| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 熟女电影av网| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 亚洲av二区三区四区| 日韩中文字幕视频在线看片 | 深夜a级毛片| 日日摸夜夜添夜夜爱| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 两个人的视频大全免费| 国精品久久久久久国模美| 中文字幕免费在线视频6| 大陆偷拍与自拍| 在线观看三级黄色| 一级av片app| 久久国产精品大桥未久av | 熟女人妻精品中文字幕| 黄色一级大片看看| 国产一区亚洲一区在线观看| 免费看日本二区| 国产男女超爽视频在线观看| 免费av中文字幕在线| 亚洲精品456在线播放app| 国产高清不卡午夜福利| 精品一区在线观看国产| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产精品久久久久久久电影| 激情 狠狠 欧美| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 一个人看的www免费观看视频| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产精品.久久久| 黑人高潮一二区| 久久精品国产亚洲网站| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲精品国产成人久久av| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 久久女婷五月综合色啪小说| 成人影院久久| 乱码一卡2卡4卡精品| 久久热精品热| 亚洲国产最新在线播放| 亚洲,欧美,日韩| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 成年人午夜在线观看视频| 国产伦理片在线播放av一区| 黑人高潮一二区| 韩国高清视频一区二区三区| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 亚洲内射少妇av| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 一级毛片我不卡| 国产在线男女| 高清日韩中文字幕在线| 国产一级毛片在线| 日韩欧美 国产精品| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 久久久精品94久久精品| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 两个人的视频大全免费| 2018国产大陆天天弄谢| 午夜福利高清视频| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产乱人视频| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 亚洲va在线va天堂va国产| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 老熟女久久久| 精品视频人人做人人爽| 制服丝袜香蕉在线| 久久久久久伊人网av| 视频中文字幕在线观看| 简卡轻食公司| 免费黄频网站在线观看国产| 色网站视频免费| 欧美日韩视频精品一区| 天堂8中文在线网| 成年免费大片在线观看| 人人妻人人看人人澡| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产一区亚洲一区在线观看| 一级毛片我不卡| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 黄色日韩在线| 亚洲美女视频黄频| 卡戴珊不雅视频在线播放| 99久久人妻综合| 中文字幕av成人在线电影| 免费观看无遮挡的男女| 人人妻人人看人人澡| 久久久久久伊人网av| 99热这里只有是精品在线观看| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲,一卡二卡三卡| av专区在线播放| 在线观看一区二区三区| 99热这里只有是精品在线观看| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产av国产精品国产| 在线观看一区二区三区激情| 亚洲怡红院男人天堂| 久久人人爽人人片av| 国产熟女欧美一区二区| 最近中文字幕高清免费大全6| 男人添女人高潮全过程视频| 高清日韩中文字幕在线| 国产爽快片一区二区三区| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 毛片一级片免费看久久久久| 高清视频免费观看一区二区| 成人特级av手机在线观看| 精华霜和精华液先用哪个| 精品久久久久久久末码| 九草在线视频观看| 欧美性感艳星| 赤兔流量卡办理| 美女国产视频在线观看| 香蕉精品网在线| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国产成人一区二区在线| 亚洲精品国产成人久久av| 最近最新中文字幕大全电影3| 街头女战士在线观看网站| 久久久色成人| 插逼视频在线观看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产午夜精品一二区理论片| 国产精品免费大片| 国产色爽女视频免费观看| 欧美日韩精品成人综合77777| 简卡轻食公司| av在线蜜桃| 好男人视频免费观看在线| 成年女人在线观看亚洲视频| 久久99热这里只有精品18| 亚洲精品第二区| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产伦精品一区二区三区四那| 日韩制服骚丝袜av| 最近2019中文字幕mv第一页| 人体艺术视频欧美日本| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 成人一区二区视频在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 久久精品国产亚洲网站| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 美女cb高潮喷水在线观看| 不卡视频在线观看欧美| 一级二级三级毛片免费看| 夜夜爽夜夜爽视频| 亚洲伊人久久精品综合| 99热这里只有是精品在线观看| 免费观看在线日韩| 日本爱情动作片www.