Exendin-4對高糖培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞ECM分泌的影響及相關(guān)機(jī)制

林曉璐 張紅 夏小慧 陳娟 張日東 章向成 李偉

·論著·

Exendin-4對高糖培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞ECM分泌的影響及相關(guān)機(jī)制

林曉璐 張紅 夏小慧 陳娟 張日東 章向成 李偉

目的研究exendin-4對高糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞(GMCs)細(xì)胞外基質(zhì)分泌的影響及相關(guān)機(jī)制。方法體外培養(yǎng)GMCs，分為4組：正常對照組(NC組)、正常對照+exendin-4組(NCE組)、高糖組(HG組)、高糖+exendin-4組(HGE組)；HGE組細(xì)胞分別給予3，5，10，15，30 nmol/L exendin-4培養(yǎng)12，24，48 h，采用細(xì)胞增殖與活性檢測試劑盒(Cell Counting Kit-8，CCK8)法測定細(xì)胞增殖情況，確定exendin-4的最適作用時(shí)間與濃度。ELISA測定細(xì)胞上清中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白纖維連接蛋白(FN)和Ⅳ型膠原蛋白水平。RT-PCR檢測FN、Ⅳ型膠原蛋白及單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)mRNA的表達(dá)。Western印跡測定核因子-κB的表達(dá)。結(jié)果(1)高糖培養(yǎng)的GMCs給予10 noml/L exendin-4培養(yǎng)24 h后，其細(xì)胞增殖率較3 nmol/L、5 nmol/L的exendin-4明顯降低(F=120.808,Plt;0.05)；與15 nmol/L、30 nmol/L相比，10 noml/L(HGE組)的exendin-4對GMCs增殖率無明顯變化(P均gt;0.05)。(2)與NC組、NCE組相比，HG組FN、Ⅳ型膠原蛋白分泌及mRNA以及MCP-1、TNF-α、ICAM-1、TGF-β1mRNA的表達(dá)均顯著升高(F=6.894～166.914,P均lt;0.05)；與HG組相比，HGE組FN、Ⅳ型膠原蛋白分泌及mRNA以及TNF-α、MCP-1、ICAM-1、TGF-β1mRNA表達(dá)量明顯降低(F=6.894～166.914，P均lt;0.05)。(3)與NC組、NCE相比，HG組核因子-κB蛋白的表達(dá)明顯增多(F=133.1，Plt;0.05)。與HG組相比，HGE組核因子-κB蛋白的表達(dá)則明顯受到抑制(F=133.1,Plt;0.05)。結(jié)論Exendin-4抑制高糖培養(yǎng)GMCs的細(xì)胞外基質(zhì)分泌，與其抑制核因子-κB介導(dǎo)的炎性反應(yīng)有關(guān)。

Exendin-4；腎小球系膜細(xì)胞；炎癥；核因子-κB

糖尿病腎病(DN)是糖尿病慢性微血管并發(fā)癥之一，其基本病理改變?yōu)橄的ぜ?xì)胞增生、基底膜增厚、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)積聚及腎小球硬化、腎臟纖維化，最終導(dǎo)致腎功能衰竭。代謝紊亂和血流動力學(xué)異常作為啟動子，激活了腎組織內(nèi)多種炎性分子及炎性信號通路，這些因素共同導(dǎo)致了腎臟的結(jié)構(gòu)和功能的異常[1]。更好地了解DN中的炎性反應(yīng)，將有助于找到新的治療人類糖尿病腎臟疾病的新策略。

