糖肝康對糖尿病急性肝損傷大鼠肝臟結(jié)構和PON表達的影響

錢衛(wèi)斌 錢秋海 蔡欣蕊 張新穎 王營營

·短篇論著·

糖肝康對糖尿病急性肝損傷大鼠肝臟結(jié)構和PON表達的影響

錢衛(wèi)斌 錢秋海 蔡欣蕊 張新穎 王營營

目的觀察中藥糖肝康對糖尿病急性肝損傷模型大鼠肝臟病理結(jié)構和對氧磷酶(PON)表達的影響。方法選擇健康雄性Wistar大鼠100只，其中90只大鼠采用鏈脲佐菌素(STZ)誘發(fā)糖尿病模型，選取造模成功的50只采用隨機數(shù)字法分為5組，每組10只：模型對照組，護肝寧對照組，糖肝康小、中、大劑量組。另設10只大鼠為正常對照組。其中，模型對照組和正常對照組給予生理鹽水10 ml/kg ig；護肝寧對照組給予護肝寧混懸液0.04 g/ml ig；糖肝康小、中、大劑量組分別給予濃度為1 g/ml、2 g/ml、4 g/ml的糖肝康ig。給藥觀察12周后，除正常對照組外，其余各組均分別給予硫代乙酰胺(TAA)200 mg/kg腹腔注射，以誘發(fā)糖尿病大鼠急性肝損傷，24 h內(nèi)麻醉大鼠并開腹取出肝臟，光鏡觀察肝臟病理結(jié)構及免疫組化法觀察各組大鼠肝臟組織PON的表達。結(jié)果給予TAA后，模型對照組大鼠的肝組織結(jié)構改變，部分肝細胞腫脹，有團塊再生，脂肪變性壞死，并可見肝小葉結(jié)構不清，匯管區(qū)有大量成纖維細胞、纖維細胞和膠原纖維。經(jīng)糖肝康治療后，上述異常得到改善。模型對照組肝臟組織PON表達較正常對照組顯著降低(F=3.130，Plt;0.01)；糖肝康小、中、大劑量組及護肝寧對照組與模型對照組相比，PON表達升高(F=3.130，Plt;0.05)。結(jié)論糖肝康對TAA所致急性肝損傷病理改變可起到一定的保護作用，其機制可能是通過升高PON的表達水平。

糖肝康；糖尿病；肝損傷

糖尿病肝損傷是指繼發(fā)于糖尿病的肝臟組織學和功能變化的病變，是以肝功能損害為主要臨床癥狀的慢性并發(fā)癥。糖尿病肝損傷嚴重影響糖尿病的治療及患者的身體健康。炎性反應、自由基產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化均可破壞肝細胞結(jié)構和功能，在肝病的發(fā)生和發(fā)展中起著十分重要的作用[1]。臨床上多種原因可引起糖尿病肝損傷，以糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病最為常見，據(jù)報道2型糖尿病患者并發(fā)脂肪肝的患病率為21%～78%，平均約50%[2-3]。糖尿病肝損害最初可發(fā)生酶學的改變，或出現(xiàn)脂肪肝，繼而可引起肝纖維化，最終可導致肝功能衰竭壞死[4]。錢秋海根據(jù)多年臨床經(jīng)驗，總結(jié)出糖尿病肝損傷的基本病機是“脾氣虧虛、肝失條達、瘀毒互結(jié)”，并據(jù)此研制出具有健脾補腎、清熱化濕、活血通絡之效的糖肝康方，臨床應用療效顯著[5-8]。本實驗采用鏈脲佐菌素(STZ)+硫代乙酰胺(TAA)造成糖尿病急性藥物性肝損傷模型大鼠，觀察和驗證糖肝康對肝臟組織病理結(jié)構及對氧磷酶(PON)免疫組化表達水平的影響，以探討糖肝康的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與飼料 健康雄性Wistar大鼠100只，體重(200±20)g，由山東中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(魯)20110003。常規(guī)飼料由山東中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

