利用分子標記建立雜交小麥親本分子指紋圖譜

李青燕+陳向東+董娜+李淦+茹振鋼

摘要：表達序列標簽-微衛(wèi)星DNA（EST-SSR）、序列標志位點（STS）是基于特異引物PCR技術的分子標記，具有共顯性遺傳、位點數(shù)量多、多態(tài)性高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，廣泛地應用于指紋圖譜構建、品種鑒定等方面。選用小麥低溫敏雄性不育系BNS和來自不同生態(tài)區(qū)的7個小麥品種（系），從192對引物中篩選出條帶清晰、多態(tài)性豐富、覆蓋小麥所有染色體的21對引物，在8個小麥品種（系）中擴增出72個等位位點，每個引物擴增出的位點數(shù)2～7個，平均3.43個；基因多樣性指數(shù)變幅為0.218 8～0.843 8，平均值為0.544 3；每個引物的多態(tài)性信息含量（PIC值）的變化范圍在0.194 8～0.824 7之間，平均值0.495 7。由結果可以看出，引物SWES33、CFE11、CFE188、CFE138擴增出來的帶型多，易于進行品種的鑒定和區(qū)分，其中引物SWES33和CFE11結合起來，可以將這8個小麥品種區(qū)分開，這為BNS型雜交小麥品種的鑒定工作提供了依據(jù)。

關鍵詞：小麥；BNS；分子標記；指紋圖譜

中圖分類號： S512.103.2 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）09-0032-03

小麥是我國主要的糧食作物之一。隨著社會的進步、人們生活水平的提高，對小麥的要求變得更高，不僅要求小麥高產，而且對小麥的品質也要求達到優(yōu)質。為了滿足人們的需求，育種家開始研究優(yōu)質、高產的小麥品種，通過雜交等方法使優(yōu)良的小麥基因集中到一起而培育高產優(yōu)質的小麥品種。但是，在新品種培育過程中，含有優(yōu)良基因的小麥親本的反復利用，使小麥的遺傳多樣性降低，新品種之間的相似性變高，對小麥新品種的鑒定帶來了很大的困難。對小麥品種鑒定和認證的傳統(tǒng)方法是采用形態(tài)學標記，但是該方法易受外界因素的影響，結果準確性較差，隨后發(fā)展的細胞學標記、生化標記也易受到各種因素的影響，直到分子標記的出現(xiàn)并成為一種廣泛應用的方法。分子標記的方法有微衛(wèi)星DNA（simple sequence repeats，SSR）、序列標志位點（sequence tagged site，STS）、表達序列標簽（experssed sequence tags，EST）、限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、特定序列擴增（sequence characterized amplified regions，SCAR）等。EST-SSR是從EST序列中開發(fā)的一種新型SSR標記。EST-SSR和STS是基于特異引物PCR技術的分子標記，具有共顯性遺傳、位點數(shù)量多、多態(tài)性高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點。目前，很多作物如大麥[1-2]、小麥[3]、葡萄[4]等的SSR標記已被用于遺傳作圖、遺傳多樣性、比較作圖、品種指紋圖譜等研究中。另外，還有一些學者利用分子標記構建農作物的分子身份證，用于農作物品種純度鑒定，例如聶新輝等利用40對引物完全區(qū)分開新陸早51份常規(guī)品種，并可用于構建供試品種的指紋圖譜[5]；陸徐忠等采用SSR標記與商品信息相結合的方法構建水稻品種身份證，有利于了解品種信息，方便品種的管理等[6]；顏靜宛等構建了137個水稻品種材料24個標記的分子身份證數(shù)據(jù)庫[7]；李偉忠等利用64對SSR引物對257份玉米自交系建立了分子身份證[8]；巫桂芬等利用相關序列擴增多態(tài)性（sequence related amplifedpolymorphism，SRAP）、簡單重復序列區(qū)間擴增（inter simple sequence nepeat，ISSR）、SSR標記繪制了154份黃麻品種基因組DNA分子指紋圖譜[9]。但是構建小麥分子身份證的研究很少，因此，本研究采用EST-SSR和STS分子標記，對部分BNS型雜交小麥親本進行遺傳多樣性分析，構建小麥分子身份證，有利于小麥品種的收集和保存，同時也為育種家親本選配提供有力依據(jù)，加速育種進程。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用來自不同地區(qū)的8份小麥材料，其種子均由河南科技學院小麥中心提供。包括黃淮地區(qū)的BNS、周麥18，西南地區(qū)的川麥107，西北地區(qū)的新春6號，長江流域的浙豐2號，東北地區(qū)的小冰麥33，國外的CL0433（智利）、FRA01（法國）。

1.2 DNA的提取

在小麥4～5葉期時取幼苗葉片，通過CTAB法提取其 DNA[10]。

1.3 SSR檢測

本試驗所用引物SWES[11]、CFE[12]和Xmag（http：//avena.pw.usda.gov）均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。對供試品種進行PCR擴增，PCR擴增產物經8%聚丙烯酰胺凝膠電泳（每次的點樣順序都是固定的，即品種順序固定），電泳結束后顯影。顯影的方法：（1）銀染：將其放入600 mL 蒸餾水+0.6 g硝酸銀溶液中浸泡15 min；（2）水洗：迅速放入蒸餾水中沖洗；（3）顯影：放入500 mL蒸餾水+8 g NaOH+0.3 g Na2CO3+4 mL甲醛溶液中，直至出現(xiàn)帶型即可。拍照并記錄位點數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

