響應(yīng)面法優(yōu)化芒果蜂蜜果酒發(fā)酵工藝的研究

尚遠(yuǎn)宏，田金鳳

（攀枝花學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，四川 攀枝花 617000）

果酒是以水果為原料，經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵等多道工序調(diào)配而成的含有水果風(fēng)味和一定酒精度的飲品，基本保留水果營(yíng)養(yǎng)成分，易于人體吸收[1]。經(jīng)常飲用果酒能夠改善心腦血管功能，促進(jìn)機(jī)體新陳代謝及血液循環(huán)，預(yù)防腦血管、動(dòng)脈硬化和高血壓等疾病[2-3]。

芒果（Mangifera indica）為漆樹(shù)科芒果屬的多年生植物[4]，其果實(shí)素有熱帶果王之稱[5-8]。凱特芒果種植占攀枝花市芒果種植總面積的70%[9]，其果實(shí)含有大量的維生素、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、糖類等對(duì)人體有益的營(yíng)養(yǎng)成分。然而，由于種植面積的擴(kuò)大和產(chǎn)量的增長(zhǎng)，加之芒果自身不易保藏，有明顯的季節(jié)性特征[10]，產(chǎn)后損失嚴(yán)重，出現(xiàn)鮮果供過(guò)于求的現(xiàn)象，影響果農(nóng)增收[11]。野拔子（Elsholtzia rugulosaHemsl.）蜂蜜被稱為“金牌蜜”，屬于天然營(yíng)養(yǎng)佳品，受到了很多人的青睞，為蜜中上品[12]，分布于云貴川，花期在10月下旬至12月上旬，主要開(kāi)花流蜜期30～40 d[13]。野拔子蜂蜜營(yíng)養(yǎng)豐富，含有氨基酸、蛋白質(zhì)、花粉、維生素、微量元素等多種活性物質(zhì)，食用價(jià)值高[12]。同時(shí)，蜂蜜在果酒中可替代白砂糖的碳源補(bǔ)充、調(diào)節(jié)糖度和減少褐變反應(yīng)。因此，研制的果酒結(jié)合芒果獨(dú)特的風(fēng)味特性和野拔子蜂蜜較高的食療價(jià)值的特點(diǎn)，能解決攀枝花芒果的銷(xiāo)售問(wèn)題，發(fā)展前景廣闊。

芒果發(fā)酵酒的研究報(bào)道眾多[14-18]，但是芒果蜂蜜果酒的研發(fā)卻鮮有報(bào)道。本研究充分利用攀枝花本地芒果和野拔子資源豐富的優(yōu)勢(shì)，以凱特芒果和野拔子蜂蜜作為原料制備芒果蜂蜜果酒。采用單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)研究凱特芒果野拔子蜂蜜果酒發(fā)酵工藝，以期得到既美味可口又營(yíng)養(yǎng)豐富的果酒，滿足人們對(duì)食品要求提高的消費(fèi)觀念。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

果膠酶（酶活10 000 U/g）：山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；檸檬酸（食品級(jí)）：濰坊英軒實(shí)業(yè)有限公司；安琪專用葡萄酒酵母：安琪酵母股份有限公司；凱特芒果：市售；野拔子蜂蜜：百草嶺蜂業(yè)責(zé)任有限公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BDV-325414167電子天平：捷久計(jì)量衡器（上海）有限公司；PHS-550數(shù)顯酸度計(jì)：杭州陸恒生物科技有限公司；A115038糖度計(jì)：上海邦西儀器科技有限公司；0.1分度酒精計(jì)：武強(qiáng)縣精創(chuàng)儀器儀表廠；ZTS-1P烘箱：昆山臺(tái)順測(cè)試科技有限公司；LRH-250-2振蕩培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；ZDHW數(shù)顯恒溫水浴鍋：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；PHX智能生化恒溫培養(yǎng)箱：寧波萊福科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 芒果蜂蜜果酒的加工工藝流程及操作要點(diǎn)