1.1.2 藥品與試劑 治療組用藥：糖肝康顆粒：由山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥劑科加工而成，由黃芪(內(nèi)蒙古)、白術(浙江)、柴胡(山西)、黃芩(內(nèi)蒙古)、茵陳(陜西)、炒梔子(江西)、大黃(甘肅)、白芍(安徽)、當歸(甘肅)、丹參(山東)、鱉甲(湖北)、羚羊角粉(安徽)、荷葉(安徽)、山楂(山東)、甘草(新疆)等組成，實驗時將糖肝康顆粒水煎煮開后制成糖肝康煎劑，濃度為1 g/ml、2 g/ml及4 g/ml。對照組用藥：護肝寧：片劑，0.35 g/片，由貴州信邦制藥股份有限公司生產(chǎn)，批準文號：國藥準字Z20033118，產(chǎn)品批號：20120303041，濃度約0.04 g/ml。

實驗試劑：STZ購自美國Sigma公司，批號：020106；TAA購自上海展云化工有限公司，批號：1106017；一抗Anti-PON購自北京博奧森生物技術有限公司，批號bs-1375R，為多克隆抗體；SP-9000 HistostainTM-Plus kits免疫組化染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，批號20090921；濃縮型DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，批號20091021。

1.1.3 實驗儀器 美國強生血糖分析儀，由武漢綠森林科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)；Reichert-Jung超薄切片機，由山東省醫(yī)學科學院提供；LEICA ASP600全自動生物脫水機，由LEICA公司生產(chǎn)；LEICA ASP2135病理切片機，批號：19990321B；OLYMPUS CX51顯微鏡；醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)，型號HPIAS1000，由同濟醫(yī)科大學千屏影像工程公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 造模方法 選擇Wistar大鼠90只，給予普通飼料，適應性飼養(yǎng)3 d后，禁食12 h，按30 mg/kg體重的劑量腹腔內(nèi)注射新鮮配制的2%STZ(檸檬酸緩沖液，pH4.2)，72 h后尾靜脈取血測血糖，血糖高于16.7 mmol/L者確定為糖尿病模型制作成功。選取50只造模成功大鼠進入實驗。

1.2.2 分組與給藥 將50只入選大鼠采用隨機法分為5組，每組50只：模型對照組，護肝寧對照組，糖肝康小、中、大劑量組。另取10只正常大鼠作為正常對照組。其中，模型對照組和正常對照組給予無菌0.9%生理鹽水ig；護肝寧對照組給予護肝寧混懸液0.04 g/ml ig；糖肝康小、中、大劑量組分別給予濃度為1 g/ml、2 g/ml、4 g/ml的糖肝康ig。各組給藥容積均為10 ml/kg，均每日灌胃1次，正常飼料飲食。連續(xù)給藥12周后，禁食8 h，以無菌0.9%生理鹽水配制劑量不等的TAA溶液[9]。除正常對照組外，其余各組分別給予TAA 200 mg/kg腹腔注射，制成糖尿病急性肝損傷模型。

1.2.3 標本采集 腹腔注射TAA，24 h內(nèi)斷尾取血用強生血糖分析儀檢測空腹血糖(取血前禁食8 h)，然后用戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，開腹取出肝臟，用生理鹽水沖洗后，入中性福爾馬林液4℃固定24 h，脫水后常規(guī)石蠟包埋，制成蠟塊，切成4 μm厚的連續(xù)切片，貼于預先涂有鉻釩明膠的載玻片上，一部分備測大鼠肝臟病理結(jié)構，另一部分引用免疫組化方法檢測模型大鼠肝臟組織中PON表達的影響。

1.2.4 鏡下觀察 病理標本的制作：切片后HE染色，光鏡下觀察肝臟病理結(jié)構變化。

1.2.5 免疫組化檢測 標本0.01 mol/L PBS沖洗5 min×3次；3%雙氧水孵育10 min；滴加試劑A(封閉用正常山羊血清工作液)37℃孵育20 min，傾去，不洗；滴加1∶200稀釋的一抗，5℃過夜，陰性對照用PBS液代替一抗；0.01 mol/L PBS沖洗5 min×3次；滴加試劑B(生物素化二抗工作液)37℃孵育20 min，0.01 mol/L PBS沖洗5 min×3次；滴加試劑C(辣根酶標記鏈酶卵白素工作液)37℃孵育20 min，0.01 mol/L PBS沖洗5 min×3次；DAB顯色劑顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，顯色充分后自來水終止反應；蘇木素復染，無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片；顯微鏡下取10×10視野下觀察標本，照相。

