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    Exendin-4對高糖培養(yǎng)腎小球系膜細胞ECM分泌的影響及相關機制

    2016-11-27 06:00:21林曉璐張紅夏小慧陳娟張日東章向成李偉
    國際內(nèi)分泌代謝雜志 2016年5期

    林曉璐 張紅 夏小慧 陳娟 張日東 章向成 李偉

    ·論著·

    Exendin-4對高糖培養(yǎng)腎小球系膜細胞ECM分泌的影響及相關機制

    林曉璐 張紅 夏小慧 陳娟 張日東 章向成 李偉

    目的研究exendin-4對高糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞(GMCs)細胞外基質分泌的影響及相關機制。方法體外培養(yǎng)GMCs,分為4組:正常對照組(NC組)、正常對照+exendin-4組(NCE組)、高糖組(HG組)、高糖+exendin-4組(HGE組);HGE組細胞分別給予3,5,10,15,30 nmol/L exendin-4培養(yǎng)12,24,48 h,采用細胞增殖與活性檢測試劑盒(Cell Counting Kit-8,CCK8)法測定細胞增殖情況,確定exendin-4的最適作用時間與濃度。ELISA測定細胞上清中細胞外基質蛋白纖維連接蛋白(FN)和Ⅳ型膠原蛋白水平。RT-PCR檢測FN、Ⅳ型膠原蛋白及單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、轉化生長因子-β1(TGF-β1)mRNA的表達。Western印跡測定核因子-κB的表達。結果(1)高糖培養(yǎng)的GMCs給予10 noml/L exendin-4培養(yǎng)24 h后,其細胞增殖率較3 nmol/L、5 nmol/L的exendin-4明顯降低(F=120.808,Plt;0.05);與15 nmol/L、30 nmol/L相比,10 noml/L(HGE組)的exendin-4對GMCs增殖率無明顯變化(P均gt;0.05)。(2)與NC組、NCE組相比,HG組FN、Ⅳ型膠原蛋白分泌及mRNA以及MCP-1、TNF-α、ICAM-1、TGF-β1mRNA的表達均顯著升高(F=6.894~166.914,P均lt;0.05);與HG組相比,HGE組FN、Ⅳ型膠原蛋白分泌及mRNA以及TNF-α、MCP-1、ICAM-1、TGF-β1mRNA表達量明顯降低(F=6.894~166.914,P均lt;0.05)。(3)與NC組、NCE相比,HG組核因子-κB蛋白的表達明顯增多(F=133.1,Plt;0.05)。與HG組相比,HGE組核因子-κB蛋白的表達則明顯受到抑制(F=133.1,Plt;0.05)。結論Exendin-4抑制高糖培養(yǎng)GMCs的細胞外基質分泌,與其抑制核因子-κB介導的炎性反應有關。

    Exendin-4;腎小球系膜細胞;炎癥;核因子-κB

    糖尿病腎病(DN)是糖尿病慢性微血管并發(fā)癥之一,其基本病理改變?yōu)橄的ぜ毎錾⒒啄ぴ龊?、細胞外基質(ECM)積聚及腎小球硬化、腎臟纖維化,最終導致腎功能衰竭。代謝紊亂和血流動力學異常作為啟動子,激活了腎組織內(nèi)多種炎性分子及炎性信號通路,這些因素共同導致了腎臟的結構和功能的異常[1]。更好地了解DN中的炎性反應,將有助于找到新的治療人類糖尿病腎臟疾病的新策略。