胰高血糖素樣肽(GLP)-1與GLP-1受體(GLP-1R)結(jié)合后，通過促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌胰島素、抑制胰島α細(xì)胞分泌胰高血糖素、抑制食欲、延緩胃排空等途徑降低血糖[2]。Exendin-4與人GLP-1有53%的同源性，與GLP-1R高度親和，其特殊的分子結(jié)構(gòu)使還其能有效抵抗二肽基肽酶Ⅳ的降解[3-4]。國內(nèi)、外研究發(fā)現(xiàn)，exendin-4干預(yù)治療可改善糖尿病大鼠尿白蛋白排泄、腎小球肥大、系膜基質(zhì)擴(kuò)張，不僅能抑制ECM成分的合成，還能增強(qiáng)ECM成分的降解[5-6]。目前，exendin-4發(fā)揮腎臟保護(hù)作用的具體機(jī)制尚未研究透徹。本研究旨在通過建立體外模型，觀察exendin-4對高糖環(huán)境下的大鼠腎小球系膜細(xì)胞(GMCs)ECM分泌及炎性反應(yīng)信號的影響，初步探討其中的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 低糖及高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司，exendin-4購自Ana Spec公司，細(xì)胞增殖與活性檢測試劑盒(CCK8)購自上海七海復(fù)泰生物科技有限公司，ELISA試劑盒購自美國RB SCIENTIFIC公司，Trizol總RNA抽提試劑盒購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強(qiáng)型)購自上海碧云天生物技術(shù)研究所， 兔抗核因子-κB p65單克隆抗體購自德國CST公司，磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購自上海優(yōu)寧維生物科技有限公司。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 選取大鼠GMCs HBZY-1(細(xì)胞株名稱，徐州醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室)，在無菌條件下0.25%胰酶消化2 min，觀察細(xì)胞分散成拉網(wǎng)狀，終止消化。加入DMEM培養(yǎng)液反復(fù)輕柔吹打，并均勻接種，置37℃、5%CO2溫箱中孵育，傳代，3～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。當(dāng)細(xì)胞接近亞融合狀態(tài)時(shí)改用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h以同步化，隨后以GMCs為實(shí)驗(yàn)對象。采用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 (1) 正常對照組(NC組)：采用含糖5.6 mmol/L的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。(2)正常對照+exendin-4組(NCE組)：采用exendin-4(10 nmol/L)預(yù)處理24 h，棄去培養(yǎng)基，然后加入低糖(5.6 mmol/L)培養(yǎng)基和exendin-4(10 nmol/L)共孵育。(3)高糖組(HG組)：采用含糖30 mmol/L的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。(4)高糖+exendin-4組(HGE組)：分別采用exendin-4(3，5，10，15，30 nmol/L)預(yù)處理24 h，棄去培養(yǎng)基，然后加入高糖(30 mmol/L)培養(yǎng)基和exendin-4(3，5，10，15，30 nmol/L)共孵育，記為HGE3組、HGE5組、HGE組、HGE15組、HGE30組。細(xì)胞同步化24 h后分別按上述要求處理細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 CCK-8法測定GMCs的增殖情況以確定exendin-4的最適作用時(shí)間與濃度 取對數(shù)生長期的GMCs，按每孔3 000個(gè)細(xì)胞懸液100 μl接種在96孔培養(yǎng)板上，待細(xì)胞貼壁后，換用無血清的培養(yǎng)基饑餓24 h，使細(xì)胞同步于G0期后，HGE組細(xì)胞分別予3，5，10，15，30 nmol/L exendin-4培養(yǎng)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，另外設(shè)空白對照孔(只有培養(yǎng)液，無細(xì)胞)。分別將培養(yǎng)板放入37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12，24，48 h后，選擇450 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸光值，記錄結(jié)果，所得exendin-4最適作用時(shí)間與濃度結(jié)果在以下的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中均用HGE組表示。

1.2.4 ELISA測定細(xì)胞上清中ECM纖維連接蛋白(FN)和Ⅳ型膠原蛋白水平 收集24 h處理組細(xì)胞上清液，按ELISA試劑盒說明書操作，相同標(biāo)本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次，在酶標(biāo)儀450 nm測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及吸光度值計(jì)算各樣本的相應(yīng)濃度。