原料預(yù)處理：選用無(wú)腐爛、病蟲(chóng)害的成熟度好的芒果，清洗，瀝干后去皮去核。

打漿出汁：去皮去核后的芒果榨汁，添加果膠酶（4 g/L）和纖維素酶（0.4 g/L），40 ℃酶解90 min，90 ℃滅酶3 min[11]，冷卻至室溫，過(guò)濾后得到原汁。

調(diào)整成分：用適量野拔子蜂蜜調(diào)整初始糖度為20%，用檸檬酸調(diào)整pH值為3.6，加入50 mg/L偏重亞硫酸鉀以殺菌并提高穩(wěn)定性，使果酒醇正香濃[19]。

酵母活化：將安琪酵母加入10%（V/V）的野拔子蜂蜜溶液中，混合均勻，置于35 ℃的恒溫水浴活化60 min，待觀察其產(chǎn)氣泡豐富時(shí)，即可作為菌種使用。

發(fā)酵：果汁在無(wú)菌條件下，接種活化后的0.10%酵母菌，然后在24 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵10 d。

過(guò)濾澄清：虹吸上層酒液至無(wú)菌玻璃容器中，于冰箱冷藏澄清1 d，過(guò)濾，得到澄清有光澤的果酒。

調(diào)配：在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生了酸，為使酸度適當(dāng)降低，澄清處理過(guò)的芒果蜂蜜果酒可用酒石酸鉀鈉（或碳酸鈉）適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)[11]，65 ℃巴氏殺菌30 min[20]，得到酒味協(xié)調(diào)，風(fēng)味更加突出的果酒。

1.3.2 芒果蜂蜜果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

分別調(diào)整酵母添加量（0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%）、發(fā)酵溫度（20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃）、初始pH值（3.2、3.4、3.6、3.8、4.0）、發(fā)酵時(shí)間（6 d、8 d、10 d、12 d、14 d）、初始糖度（16%、18%、20%、22%、24%），按1.3.1項(xiàng)下的操作要點(diǎn)，進(jìn)行單因素發(fā)酵試驗(yàn)，以酒精度及感官評(píng)分為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，確定各單因素對(duì)芒果蜂蜜果酒的影響。

1.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化芒果蜂蜜果酒發(fā)酵工藝

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

參考相關(guān)文獻(xiàn)[11，14]，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇果漿的初始pH值為3.6和發(fā)酵時(shí)間為10 d，利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)酵母添加量（A），初始糖度（B）及發(fā)酵溫度（C）3個(gè)主要因素進(jìn)行優(yōu)化，以酒精度（Y1）和感官評(píng)分（Y2）為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表1。

1.3.4 感官評(píng)分

參照國(guó)標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》對(duì)芒果蜂蜜果酒進(jìn)行感官評(píng)分[21]，選10名食品專業(yè)人員分別對(duì)芒果蜂蜜果酒產(chǎn)品的色澤、香氣、澄清度、滋味、典型性進(jìn)行感官評(píng)分，滿分100分，具體感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 果酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of wine

1.3.5 芒果蜂蜜果酒質(zhì)量指標(biāo)的檢測(cè)

酒精度：參照國(guó)標(biāo)GB 5009.225—2016《酒中乙醇濃度的測(cè)定》中的酒精計(jì)法[22]；糖度、酸度：分別采用糖度計(jì)和酸度儀進(jìn)行測(cè)定；總酸（以酒石酸計(jì)）：電位滴定法[21]；總糖（以葡萄糖計(jì)）測(cè)定：直接滴定法[21]。細(xì)菌總數(shù)、大腸桿菌的測(cè)定：參照國(guó)標(biāo)GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》[23]；致病菌的測(cè)定：參照國(guó)標(biāo)GB 29921—2013《食品中致病菌限量》[24]。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。采用Origin 7.5作圖，采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 酵母添加量對(duì)芒果蜂蜜果酒的影響

圖1 酵母添加量對(duì)芒果蜂蜜酒感官評(píng)分和酒精度的影響Fig.1 Effect of yeast inoculum on sensory score and alcohol content of mango and honey wine