    胰高血糖素樣肽(GLP)-1與GLP-1受體(GLP-1R)結合后,通過促進胰島β細胞分泌胰島素、抑制胰島α細胞分泌胰高血糖素、抑制食欲、延緩胃排空等途徑降低血糖[2]。Exendin-4與人GLP-1有53%的同源性,與GLP-1R高度親和,其特殊的分子結構使還其能有效抵抗二肽基肽酶Ⅳ的降解[3-4]。國內(nèi)、外研究發(fā)現(xiàn),exendin-4干預治療可改善糖尿病大鼠尿白蛋白排泄、腎小球肥大、系膜基質擴張,不僅能抑制ECM成分的合成,還能增強ECM成分的降解[5-6]。目前,exendin-4發(fā)揮腎臟保護作用的具體機制尚未研究透徹。本研究旨在通過建立體外模型,觀察exendin-4對高糖環(huán)境下的大鼠腎小球系膜細胞(GMCs)ECM分泌及炎性反應信號的影響,初步探討其中的機制。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑 低糖及高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司,exendin-4購自Ana Spec公司,細胞增殖與活性檢測試劑盒(CCK8)購自上海七海復泰生物科技有限公司,ELISA試劑盒購自美國RB SCIENTIFIC公司,Trizol總RNA抽提試劑盒購自美國Invitrogen公司,反轉錄試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)購自上海碧云天生物技術研究所, 兔抗核因子-κB p65單克隆抗體購自德國CST公司,磷酸酶標記山羊抗兔IgG購自上海優(yōu)寧維生物科技有限公司。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 細胞培養(yǎng) 選取大鼠GMCs HBZY-1(細胞株名稱,徐州醫(yī)學院藥理學實驗室),在無菌條件下0.25%胰酶消化2 min,觀察細胞分散成拉網(wǎng)狀,終止消化。加入DMEM培養(yǎng)液反復輕柔吹打,并均勻接種,置37℃、5%CO2溫箱中孵育,傳代,3~6代細胞用于實驗。當細胞接近亞融合狀態(tài)時改用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h以同步化,隨后以GMCs為實驗對象。采用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng),置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。

    1.2.2 實驗分組 (1) 正常對照組(NC組):采用含糖5.6 mmol/L的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。(2)正常對照+exendin-4組(NCE組):采用exendin-4(10 nmol/L)預處理24 h,棄去培養(yǎng)基,然后加入低糖(5.6 mmol/L)培養(yǎng)基和exendin-4(10 nmol/L)共孵育。(3)高糖組(HG組):采用含糖30 mmol/L的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。(4)高糖+exendin-4組(HGE組):分別采用exendin-4(3,5,10,15,30 nmol/L)預處理24 h,棄去培養(yǎng)基,然后加入高糖(30 mmol/L)培養(yǎng)基和exendin-4(3,5,10,15,30 nmol/L)共孵育,記為HGE3組、HGE5組、HGE組、HGE15組、HGE30組。細胞同步化24 h后分別按上述要求處理細胞用于實驗。

    1.2.3 CCK-8法測定GMCs的增殖情況以確定exendin-4的最適作用時間與濃度 取對數(shù)生長期的GMCs,按每孔3 000個細胞懸液100 μl接種在96孔培養(yǎng)板上,待細胞貼壁后,換用無血清的培養(yǎng)基饑餓24 h,使細胞同步于G0期后,HGE組細胞分別予3,5,10,15,30 nmol/L exendin-4培養(yǎng),每組設5個復孔,另外設空白對照孔(只有培養(yǎng)液,無細胞)。分別將培養(yǎng)板放入37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12,24,48 h后,選擇450 nm波長,在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸光值,記錄結果,所得exendin-4最適作用時間與濃度結果在以下的實驗數(shù)據(jù)中均用HGE組表示。

    1.2.4 ELISA測定細胞上清中ECM纖維連接蛋白(FN)和Ⅳ型膠原蛋白水平 收集24 h處理組細胞上清液,按ELISA試劑盒說明書操作,相同標本設3個復孔,重復3次,在酶標儀450 nm測定吸光度值,根據(jù)標準曲線及吸光度值計算各樣本的相應濃度。

    1.2.5 RT-PCR檢測FN、Ⅳ型膠原蛋白、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、轉化生長因子-β1(TGF-β1) mRNA表達 按照Trizol法提取組織總RNA,采用紫外分光光度法測定RNA在260 nm和280 nm的吸光度,計算RNA含量,逆轉錄合成cDNA。PCR引物序列見表1,反應體系為25 μl,反應條件:94℃ 3 min,94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min,72℃ 5 min 30個循環(huán)。取各樣本目的基因PCR產(chǎn)物6 μl、β-actin產(chǎn)物2 μl,用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離,110 V電泳50 min,EB染色。凝膠成像分析系統(tǒng)采集電泳圖像,用Image J軟件計算目的基因相對于內(nèi)參β-actin的灰度值。

    1.2.6 Western印跡檢測核因子-κB蛋白的表達 取GMCs消化后,用PBS清洗3遍后,加入裂解液,裂解30 min后移入1.5 ml EP管中,于4℃下12 000 r/min(r=9.5 cm),離心10 min,取上清分裝于0.5 ml離心管中并置于-80℃保存。采用BCA法測定總蛋白濃度,取15 μl(7.5 μg)蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳,轉膜,BSA封閉2 h,4℃置于一抗(1∶1 000)孵育過夜,TBST搖動漂洗10 min×3次,加入二抗(1∶1 000)并于室溫下孵育2 h,TBST洗膜3次各10 min,顯色,掃描儀記錄實驗結果。應用Image J軟件分析目的蛋白及內(nèi)參蛋白灰度值,計算相對灰度值。