帶型的記錄參考顏靜宛等的方法[7]，根據(jù)帶型（基因型）：記錄每1個引物在8個品種（系）中擴增的帶型，相同帶型（相同的基因型） 代號相同，不同帶型（不同的基因型），依次記作 1，2，3，…，n。

利用PowerMarker V3.25 軟件計算不同引物的基因多樣性指數(shù)及多態(tài)信息含量（PIC值）。

1.5 小麥分子身份證的初步構建

根據(jù)帶型記錄電泳結果，8個小麥品種以BNS作為對照品種，由對照品種擴增出的帶型標記為1，其他品種擴增出的帶型，與對照品種相同的同樣標記為1，不同的標記為2，與帶型2不同的標記為3，依此類推。得到8個小麥品種由21對引物擴增出的基因帶型碼后，按照染色體1A、1B、1D、2A、2B、2D等順序依次排列，建立小麥的分子身份證。

2 結果與分析

2.1 EST-SSR和STS分子標記的多態(tài)性分析

從192對引物中篩選出條帶清晰、多態(tài)性豐富的21對引物。這些引物在8個小麥品種（系）中擴增出72個等位位點，每個引物擴增出的位點數(shù)2～7個，平均3.43個；基因多樣性指數(shù)變幅為0.218 8～0.843 8，平均值為0.544 3，每個引物的多態(tài)性信息含量（PIC值）的變化范圍在0.194 8～0.824 7 之間，平均值0.495 7（表1）。在這21對引物中，有6對引物檢測到2個等位變異位點，有6對引物檢測到3個等位變異位點，有5對引物檢測到4個等位變異位點，有3對引物檢測到5個等位變異位點，有1對引物檢測到7個等位變異位點。

2.2 基于EST-SSR和STS分子標記構建小麥品種的分子身份證

以BNS作為對照種，21對引物對BNS擴增出來的帶型都標記為1，獲得這些引物對其他品種擴增的帶型碼。以引物SWES131（圖1）為例，第1條泳道BNS擴增出的帶型標記為1；第2條泳道周麥18擴增出的帶型與BNS的帶型不同，標記為2；第3、4、5、8條泳道分別是川麥107、新春6號、浙豐2號、小冰麥33擴增出的帶型，與周麥18擴增的帶型相同，同樣標記為2；第6、7條泳道分別是CL0433、財富麥（FRA01）擴增的帶型，與前2種帶型都不同，標記為3。依此類推，得到引物SWES131在8個小麥品種（系）中擴增的帶型碼是12222332，然后獲得21對引物在8個小麥品種（系）中擴增的帶型碼標記。同一品種在不同引物中擴增的帶型碼標記按照引物所在染色體1A、1B、1D、2A、2B、2D等順序依次排列，獲得1組由21個數(shù)字組成的分子身份證號，如川麥107的分子身份證號是：212222113331112121233，該分子身份證號的第1位數(shù)字2表示川麥107在引物SWES131上擴增的帶型標記為2，第2位數(shù)字1表示在引物CFE150上擴增的帶型標記為1（即與對照種的帶型碼相同），第3位數(shù)字2表示在引物CFE136上擴增的帶型標記為2，后面的依此類推，獲得8個小麥品種（系）的分子身份證號（表2）。

3 討論

分子ID（即分子身份證） 是把品種的特征數(shù)字化，即每個品種都有屬于自己的1套字符串形式的代碼，從而可以簡單明了地區(qū)分品種。構建小麥分子身份證，就需要選擇具有條帶清晰、多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性好等特點的引物，并選擇合適的分子標記方法。隨著分子標記的不斷發(fā)展，農作物在分子水平上的研究越來越深入[13-14]，但是由于小麥是異源六倍體，分子水平上的研究相對落后于水稻、玉米等農作物，其完整的遺傳圖譜尚未完成。雖然小麥的分子標記很多，但是它們在染色體上的分布不均勻，要想構建完整的遺傳圖譜需要不斷地開發(fā)新的分子標記，采用不同的分子標記相結合的方法構建。本研究利用覆蓋小麥整個基因組的19對EST-SSRs引物和2對STS引物，以小麥低溫敏雄性不育系BNS為對照種，構建雜交小麥親本分子身份證。從結果中可以看出，引物SWES33、CFE11、CFE188、CFE138擴增出來的帶型多，易于品種的鑒定和區(qū)分，其中引物SWES33和CFE11結合起來，可以將這8個小麥品種區(qū)分開，這為BNS型雜交小麥品種的鑒定工作提供了依據(jù)，有利于區(qū)分不同的品種，辨別假冒種子，防止假冒種子流入市場，維護消費者權益。

本研究中，記錄帶型數(shù)據(jù)主要是依靠人工對比獲得，可能結果中存在一定的誤差。隨著科技的迅速發(fā)展，擴增產物可以借助基因分析儀進行直接讀取[15-16]，構建更為精確的結果，但是該方法成本昂貴。另外，本研究只是針對8個代表性的雜交小麥親本品種進行初步的探討，以后還須對更多的雜交小麥親本構建分子身份證，并結合田間農藝性狀、商品信息等，使小麥品種有完善的數(shù)據(jù)庫，為品種區(qū)分提供更為便利的方法，也將為雜交新品種的選育提供理論基礎，推進雜交小麥育種的進程。

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