在线观看| 成年女人在线观看亚洲视频| 国产一区亚洲一区在线观看| av在线app专区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 亚洲综合精品二区| 亚洲经典国产精华液单| 日韩成人av中文字幕在线观看| 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲精品色激情综合| 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲精品日韩av片在线观看| 性色av一级| 中文天堂在线官网| 国产精品嫩草影院av在线观看| 网址你懂的国产日韩在线| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲三级黄色毛片| 日韩三级伦理在线观看| 国产日韩欧美亚洲二区| 成人黄色视频免费在线看| 国产人妻一区二区三区在| 最近中文字幕2019免费版| 国产黄片视频在线免费观看| 亚洲久久久国产精品| 亚洲国产欧美人成| 青春草视频在线免费观看| 亚洲综合色惰| 亚洲不卡免费看| 少妇人妻一区二区三区视频| 美女高潮的动态| 国产爱豆传媒在线观看| 男人爽女人下面视频在线观看| 黑丝袜美女国产一区| av在线播放精品| 中文资源天堂在线| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产日韩欧美在线精品| 99久久中文字幕三级久久日本| 一级av片app| 亚洲精品亚洲一区二区| 51国产日韩欧美| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产欧美亚洲国产| av在线播放精品| 91狼人影院| 色哟哟·www| 国产一区有黄有色的免费视频| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产91av在线免费观看| 欧美日韩精品成人综合77777| 超碰97精品在线观看| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 亚洲国产色片| 男女啪啪激烈高潮av片| 免费在线观看成人毛片| 国产极品天堂在线| 天堂俺去俺来也www色官网| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 人妻少妇偷人精品九色| 久久精品人妻少妇| 人妻系列 视频| 男女边摸边吃奶| 亚洲欧美一区二区三区国产| freevideosex欧美| 性色av一级| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 少妇 在线观看| 在线观看av片永久免费下载| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 午夜福利网站1000一区二区三区| 欧美精品亚洲一区二区| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 精品一区二区三区视频在线| 22中文网久久字幕| 久久久久国产精品人妻一区二区| 久久久午夜欧美精品| 在线免费观看不下载黄p国产| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产精品一区www在线观看| av在线蜜桃| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 亚洲电影在线观看av| av国产久精品久网站免费入址| 亚洲成色77777| 国产毛片在线视频| 亚洲欧洲日产国产| 18+在线观看网站| 亚洲精品国产成人久久av| 另类亚洲欧美激情| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产在线男女| 欧美一区二区亚洲| 99re6热这里在线精品视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 黄色一级大片看看| 日韩欧美精品免费久久| av.在线天堂| 大香蕉97超碰在线| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲精品日本国产第一区| 三级国产精品欧美在线观看| 精品人妻熟女av久视频| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 久久99蜜桃精品久久| 久久久精品94久久精品| 免费看av在线观看网站| av天堂中文字幕网| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 精品亚洲乱码少妇综合久久| freevideosex欧美| 久久午夜福利片| 一级毛片aaaaaa免费看小| 亚洲国产av新网站| 97精品久久久久久久久久精品| 国产伦在线观看视频一区| 夜夜爽夜夜爽视频| 一区二区三区精品91| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产日韩欧美在线精品| av国产免费在线观看| 久久国内精品自在自线图片| 国产精品99久久久久久久久| 啦啦啦在线观看免费高清www| 天堂俺去俺来也www色官网| 大话2 男鬼变身卡| 91久久精品国产一区二区成人| 久久久精品免费免费高清| 亚洲国产av新网站| 成年免费大片在线观看| 国产成人aa在线观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 婷婷色麻豆天堂久久| 亚洲国产精品成人久久小说| 男人舔奶头视频| 麻豆乱淫一区二区| 欧美bdsm另类| 久久久a久久爽久久v久久| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 91午夜精品亚洲一区二区三区| 久久精品国产亚洲网站| 精品国产乱码久久久久久小说| av线在线观看网站| 久久久国产一区二区| 另类亚洲欧美激情| 国产av国产精品国产| 成人亚洲欧美一区二区av| 日本欧美国产在线视频| freevideosex欧美| 国产爽快片一区二区三区| 99久久中文字幕三级久久日本| 男人添女人高潮全过程视频| 99九九线精品视频在线观看视频| 