    表1 目的基因及內(nèi)參基因引物序列

    注:FN:纖維連接蛋白;MCP-1:單核細胞趨化蛋白-1;TNF-α:腫瘤壞死因子-α;ICAM-1:細胞間黏附分子-1;TGF-β1:轉化生長因子-β1;β-actin:β-肌動蛋白

    2 結果

    2.1 Exendin-4最適作用時間與濃度 高糖培養(yǎng)的GMCs給予10 noml/L的exendin-4培養(yǎng),其HGE組細胞增殖率較HGE3組、HGE5組明顯降低(Plt;0.05);與HGE15組、HGE30組相比,10 noml/L的exendin-4 HGE組對GMCs增殖率無明顯變化(Pgt;0.05)。同時高糖培養(yǎng)下GMCs給予10 nmol/L的exendin-4處理24 h,其細胞增殖率較12 h、48 h均明顯降低(Plt;0.05),見表2。

    2.2 Exendin-4對GMCs細胞上清FN和Ⅳ型膠原蛋白的影響 與NG組、NGE組相比,HG組FN、Ⅳ型膠原蛋白的表達升高(F=72.139、140.519,P均lt;0.05);與HG組相比,HGE組的FN及Ⅳ型膠原蛋白表達降低(F=72.139、140.519,P均lt;0.05),見圖1。

    2.3 Exendin-4對GMCs FN、Ⅳ型膠原蛋白、MCP-1、TNF-α、ICAM-1、TGF-β1mRNA表達的影響 與NG組、NGE組相比,HG組FN、Ⅳ型膠原蛋白、MCP-1、TNF-α、ICAM-1、TGF-β1mRNA的表達升高(F=6.894~166.914,P均lt;0.05);與HG組相比,HGE組FN、Ⅳ型膠原蛋白、MCP-1、TNF-α、ICAM-1、TGF-β1mRNA表達降低(F=6.894~166.914,P均lt;0.05),見圖2。

    2.4 Exendin-4對GMCs核因子-κB表達的影響 與NG組、NGE組相比,HG組GMCs中核因子-κB的表達量明顯增多(F=133.1,Plt;0.05);與HG組相比,HGE組核因子-κB的表達量降低(F=133.1,Plt;0.05),見圖3。

    表2 Exendin-4對GMCs增殖的影響

    注:與NG組相比,aPlt;0.05;與HG組相比,bPlt;0.05;NG組:低糖組;HG組:高糖組;HGE3、HGE5、HGE、HGE15、HGE30組:高糖加3、5、10、15、30 nmol/L exendin-4組;GMCs:腎小球系膜細胞

    注:與NG組、NGE組相比, aPlt;0.05;與HG組相比,bPlt;0.05;NG組:低糖組;NGE組:低糖加exendin-4(10 nmol/L)組;HG組:高糖組;HGE組:高糖加exendin-4(10 nmol/L)組;FN:纖維連接蛋白;COL-Ⅳ:Ⅳ型膠原蛋白圖1 Exendin-4對高糖條件下系膜細胞FN、Ⅳ型膠原蛋白的影響

    3 討論

    DN是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥,早期出現(xiàn)腎小球內(nèi)高壓以及腎小球濾過率增加,腎小球ECM合成增加及基底膜增厚,導致腎小球系膜區(qū)擴張,逐漸發(fā)展成為腎臟的纖維化和硬化,最終導致腎功能衰竭。DN的發(fā)病機制復雜,迄今尚未完全清楚。由高血糖介導的代謝異常和血流動力學改變是導致DN的主要原因。最近越來越多的研究發(fā)現(xiàn),氧化應激、蛋白質非酶糖基化、蛋白激酶C途徑以及腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活、炎性反應(如炎性細胞、炎性細胞因子激活)等途徑也與DN的發(fā)生、發(fā)展有關[7]。這些途徑均可以引起核因子-κB活性增強,活化后的核因子-κB進一步啟動許多與DN相關基因的轉錄。因此,核因子-κB在DN發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[8]。