1.2.5 RT-PCR檢測FN、Ⅳ型膠原蛋白、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1) mRNA表達(dá) 按照Trizol法提取組織總RNA，采用紫外分光光度法測定RNA在260 nm和280 nm的吸光度，計(jì)算RNA含量，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR引物序列見表1，反應(yīng)體系為25 μl，反應(yīng)條件：94℃ 3 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，72℃ 5 min 30個(gè)循環(huán)。取各樣本目的基因PCR產(chǎn)物6 μl、β-actin產(chǎn)物2 μl，用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，110 V電泳50 min，EB染色。凝膠成像分析系統(tǒng)采集電泳圖像，用Image J軟件計(jì)算目的基因相對于內(nèi)參β-actin的灰度值。

1.2.6 Western印跡檢測核因子-κB蛋白的表達(dá) 取GMCs消化后，用PBS清洗3遍后，加入裂解液，裂解30 min后移入1.5 ml EP管中，于4℃下12 000 r/min(r=9.5 cm)，離心10 min，取上清分裝于0.5 ml離心管中并置于-80℃保存。采用BCA法測定總蛋白濃度，取15 μl(7.5 μg)蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，BSA封閉2 h，4℃置于一抗(1∶1 000)孵育過夜，TBST搖動漂洗10 min×3次，加入二抗(1∶1 000)并于室溫下孵育2 h，TBST洗膜3次各10 min，顯色，掃描儀記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。應(yīng)用Image J軟件分析目的蛋白及內(nèi)參蛋白灰度值，計(jì)算相對灰度值。

表1 目的基因及內(nèi)參基因引物序列

注：FN：纖維連接蛋白；MCP-1：單核細(xì)胞趨化蛋白-1；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；ICAM-1：細(xì)胞間黏附分子-1；TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長因子-β1；β-actin：β-肌動蛋白

2 結(jié)果

2.1 Exendin-4最適作用時(shí)間與濃度 高糖培養(yǎng)的GMCs給予10 noml/L的exendin-4培養(yǎng)，其HGE組細(xì)胞增殖率較HGE3組、HGE5組明顯降低(Plt;0.05)；與HGE15組、HGE30組相比，10 noml/L的exendin-4 HGE組對GMCs增殖率無明顯變化(Pgt;0.05)。同時(shí)高糖培養(yǎng)下GMCs給予10 nmol/L的exendin-4處理24 h，其細(xì)胞增殖率較12 h、48 h均明顯降低(Plt;0.05)，見表2。

2.2 Exendin-4對GMCs細(xì)胞上清FN和Ⅳ型膠原蛋白的影響 與NG組、NGE組相比，HG組FN、Ⅳ型膠原蛋白的表達(dá)升高(F=72.139、140.519，P均lt;0.05)；與HG組相比，HGE組的FN及Ⅳ型膠原蛋白表達(dá)降低(F=72.139、140.519，P均lt;0.05)，見圖1。

2.3 Exendin-4對GMCs FN、Ⅳ型膠原蛋白、MCP-1、TNF-α、ICAM-1、TGF-β1mRNA表達(dá)的影響 與NG組、NGE組相比，HG組FN、Ⅳ型膠原蛋白、MCP-1、TNF-α、ICAM-1、TGF-β1mRNA的表達(dá)升高(F=6.894～166.914，P均lt;0.05)；與HG組相比，HGE組FN、Ⅳ型膠原蛋白、MCP-1、TNF-α、ICAM-1、TGF-β1mRNA表達(dá)降低(F=6.894～166.914，P均lt;0.05)，見圖2。

2.4 Exendin-4對GMCs核因子-κB表達(dá)的影響 與NG組、NGE組相比，HG組GMCs中核因子-κB的表達(dá)量明顯增多(F=133.1，Plt;0.05)；與HG組相比，HGE組核因子-κB的表達(dá)量降低(F=133.1，Plt;0.05)，見圖3。

表2 Exendin-4對GMCs增殖的影響

注：與NG組相比，aPlt;0.05；與HG組相比，bPlt;0.05；NG組：低糖組；HG組：高糖組；HGE3、HGE5、HGE、HGE15、HGE30組：高糖加3、5、10、15、30 nmol/L exendin-4組；GMCs：腎小球系膜細(xì)胞