每張切片于鏡下隨機選取5個視野觀察肝臟陽性產(chǎn)物的分布、染色情況。黃光源下為淺黃色背景，標記陽性產(chǎn)物在細胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒著色。對每例切片，采取半定量積分法判斷結(jié)果：A(按切片中陽性細胞占切片中總細胞數(shù)的比例評分)：未見陽性細胞為0分，陽性細胞占整個視野細胞數(shù)的1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分；B(按切片中陽性細胞顯色有無及深淺評分)：無顯色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。每例積分=A×B，兩者積分相乘結(jié)果作為陽性表達強度。

2 結(jié)果

2.1 糖肝康對TAA所致急性肝損傷模型大鼠肝臟光鏡病理結(jié)構的影響 肝組織大體標本觀察發(fā)現(xiàn)，正常對照組肉眼觀察顯示肝臟表面光滑，未見滲出物，未見結(jié)節(jié)，質(zhì)軟，暗紅色。模型對照組及糖肝康治療組和護肝寧對照組肉眼觀察顯示肝臟表面呈結(jié)節(jié)狀，質(zhì)硬，邊緣銳利，結(jié)節(jié)間薄層纖維組織包繞。

光鏡下觀察顯示：正常對照組肝細胞結(jié)構正常，無炎性細胞浸潤，無膠原纖維增生。而造模后，模型對照組部分肝細胞腫脹，有團塊再生，脂肪變性壞死，并可見肝小葉結(jié)構不清，匯管區(qū)有大量成纖維細胞、纖維細胞和膠原纖維。糖肝康中、大劑量組肝細胞脂變和纖維增生程度較輕，肝細胞再生活躍。糖肝康小劑量組纖維化程度和護肝寧對照組相當，提示糖肝康中、大劑量組優(yōu)于護肝寧對照組(圖1，封3)。

2.2 糖肝康對TAA所致急性肝損傷模型大鼠肝臟PON免疫組化表達的影響 免疫組化結(jié)果及陽性評分結(jié)果顯示：肝臟血管周圍細胞質(zhì)內(nèi)有PON表達，其表達呈棕黃色或棕褐色顆粒。各組PON表達程度均不相同。造模后，與正常對照組相比，模型對照組PON陽性顆粒數(shù)目最多，著色明顯增強，PON免疫組化陽性積分顯著降低(F=3.130，Plt;0.01)。經(jīng)治療后，糖肝康小、中、大劑量組、護肝寧對照組與模型對照組相比，陽性顆粒數(shù)目均較少，著色均較淺，PON陽性積分明顯升高(F=3.130，Plt;0.05)，見圖2(封3)，圖3。

注：A：正常對照組；B：模型對照組；C：護肝寧對照組；D：糖肝康小劑量組；E：糖肝康中劑量組；F：糖肝康大劑量組；PON：對氧磷酶；TAA：硫代乙酰胺；與A比較，aPlt;0.05，aaPlt;0.01；與B比較，cPlt;0.05，ccPlt;0.01圖3 糖肝康對TAA急性肝損傷模型大鼠肝臟PON免疫組化表達的影響

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學認為糖尿病肝損傷的發(fā)生不僅與糖脂代謝紊亂有關，而且是一個多因素參與的復雜病理過程。炎性反應、自由基產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化均可破壞肝細胞結(jié)構和功能。PON是一類催化磷酸酯鍵水解的芳香酯酶，1953年Aldridge[10]首先發(fā)現(xiàn)生物體內(nèi)存在可水解有機磷化合物的酶類。因該酶多以對氧磷為底物，故命名為PON。其基因家族包括PON1、PON2和PON3，基因表達主要受到Sp1、Ap-1、PPAR等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[1]。人血清PON主要由肝臟分泌，其還廣泛分布于哺乳動物的血液、腎臟、脾臟及腦組織中[1]。PON具有調(diào)節(jié)氧化應激平衡、抗纖維化、抑制細胞凋亡等作用[11]。研究證明，血清PON1活性變化與肝損傷的嚴重程度密切相關，即肝損傷程度越嚴重，酶活性下降越明顯[1]。因此，研究和探討PON活性變化與慢性肝損傷的關系對肝損傷機制的深入了解具有重要意義。