由圖1可知，隨著酵母接種量的增加，酒精度和感官評(píng)分先快速升高后迅速降低，當(dāng)選擇0.04%作為酵母添加量時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)生的果酒酒精度低，感官評(píng)分較低，說(shuō)明酵母添加量過(guò)少，發(fā)酵速度慢，發(fā)酵不徹底；當(dāng)接種量為0.10%時(shí)，芒果蜂蜜酒酒精度出現(xiàn)最大值為（11.3±0.2）%vol，但再繼續(xù)增加酵母接種量，出現(xiàn)果漿中糖分過(guò)多而促進(jìn)了酵母菌的生長(zhǎng)繁殖，反而不利于發(fā)酵，酒精度隨之下降，同時(shí)，接種量為0.06%時(shí)，果酒感官評(píng)分達(dá)到最大值為（79.1±0.5）分，之后繼續(xù)增加酵母接種量，酒體含糖下降，酸度升高，可能是接種密度過(guò)大，導(dǎo)致發(fā)酵液中溶氧不足，從而抑制了酵母的生長(zhǎng)，不利于香氣物質(zhì)的形成，口感變差。因此，考慮果酒的口感，選擇最適酵母添加量為0.06%。

2.1.2 初始糖度對(duì)芒果蜂蜜果酒的影響

圖2 初始糖度對(duì)芒果蜂蜜果酒感官評(píng)分和酒精度的影響Fig.2 Effect of initial sugar content on sensory score and alcohol content of mango and honey wine

由圖2可知，當(dāng)初始糖度為16%～18%時(shí)，酒中酒精度較低，醇香味較淡，使得果酒的典型性和滋味不突出，對(duì)口感有著消極影響，導(dǎo)致發(fā)酵果酒風(fēng)味不佳，表明此時(shí)糖度不足；在初始糖度為20%時(shí)，酒樣中酒精度和感官評(píng)分高，分別為（11.2±0.2）%vol和（76.2±0.4）分，果酒風(fēng)味更好，表明此時(shí)糖度對(duì)發(fā)酵果酒比較適宜；當(dāng)初始糖度為＞22%之后，發(fā)酵的酒樣中酒精度偏高，果酒口感偏甜，感官評(píng)分降低，說(shuō)明此時(shí)的初始糖度過(guò)高。因此，選擇最適初始糖度為20%。

2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)芒果蜂蜜果酒的影響

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)芒果蜂蜜酒感官評(píng)分和酒精度的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on sensory score and alcohol content of mango and honey wine

由圖3可知，酒精度和感官評(píng)分隨發(fā)酵溫度在20～26 ℃范圍的升高而增加，當(dāng)發(fā)酵溫度在26 ℃時(shí)，果酒酒精度和感官評(píng)分達(dá)到最大值，分別為（12.4±0.1）%vol和（78.8±0.3）分；而后隨發(fā)酵溫度＞26 ℃之后，溫度過(guò)高使酵母菌生長(zhǎng)速度較快，致酵母衰老加速（活性受到抑制），不能在發(fā)酵后期將發(fā)酵液中的糖有效轉(zhuǎn)化成酒精，會(huì)影響產(chǎn)酒精量，酒精度由此開(kāi)始緩慢下降，且酒體粗糙，酒質(zhì)容易氧化，口感變差，感官評(píng)分降低。因此，選擇最適發(fā)酵溫度為26 ℃。

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)芒果蜂蜜果酒的影響

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)芒果蜂蜜酒感官評(píng)分和酒精度的影響Fig.4 Effect of fermentation time on sensory score and alcohol content of mango and honey wine