注：與NG組、NGE組相比， aPlt;0.05；與HG組相比，bPlt;0.05；NG組：低糖組；NGE組：低糖加exendin-4(10 nmol/L)組；HG組：高糖組；HGE組：高糖加exendin-4(10 nmol/L)組；FN：纖維連接蛋白；COL-Ⅳ：Ⅳ型膠原蛋白圖1 Exendin-4對高糖條件下系膜細(xì)胞FN、Ⅳ型膠原蛋白的影響

3 討論

DN是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥，早期出現(xiàn)腎小球內(nèi)高壓以及腎小球?yàn)V過率增加，腎小球ECM合成增加及基底膜增厚，導(dǎo)致腎小球系膜區(qū)擴(kuò)張，逐漸發(fā)展成為腎臟的纖維化和硬化，最終導(dǎo)致腎功能衰竭。DN的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，迄今尚未完全清楚。由高血糖介導(dǎo)的代謝異常和血流動力學(xué)改變是導(dǎo)致DN的主要原因。最近越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激、蛋白質(zhì)非酶糖基化、蛋白激酶C途徑以及腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活、炎性反應(yīng)(如炎性細(xì)胞、炎性細(xì)胞因子激活)等途徑也與DN的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[7]。這些途徑均可以引起核因子-κB活性增強(qiáng)，活化后的核因子-κB進(jìn)一步啟動許多與DN相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。因此，核因子-κB在DN發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[8]。

ECM是腎小球系膜區(qū)圍繞系膜細(xì)胞的非彌散的固相介質(zhì)，能夠調(diào)節(jié)系膜細(xì)胞增生和分泌各種活性物質(zhì)，其中FN和Ⅳ型膠原蛋白是構(gòu)成ECM的重要成分。本實(shí)驗(yàn)選取大鼠GMCs，并對細(xì)胞上清中FN和Ⅳ型膠原蛋白的分泌及表達(dá)進(jìn)行測定，證實(shí)高糖可使FN和Ⅳ型膠原蛋白的含量明顯升高，這與Nahman等[9]的研究結(jié)果一致。

核因子-κB在GMCs、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞和經(jīng)血液循環(huán)進(jìn)入腎臟的免疫細(xì)胞中都存在，其作為一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，可以被許多細(xì)胞外刺激激活，活化后的核因子-κB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與多種炎性因子啟動子區(qū)域中κB序列結(jié)合，參與細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)等多種條件下的基因調(diào)控[10]。近年來研究亦表明，核因子-κB在GMCs活化、增生和炎性介質(zhì)產(chǎn)生中處于中心地位[11]。

有研究表明，核因子-κB可誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子(如白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-6)、黏附因子[ICAM-1、血管細(xì)胞黏附分子(VCAM)-1、趨化因子(MCP-1、C3)]等編碼基因的表達(dá)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，在高糖誘導(dǎo)的GMCs中炎性相關(guān)因子MCP-1、ICAM-1表達(dá)明顯升高，給予exendin-4干預(yù)后MCP-1、ICAM-1 mRNA的表達(dá)受到抑制。而已有研究表明，在DN動物模型中，MCP-1、ICAM-1表達(dá)明顯增加，敲除MCP-1基因的1型糖尿病和2型糖尿病大鼠，其腎損傷明顯減輕[13]。而敲除ICAM-1基因小鼠DN的發(fā)生延遲[14]。因此，exendin-4可以通過減少黏附因子與趨化因子的表達(dá)來對GMCs進(jìn)行保護(hù)，且這種機(jī)制與抑制核因子-κB通路有關(guān)。

注：與NG組、NGE組相比,aPlt;0.05；與HG組相比,bPlt;0.05；NG組：低糖組；NGE組：低糖加exendin-4(10 nmol/L)組；HG組：高糖組；HGE組：高糖加exendin-4(10 nmol/L)組；FN：纖維連接蛋白；COL-Ⅳ：Ⅳ型膠原蛋白；MCP-1：單核細(xì)胞趨化蛋白-1；ICAM-1：細(xì)胞間黏附分子-1；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長因子-β1圖2 Exendin-4對高糖條件下系膜細(xì)胞FN、Ⅳ型膠原蛋白、MCP-1、TNF-α、ICAM-1、TGF-β1 mRNA的影響