筆者根據(jù)多年臨床觀察經(jīng)驗，總結(jié)出脾虛氣弱是糖尿病肝損傷的重要發(fā)病基礎，肝失條達為糖尿病肝損傷發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，瘀毒互結(jié)為糖尿病肝損傷的重要病理變化，并貫穿于病程始終。因此治療上以健脾益氣治其本，調(diào)肝解毒活血治其標為治療原則，組成糖肝康以健脾益氣、調(diào)肝解毒活血，從而改善肝功能，降低血糖、血脂，改善血流變及胰島素水平[12]。本方由生黃芪、白術、茵陳、黃芩、柴胡、炒梔子等藥物組成。重用生黃芪、白術，二者相伍，共為君藥，以健脾益氣。取柴胡、黃芩、茵陳、炒梔子、大黃、白芍、羚羊粉為方中臣藥，配合君藥以健脾益氣、調(diào)肝活血、清熱解毒。取荷葉、山楂為佐藥，共奏化濕、活血消食之功效。甘草為方中使藥，清熱解毒且調(diào)和藥性。諸藥合用共奏健脾益氣、調(diào)肝解毒、清熱化濕活血之功。

本研究結(jié)果表明，以健脾益氣、調(diào)肝解毒活血為組方原則研制的糖肝康對糖尿病肝損傷大鼠肝臟組織的病理結(jié)構有明顯的預防保護作用，提示本方對糖尿病肝損傷病變有顯著的防護作用。且模型大鼠肝臟中PON的表達較正常對照組大鼠表達降低，而糖肝康可改善PON在肝臟的表達，效果與護肝寧對照組無明顯差異。提示糖肝康可能通過改善PON在肝臟表達起到對機體代謝的影響，進而起到保護肝臟的作用。

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EffectsofTanggankangonliverstructureandexpressionofPONindiabeticratswithacuteliverinjury

QianWeibin*,QianQiuhai,CaiXinrui,ZhangXinying,WangYingying.

*SchoolofMedicine,TottoriUniversityFacultyofMedicine,Yonago683-8503,Japan

Correspondingauthor:QianQiuhai,Email：qianqiuhai@126.com

ObjectiveTo observe the effects of Tanggankang on liver structure and expression of paraoxonase (PON) in diabetic rats with acute liver injury.MethodsA total of 90 adult male Wistar rats were selected to establish diabetic model by thioacetamide. A total of 50 successful model were divided into 5 groups (10 rats in each group): model control group, Huganning control group, Tanggankang small, medium and large dose groups according to random number method. The other 10 rats were assigned as normal control group. Rats in model control group and normal control group were given normal saline 10 ml/kg ig. Rats in Huganning control group were given Huganning mixed suspension 0.04 g/ml ig. Rats in Tanggankang small, medium and large dose groups were given Tanggankang 1 g/ml, 2 g/ml, 4 g/ml ig, respectively. After 12 weeks of administration, the rats in each group were treated with TAA 200 mg/kg intraperitoneally to induce acute liver injury. After 24 hours of anesthesia, rats were sacrificed and the liver were removed. The liver pathology were observed by Light microscope, and the expression of PON in liver tissues of rats were observed by immunohistochemistry.ResultsThe structure of liver tissue was changed in rats after treated with TAA, such as hepatic cell swelling, fatty degeneration and necrosis, ambiguous hepatic leaflets, fibroblasts and collagen fibers in portalarea. After treatment with Tanggankan, the disorders mentioned above were improved. The expression of PON was reduced in model control group compared with normal control group (F=3.130,Plt;0.01). Compared with model control group, the expression of PON were increased in different dose of Tanggankang group and Huganning group (F=3.130,Plt;0.05).ConclusionTanggankan may improve the pathological changes of acute liver injury induced by TAA, through the mechanism of increasing the expression of PON.

Tanggankang; Diabetes mellitus; Liver injury

山東省自然科學基金資助項目(ZR2012HM093)；山東省中醫(yī)藥科學技術研究項目(2011-038)

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2016.05.06

6838503 鳥取，日本鳥取大學醫(yī)學部(錢衛(wèi)斌)；250011 濟南，山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科(錢秋海，張新穎)；250002 濟南，山東省職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病防治研究院，山東省醫(yī)學科學院(蔡欣蕊)； 250002 濟南市市中區(qū)人民醫(yī)院(王營營)

錢秋海，Email：qianqiuhai@126.com

FundProgramProject of Natural Science Foundation of Shandong Province(ZR2012HM093); Science and Technology Research Project of Traditional Chinese Medicine in Shandong Province(2011-038)

2015-09-06)