    ECM是腎小球系膜區(qū)圍繞系膜細胞的非彌散的固相介質,能夠調節(jié)系膜細胞增生和分泌各種活性物質,其中FN和Ⅳ型膠原蛋白是構成ECM的重要成分。本實驗選取大鼠GMCs,并對細胞上清中FN和Ⅳ型膠原蛋白的分泌及表達進行測定,證實高糖可使FN和Ⅳ型膠原蛋白的含量明顯升高,這與Nahman等[9]的研究結果一致。

    核因子-κB在GMCs、毛細血管內(nèi)皮細胞、腎小管上皮細胞和經(jīng)血液循環(huán)進入腎臟的免疫細胞中都存在,其作為一個重要的轉錄因子,可以被許多細胞外刺激激活,活化后的核因子-κB進入細胞核內(nèi),與多種炎性因子啟動子區(qū)域中κB序列結合,參與細胞凋亡、炎性反應等多種條件下的基因調控[10]。近年來研究亦表明,核因子-κB在GMCs活化、增生和炎性介質產(chǎn)生中處于中心地位[11]。

    有研究表明,核因子-κB可誘導多種細胞因子(如白細胞介素-2、白細胞介素-6)、黏附因子[ICAM-1、血管細胞黏附分子(VCAM)-1、趨化因子(MCP-1、C3)]等編碼基因的表達[12]。本研究發(fā)現(xiàn),在高糖誘導的GMCs中炎性相關因子MCP-1、ICAM-1表達明顯升高,給予exendin-4干預后MCP-1、ICAM-1 mRNA的表達受到抑制。而已有研究表明,在DN動物模型中,MCP-1、ICAM-1表達明顯增加,敲除MCP-1基因的1型糖尿病和2型糖尿病大鼠,其腎損傷明顯減輕[13]。而敲除ICAM-1基因小鼠DN的發(fā)生延遲[14]。因此,exendin-4可以通過減少黏附因子與趨化因子的表達來對GMCs進行保護,且這種機制與抑制核因子-κB通路有關。

    注:與NG組、NGE組相比,aPlt;0.05;與HG組相比,bPlt;0.05;NG組:低糖組;NGE組:低糖加exendin-4(10 nmol/L)組;HG組:高糖組;HGE組:高糖加exendin-4(10 nmol/L)組;FN:纖維連接蛋白;COL-Ⅳ:Ⅳ型膠原蛋白;MCP-1:單核細胞趨化蛋白-1;ICAM-1:細胞間黏附分子-1;TNF-α:腫瘤壞死因子-α;TGF-β1:轉化生長因子-β1圖2 Exendin-4對高糖條件下系膜細胞FN、Ⅳ型膠原蛋白、MCP-1、TNF-α、ICAM-1、TGF-β1 mRNA的影響

    注:與NG組相比,aPlt;0.05;與HG組相比,bPlt;0.05;NG:低糖組;NGE組:低糖加exendin-4(10 nmol/L)組;HG:高糖組;HGE組:高糖加exendin-4(10 nmol/L)組;NF-κB:核因子-κB圖3 Exendin-4對高糖培養(yǎng)腎小球系膜細胞核因子-κB蛋白表達的影響

    TNF-α在腎組織中主要由GMCs、腎小球細胞和內(nèi)皮細胞、腎間質樹突狀細胞等產(chǎn)生,在實驗性糖尿病大鼠腎臟中TNF-α的表達明顯增多[15]。TNF-α作為一種高效的促炎細胞因子,可以直接刺激系膜細胞產(chǎn)生多種炎性介質如MCP-1和ICAM-1[16]。其還可通過膜受體逐級激活,最后使游離的核因子-κB激活,這兩種因子相互作用,進一步加重腎臟損害。本研究發(fā)現(xiàn)大鼠GMCs在高糖的影響下TNF-α mRNA表達較NC組明顯升高,而給予exendin-4干預后,其表達受抑制,同時與核因子-κB的表達有關。

    TGF-β1是一種多功能、能多向調節(jié)的中心細胞因子,它不僅可以直接促使腎臟肥大,還可以通過誘導ECM沉積而具有強烈促纖維化作用使腎小球硬化,并且能誘導炎性細胞浸潤和成纖維細胞增生。大量研究已經(jīng)證實,TGF-β1與DN的發(fā)生、發(fā)展關系密切[17-18]。Mirza等[19]研究發(fā)現(xiàn),TGF-β1的活化劑轉谷酰氨酶的前體由核因子-κB調控,進一步研究表明,缺乏TGF-β1的大鼠會表現(xiàn)出異常的核因子-κB激活(主要是通過Toll樣受體4),最后會因嚴重炎性反應綜合征而死亡[20]。由此推測,腎組織中核因子-κB的活化,可促使TGF-β1表達增加,導致ECM合成增加,在DN的發(fā)病過程中具有重要作用。