注：與NG組相比，aPlt;0.05；與HG組相比，bPlt;0.05；NG：低糖組；NGE組：低糖加exendin-4(10 nmol/L)組；HG：高糖組；HGE組：高糖加exendin-4(10 nmol/L)組；NF-κB：核因子-κB圖3 Exendin-4對高糖培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞核因子-κB蛋白表達(dá)的影響

TNF-α在腎組織中主要由GMCs、腎小球細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞、腎間質(zhì)樹突狀細(xì)胞等產(chǎn)生，在實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠腎臟中TNF-α的表達(dá)明顯增多[15]。TNF-α作為一種高效的促炎細(xì)胞因子，可以直接刺激系膜細(xì)胞產(chǎn)生多種炎性介質(zhì)如MCP-1和ICAM-1[16]。其還可通過膜受體逐級激活，最后使游離的核因子-κB激活，這兩種因子相互作用，進(jìn)一步加重腎臟損害。本研究發(fā)現(xiàn)大鼠GMCs在高糖的影響下TNF-α mRNA表達(dá)較NC組明顯升高，而給予exendin-4干預(yù)后，其表達(dá)受抑制，同時(shí)與核因子-κB的表達(dá)有關(guān)。

TGF-β1是一種多功能、能多向調(diào)節(jié)的中心細(xì)胞因子，它不僅可以直接促使腎臟肥大，還可以通過誘導(dǎo)ECM沉積而具有強(qiáng)烈促纖維化作用使腎小球硬化，并且能誘導(dǎo)炎性細(xì)胞浸潤和成纖維細(xì)胞增生。大量研究已經(jīng)證實(shí)，TGF-β1與DN的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[17-18]。Mirza等[19]研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1的活化劑轉(zhuǎn)谷酰氨酶的前體由核因子-κB調(diào)控，進(jìn)一步研究表明，缺乏TGF-β1的大鼠會表現(xiàn)出異常的核因子-κB激活(主要是通過Toll樣受體4)，最后會因嚴(yán)重炎性反應(yīng)綜合征而死亡[20]。由此推測，腎組織中核因子-κB的活化，可促使TGF-β1表達(dá)增加，導(dǎo)致ECM合成增加，在DN的發(fā)病過程中具有重要作用。

作為GLP-1的類似物，exendin-4不僅具有降血糖的作用，而且對于DN也有一定的保護(hù)作用[21]。目前應(yīng)用于臨床的exendin-4類藥物為人工合成多肽產(chǎn)物艾塞那肽(exenatide)，其與exendin-4有50%的結(jié)構(gòu)同源性。本研究發(fā)現(xiàn)，和ECM的分泌、炎性相關(guān)介質(zhì)變化類似，高糖作用下核因子-κB的活性升高，經(jīng)exendin-4干預(yù)后活性則明顯被抑制，說明exendin-4抑制高糖培養(yǎng)下大鼠GMCs ECM的分泌，與其抑制核因子-κB介導(dǎo)的炎性反應(yīng)有關(guān)，其可有效阻止DN的進(jìn)一步發(fā)展。這一研究結(jié)果為exendin-4對DN的保護(hù)作用提供了強(qiáng)有力的理論依據(jù)，但其具體的分子機(jī)制尚不明確，需深入研究。

[1] 張紅, 章向成, 朱大龍. 炎性反應(yīng)與糖尿病腎病[J]. 國際內(nèi)分泌代謝雜志, 2015, 35(1): 49-52. DOI：10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2015.01.012.

[2] McCray BA, Taylor JP. The role of autophagy in age-related neurodegeneration[J].Neurosignals,2008,16(1):75-84.