五月开心婷婷网| 成人无遮挡网站| 天堂中文最新版在线下载| a 毛片基地| 久久99精品国语久久久| 国产精品一二三区在线看| 欧美xxⅹ黑人| 免费高清在线观看视频在线观看| 日韩中文字幕视频在线看片 | 亚洲真实伦在线观看| 亚洲人与动物交配视频| 免费观看av网站的网址| 久久韩国三级中文字幕| 欧美高清成人免费视频www| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 欧美高清性xxxxhd video| 中文欧美无线码| 亚洲精品第二区| 午夜福利网站1000一区二区三区| 精品午夜福利在线看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 高清av免费在线| 国产精品不卡视频一区二区| 欧美zozozo另类| 国产精品一区二区在线观看99| 国产精品熟女久久久久浪| 日日啪夜夜撸| 国产深夜福利视频在线观看| 啦啦啦在线观看免费高清www| 91精品一卡2卡3卡4卡| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 99视频精品全部免费 在线| 精品一区二区三区视频在线| 欧美日韩在线观看h| 久久久久久久久久久丰满| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 中国美白少妇内射xxxbb| 一二三四中文在线观看免费高清| 熟女人妻精品中文字幕| 五月伊人婷婷丁香| 一个人免费看片子| 青春草亚洲视频在线观看| 久久久久国产网址| 色婷婷久久久亚洲欧美| 欧美日韩在线观看h| 国产乱人偷精品视频| 九色成人免费人妻av| 欧美+日韩+精品| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 国产精品一区二区性色av| 色视频www国产| 亚洲国产精品专区欧美| 日韩欧美一区视频在线观看 | 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 97超视频在线观看视频| 中文资源天堂在线| 能在线免费看毛片的网站| 久久久亚洲精品成人影院| 婷婷色av中文字幕| 日韩大片免费观看网站| 日韩在线高清观看一区二区三区| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 中文天堂在线官网| 纯流量卡能插随身wifi吗| 在线观看三级黄色| 十八禁网站网址无遮挡 | 一级爰片在线观看| 国产精品精品国产色婷婷| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 女性被躁到高潮视频| 欧美日韩视频精品一区| 国产日韩欧美在线精品| 日韩成人av中文字幕在线观看| 久久久久久久久久久免费av| 成人无遮挡网站| 国产熟女欧美一区二区| 偷拍熟女少妇极品色| 五月天丁香电影| 日韩人妻高清精品专区| a级毛色黄片| 欧美bdsm另类| 精品亚洲成国产av| 久久久久久久久大av| 一个人免费看片子| 九色成人免费人妻av| av视频免费观看在线观看| 久久影院123| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲,一卡二卡三卡| 国产高清不卡午夜福利| 99久久精品国产国产毛片| 日韩欧美 国产精品| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产黄色免费在线视频| 久久精品久久久久久久性| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 免费黄色在线免费观看| 久久久久久久久久人人人人人人| 国模一区二区三区四区视频| 人体艺术视频欧美日本| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 精品国产露脸久久av麻豆| 日本欧美国产在线视频| 欧美xxⅹ黑人| 乱系列少妇在线播放| 99精国产麻豆久久婷婷| 女性被躁到高潮视频| 一区二区三区精品91| 国产v大片淫在线免费观看| 日韩伦理黄色片| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产精品av视频在线免费观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 欧美一级a爱片免费观看看| 麻豆国产97在线/欧美| 91狼人影院| 精品久久久久久久末码| 中文天堂在线官网| 99热全是精品| 欧美日韩精品成人综合77777| 国产色爽女视频免费观看| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 黄色一级大片看看| 久久午夜福利片| 1000部很黄的大片| a 毛片基地| 大话2 男鬼变身卡| 免费黄色在线免费观看| 最新中文字幕久久久久| 在线观看一区二区三区激情| 国产精品免费大片| 国产淫语在线视频| 激情 狠狠 欧美| 岛国毛片在线播放| 色婷婷久久久亚洲欧美| 欧美精品一区二区免费开放| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 熟妇人妻不卡中文字幕| 日韩中文字幕视频在线看片 | 亚洲色图综合在线观看| 久久久久久久久久久免费av| 亚洲精品国产av成人精品| 久久热精品热| 欧美极品一区二区三区四区| 777米奇影视久久| 亚洲国产精品999| 日韩强制内射视频| 黄色日韩在线| 狂野欧美激情性bbbbbb| 中文欧美无线码| 又爽又黄a免费视频| 伦理电影免费视频| 成人免费观看视频高清| av女优亚洲男人天堂| 精品人妻视频免费看| 观看免费一级毛片| 国产精品精品国产色婷婷| 99视频精品全部免费 在线| 韩国av在线不卡| 精品一区二区免费观看| 久久这里有精品视频免费| 久久6这里有精品| 边亲边吃奶的免费视频| 特大巨黑吊av在线直播| 观看av在线不卡| 国产一区有黄有色的免费视频| 深爱激情五月婷婷| 国产成人精品福利久久| 日本欧美国产在线视频| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 99热这里只有精品一区| 五月玫瑰六月丁香| 十八禁网站网址无遮挡 | 人妻系列 视频| 99久久精品热视频| 久久这里有精品视频免费| av国产精品久久久久影院|