由圖4可知，當(dāng)經(jīng)過(guò)6～8 d發(fā)酵時(shí)，酒樣中酒精度較低，感官評(píng)分較低，說(shuō)明發(fā)酵時(shí)間較短，發(fā)酵過(guò)程不徹底；對(duì)于發(fā)酵10 d時(shí)，果酒酒樣中的酒精度和感官評(píng)分繼續(xù)上升趨勢(shì)，表明隨著發(fā)酵時(shí)間的增加果酒品質(zhì)繼續(xù)提高；當(dāng)發(fā)酵12～14 d時(shí)，感官評(píng)分降低，酒精度偏高，可能由于出現(xiàn)輕微的酸敗現(xiàn)象（抑制酵母的酒精產(chǎn)生能力并將部分酒精轉(zhuǎn)化為酸），酵母菌進(jìn)入衰減階段，菌體沉降死亡，酒體中溶入菌體內(nèi)容物而影響感官評(píng)價(jià)值。因此，選擇最適發(fā)酵時(shí)間為10 d。同時(shí)，考慮到發(fā)酵時(shí)間對(duì)整個(gè)發(fā)酵影響并不明顯，故而在響應(yīng)面試驗(yàn)中發(fā)酵時(shí)間不作為考察因子進(jìn)行考慮。

2.1.5 初始pH值對(duì)芒果蜂蜜果酒的影響

圖5 初始pH值對(duì)芒果蜂蜜酒感官評(píng)分和酒精度的影響Fig.5 Effect of initial pH value on sensory score and alcohol content of mango and honey wine

由圖5可知，發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵的感官評(píng)分影響不大，當(dāng)pH值為3.2～3.4 時(shí)，果酒酒精度較低，感官評(píng)分低，口感風(fēng)味較差，說(shuō)明pH值過(guò)低導(dǎo)致酵母的生長(zhǎng)受到了抑制，發(fā)酵速度慢，不利于果酒風(fēng)味物質(zhì)的形成。當(dāng)pH值為3.6時(shí)，發(fā)酵生產(chǎn)的果酒酒精度較高，感官評(píng)分最高，分別為（10.6±0.2）%vol和（77.5±0.5）分，說(shuō)明此pH值下發(fā)酵的果酒風(fēng)味更好，酵母生長(zhǎng)不受抑制。當(dāng)pH值為4.0時(shí)，酒精度降低，感官評(píng)分較低，說(shuō)明pH值過(guò)高，可能出現(xiàn)雜菌生長(zhǎng)較快，影響酵母的正常生長(zhǎng)代謝。由此可知，選擇最適初始pH值為3.6。同時(shí)，考慮到初始pH值對(duì)整個(gè)發(fā)酵影響并不明顯，故而在響應(yīng)面試驗(yàn)中初始pH值不作為考察因子進(jìn)行考慮。

2.2 響應(yīng)面法分析結(jié)果

以酵母添加量（A），初始糖度（B）及發(fā)酵溫度（C）為影響因素，以酒精度（Y1）和感官評(píng)分（Y2）為響應(yīng)值，利用Design Expert 8.06響應(yīng)面軟件的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與分析見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

對(duì)獲得的數(shù)據(jù)利用分析軟件Design-Expert進(jìn)行多元回歸方程擬合，得酒精度（Y1）和感官評(píng)分（Y2）二次多項(xiàng)回歸模型方程為：

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of Box-Behnken experiments design

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4方差分析結(jié)果可知，以響應(yīng)曲面法建立的二次回歸模型方程，其2個(gè)模型均極顯著（P＜0.01），且失擬項(xiàng)均不顯著（P＞0.05），說(shuō)明此2個(gè)模型是可靠的。酒精度和感官評(píng)分的校正決定系數(shù)R2為97.40%和99.44%，說(shuō)明該模型的擬合程度較好，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化建立的芒果蜂蜜發(fā)酵工藝回歸方程（模型）是有效的。以酒精度為響應(yīng)值時(shí)，一次項(xiàng)C和交互項(xiàng)AB影響顯著（P＜0.05），A、A2、B2、C2影響極顯著（P＜0.01），由F檢驗(yàn)可以得到因子貢獻(xiàn)率為A＞C＞B；以感官評(píng)分為響應(yīng)值時(shí)，一次項(xiàng)C、交互項(xiàng)AB、AC、BC和二次項(xiàng)A2、B2、C2影響極顯著（P＜0.01），由F檢驗(yàn)可以得到因子貢獻(xiàn)率為C＞A＞B。