[3] Rautou PE, Mansouri A, Lebrec D,et al. Autophagy in liver diseases[J].J Hepatol,2010,53(6):1123-1134. DOI: 10.1016/j.jhep.2010.07.006.

[4] Kume S, Thomas MC, Koya D. Nutrient sensing, autophagy, and diabetic nephropathy[J].Diabetes,2012,61(1):23-29. DOI: 10.2337/db11-0555.

[5] Hartleben B, G?del M, Meyer-Schwesinger C,et al. Autophagy influences glomerular disease susceptibility and maintains podocyte homeostasis in aging mice[J].J Clin Invest,2010,120(4):1084-1096. DOI: 10.1172/JCI39492.

[6] Bachar-Wikstrom E, Wikstrom JD, Ariav Y,et al. Stimulation of autophagy improves endoplasmic reticulum stress-induced diabetes[J].Diabetes,2013,62(4):1227-1137. DOI: 10.2337/db12-1474.

[7] Bachar-Wikstrom E, Wikstrom JD, Ariav Y,et al. Stimulation of autophagy improves endoplasmic reticulum stress-induced diabetes[J].Diabetes,2013,62(4):1227-1237. DOI: 10.2337/db12-1474.

[8] Mezzano S, Aros C, Droguett A,et al. NF-kappaB activation and overexpression of regulated genes in human diabetic nephropathy[J].Nephrol Dial Transplant,2004,19(10):2505-2512.

[9] Nahman NS Jr, Leonhart KL, Cosio FG,et al. Effects of high glucose on cellular proliferation and fibronectin production by cultured human mesangial cells[J].Kidney Int,1992,41(2):396-402.

[10] Vallabhapurapu S, Karin M. Regulation and function of NF-kappaB transcription factors in the immune system[J].Annu Rev Immunol,2009,27:693-733. DOI: 10.1146/annurev.immunol.021908.132641.

[11] Baldwin AS Jr. Series introduction: the transcription factor NF-kappaB and human disease[J].J Clin Invest,2001,107(1):3-6.

[12] Chen FE, Ghosh G. Regulation of DNA binding by Rel/NF-kappaB transcription factors: structural views[J].Oncogene,1999,18(49):6845-6852.

[13] Chow FY, Nikolic-Paterson DJ, Ma FY,et al. Monocyte chemoattractant protein-1-induced tissue inflammation is critical for the development of renal injury but not type 2 diabetes in obese db/db mice[J].Diabetologia,2007,50(2):471-480.DOI:10.1007/s00125-006-0497-8.

[14] Güler S, Cakir B, Demirbas B,et al. Plasma soluble intercellular adhesion molecule 1 levels are increased in type 2 diabetic patients with nephropathy[J].Horm Res,2002,58(2):67-70.

[15] Mensah-Brown EP, Obineche EN, Galadari S,et al. Streptozotocin-induced diabetic nephropathy in rats: the role of inflammatory cytokines[J].Cytokine,2005,31(3):180-190.DOI:10.1016/j.cyto.2005.04.006.

[16] Sheryanna A, Bhangal G, McDaid J,et al. Inhibition of p38 mitogen-activated protein kinase is effective in the treatment of experimental crescentic glomerulonephritis and suppresses monocyte chemoattractant protein-1 but not IL-1beta or IL-6[J].J Am Soc Nephrol,2007,18(4):1167-1179.DOI:10.1681/ASN.2006010050.

[17] De Borst MH, Prakash J, Melenhorst WB,et al. Glomerular and tubular induction of the transcription factor c-Jun in human renal disease[J].J Pathol,2007,213(2):219-228.DOI:10.1002/path.2228.

[18] Sakai N, Wada T, Furuichi K,et al. Involvement of extracellular signal-regulated kinase and p38 in human diabetic nephropathy[J].Am J Kidney Dis,2005,45(1):54-65.

[19] Mirza A, Liu SL, Frizell E,et al. A role for tissue transglutaminase in hepatic injury and fibrogenesis, and its regulation by NF-kappaB[J].Am J Physiol,1997,272(2 Pt 1):G281-G288.