    作為GLP-1的類似物,exendin-4不僅具有降血糖的作用,而且對于DN也有一定的保護作用[21]。目前應用于臨床的exendin-4類藥物為人工合成多肽產(chǎn)物艾塞那肽(exenatide),其與exendin-4有50%的結構同源性。本研究發(fā)現(xiàn),和ECM的分泌、炎性相關介質變化類似,高糖作用下核因子-κB的活性升高,經(jīng)exendin-4干預后活性則明顯被抑制,說明exendin-4抑制高糖培養(yǎng)下大鼠GMCs ECM的分泌,與其抑制核因子-κB介導的炎性反應有關,其可有效阻止DN的進一步發(fā)展。這一研究結果為exendin-4對DN的保護作用提供了強有力的理論依據(jù),但其具體的分子機制尚不明確,需深入研究。

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    Effectsandmechanismofexendin-4onextracellularmatrixsecretionofmesangialcellsculturedinhighglucose

    LinXiaolu*,ZhangHong,XiaXiaohui,ChenJuan,ZhangRidong,ZhangXiangcheng,LiWei.

    *GraduatedSchoolofXuzhouMedicalCollege,Xuzhou221000,China

    Correspondingauthor:LiWei,Email:Liwei.190@hotmail.com

    ObjectiveTo explore the effects and mechanism of exendin-4 on the secretion of extracellular matrix in high glucose-cultured glomerular mesangial cells (GMCs).MethodsGMCs were culturedinvitroand divided into 4 groups: normal control (NC) group, normal control with exendin-4 (NCE) group, high glucose (HG) group, high glucose with exendin-4 (HGE) group. Cells in HGE group were treated with 3, 5, 10, 15 or 30 nmol/L exendin-4 for about 12, 24 or 48 hours, respectively. The proliferation and cell activity of GMCs were used to assess the most suitable culture time and concentration using Cell Counting Kit-8. The levels of fibronectin (FN) and collagen type Ⅳ in the cell supernatant were measured by ELISA. The levels of collagen type Ⅳ, FN, monocyte chemotactic protein-1(MCP-1), tumor necrosis factor (TNF)-α, intercellular cell adhesion molecule-1(ICAM-1), transforming growth factor-β1(TGF-β1) were evaluated by RT-PCR. The expression of nuclear factor-κB (NF-κB) in each group was analyzed by Western blotting.Results(1) After treated by 10 nmol/L exendin-4 for 24 hours, the growth rate of GMCs cultured in high glucose was significantly decreased compared with 3 nmol/L or 5 nmol/L (F=120.808,Plt;0.05), but not different from 15 nmol/L or 20 nmol/L (allPgt;0.05). (2)Compared with NC group and NCE group,the expression of FN, collagen type Ⅳ, as well as their mRNA level and the inflammatory mediators such as MCP-1, TNF-α, ICAM-1 and TGF-β1were significantly increased in HG group(F=6.894-166.914, allPlt;0.05). Compared with HG group, the protein and mRNA level of FN and collagen type Ⅳ, and the expression of TNF-α, MCP-1, ICAM-1 and TGF-β1were inhibited greatly in HGE group (F=6.894-166.914, allPlt;0.05).(3)Compared with NC group and NCE group, the expression of NF-κB increased significantly in HG group (F=133.1,Plt;0.05). Compared with HG group, the expression of NF-κB was suppressed significantly in HGE group (F=133.1,Plt;0.05).ConclusionExendin-4 inhibits the secretion of extracellular matrix of GMCs cultured in high glucose, and the mechanism is associated with the inhibition of inflammation induced by NF-κB.

    Exendin-4; Glomerular mesangial cells; Inflammation; Nuclear factor-κB

    國家自然科學基金資助項目(81200595,81400807);江蘇省衛(wèi)計委科研項目(H201253)

    10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2016.05.05

    221000 徐州醫(yī)學院研究生院(林曉璐,夏小慧);223001 南京醫(yī)科大學附屬淮安第一醫(yī)院內(nèi)分泌科(陳娟,張日東,章向成,張紅);221000 徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科(李偉)

    李偉,Email:Liwei.190@hotmail.com

    FundprogramNational Natural Science Foundation of China(81200595,81400807);Jiangsu Provincial Commission of Health and Family Planning(H201253)

    2015-10-28)

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