各因素對(duì)指標(biāo)影響的響應(yīng)面及等高線結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，在Y1模型中BC、AC交互作用不顯著，因此只對(duì)AB交互作用進(jìn)行分析，保持發(fā)酵溫度不變時(shí)，酒樣中酒精度隨著初始糖度與酵母量的增加呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，且等高線呈現(xiàn)橢圓形，存在極值，曲面較為陡峭，交互作用顯著。在Y2模型中等高線最小橢圓的中心點(diǎn)為響應(yīng)面的最高點(diǎn)，即感官評(píng)分最高，等高線的形狀為橢圓形，曲面傾斜度越高，坡度越陡，各因素對(duì)感官評(píng)分的影響越顯著，說(shuō)明AC、BC、AB交互作用顯著。

應(yīng)用響應(yīng)面尋優(yōu)分析方法對(duì)回歸模型進(jìn)行分析，選擇酒精度和感官評(píng)分的重要性均為5，分別選擇酒精度和感官評(píng)分的最大響應(yīng)值，尋找最優(yōu)響應(yīng)結(jié)果為酵母添加量0.06%，初始糖度19.99%，發(fā)酵溫度25.96 ℃。此優(yōu)化條件下發(fā)酵后果酒酒精度預(yù)測(cè)值為11.23%vol，感官評(píng)分預(yù)測(cè)值為83.37分。為驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性，考慮實(shí)際的操作情況，將發(fā)酵工藝參數(shù)調(diào)整為酵母添加量0.06%，初始糖度20%，發(fā)酵溫度26 ℃，在此發(fā)酵工藝條件下，進(jìn)行6次驗(yàn)證試驗(yàn)，芒果蜂蜜果酒的感官評(píng)分實(shí)際值為83.20分，酒精度實(shí)際值為11.25%vol，結(jié)果與預(yù)測(cè)值相差微小，證明該回歸模型可靠，可以應(yīng)用響應(yīng)面，優(yōu)化芒果蜂蜜果酒發(fā)酵工藝可行。

圖6 初始糖度、酵母添加量和發(fā)酵溫度交互作用影響芒果蜂蜜酒感官評(píng)分和酒精度的響應(yīng)面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of interaction between initial sugar,yeast inoculum and fermentation temperature on sensory score and alcohol content of mango and honey wine

2.3 芒果蜂蜜果酒的質(zhì)量指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

采用最佳發(fā)酵條件得到芒果蜂蜜果酒，其酒精度為11.0%vol，總糖（以葡萄糖計(jì)）為12.3 g/L，總酸（以酒石酸計(jì)）為6.2 g/L；細(xì)菌總數(shù)（21 CFU/mL）≤50 CFU/mL，大腸桿菌（1 MPN/100 mL）≤3 MPN/100 mL，致病菌未檢出。結(jié)果表明該芒果蜂蜜果酒的理化指標(biāo)及微生物指標(biāo)均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[25]。

3 結(jié)論

以凱特芒果和野拔子蜂蜜為原料，通過(guò)單因素試驗(yàn)，結(jié)合響應(yīng)面分析法優(yōu)化芒果蜂蜜果酒釀造工藝條件，得到最佳優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)為酵母添加量為0.06%，初始糖度為20%，發(fā)酵溫度為26 ℃。在此發(fā)酵工藝條件下，得到芒果蜂蜜果酒的感官評(píng)分為83.0分，酒精度為11.0%vol，其芒果蜂蜜酒呈橙黃色，酒體澄清透明，酒香濃郁，口感柔和，帶有淡淡的芒果風(fēng)味。該研究不僅開(kāi)發(fā)一款營(yíng)養(yǎng)豐富的休閑果酒，也得到較優(yōu)的芒果蜂蜜果酒發(fā)酵工藝參數(shù)，為其生產(chǎn)化提供了一定參考意義。