[20] McCartney-Francis N, Jin W, Wahl SM. Aberrant Toll receptor expression and endotoxin hypersensitivity in mice lacking a functional TGF-beta 1 signaling pathway[J].J Immunol,2004,172(6):3814-3821.

[21] Kodera R, Shikata K, Kataoka HU,et al. Glucagon-like peptide-1 receptor agonist ameliorates renal injury through its anti-inflammatory action without lowering blood glucose level in a rat model of type 1 diabetes[J].Diabetologia,2011,54(4):965-978. DOI: 10.1007/s00125-010-2028-x.

Effectsandmechanismofexendin-4onextracellularmatrixsecretionofmesangialcellsculturedinhighglucose

LinXiaolu*,ZhangHong,XiaXiaohui,ChenJuan,ZhangRidong,ZhangXiangcheng,LiWei.

*GraduatedSchoolofXuzhouMedicalCollege，Xuzhou221000，China

Correspondingauthor:LiWei,Email:Liwei.190@hotmail.com

ObjectiveTo explore the effects and mechanism of exendin-4 on the secretion of extracellular matrix in high glucose-cultured glomerular mesangial cells (GMCs).MethodsGMCs were culturedinvitroand divided into 4 groups: normal control (NC) group, normal control with exendin-4 (NCE) group, high glucose (HG) group, high glucose with exendin-4 (HGE) group. Cells in HGE group were treated with 3, 5, 10, 15 or 30 nmol/L exendin-4 for about 12, 24 or 48 hours, respectively. The proliferation and cell activity of GMCs were used to assess the most suitable culture time and concentration using Cell Counting Kit-8. The levels of fibronectin (FN) and collagen type Ⅳ in the cell supernatant were measured by ELISA. The levels of collagen type Ⅳ, FN, monocyte chemotactic protein-1(MCP-1), tumor necrosis factor (TNF)-α, intercellular cell adhesion molecule-1(ICAM-1), transforming growth factor-β1(TGF-β1) were evaluated by RT-PCR. The expression of nuclear factor-κB (NF-κB) in each group was analyzed by Western blotting.Results(1) After treated by 10 nmol/L exendin-4 for 24 hours, the growth rate of GMCs cultured in high glucose was significantly decreased compared with 3 nmol/L or 5 nmol/L (F=120.808,Plt;0.05), but not different from 15 nmol/L or 20 nmol/L (allPgt;0.05). (2)Compared with NC group and NCE group，the expression of FN, collagen type Ⅳ, as well as their mRNA level and the inflammatory mediators such as MCP-1, TNF-α, ICAM-1 and TGF-β1were significantly increased in HG group(F=6.894-166.914, allPlt;0.05). Compared with HG group, the protein and mRNA level of FN and collagen type Ⅳ, and the expression of TNF-α, MCP-1, ICAM-1 and TGF-β1were inhibited greatly in HGE group (F=6.894-166.914, allPlt;0.05).(3)Compared with NC group and NCE group, the expression of NF-κB increased significantly in HG group (F=133.1,Plt;0.05). Compared with HG group, the expression of NF-κB was suppressed significantly in HGE group (F=133.1,Plt;0.05).ConclusionExendin-4 inhibits the secretion of extracellular matrix of GMCs cultured in high glucose, and the mechanism is associated with the inhibition of inflammation induced by NF-κB.

Exendin-4; Glomerular mesangial cells; Inflammation; Nuclear factor-κB

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81200595，81400807)；江蘇省衛(wèi)計(jì)委科研項(xiàng)目(H201253)

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2016.05.05

221000 徐州醫(yī)學(xué)院研究生院(林曉璐，夏小慧)；223001 南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院內(nèi)分泌科(陳娟，張日東，章向成，張紅)；221000 徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科(李偉)

李偉，Email:Liwei.190@hotmail.com

FundprogramNational Natural Science Foundation of China(81200595，81400807)；Jiangsu Provincial Commission of Health and Family Planning(H201253)

2015-10-28)