馬鞭草總黃酮對肝癌HepG-2細(xì)胞凋亡的影響

任麗平 李先佳 梁樹才 毛 訊 王文寶 孫民振

(漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥理教研室,河南 漯河 462002)

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馬鞭草總黃酮對肝癌HepG-2細(xì)胞凋亡的影響

任麗平 李先佳1梁樹才1毛 訊 王文寶 孫民振

(漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校藥理教研室,河南 漯河 462002)

目的 探討馬鞭草總黃酮(TFV)對肝癌HepG-2 細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法 MTT法檢測TFV對肝癌HepG-2 細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡水平，Western 印跡法檢測核因子(NF)-κB p65和IκB-α蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 與陰性對照組比較，不同濃度TFV能明顯抑制HepG-2 細(xì)胞的生長(P<0.01)，呈濃度和時間依賴性。TFV作用于HepG-2 細(xì)胞24 h 后，HepG-2 G0/G1期細(xì)胞比例下降，S期和G2/M期細(xì)胞百分率增加(P<0.05)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡效果明顯(P<0.01)，能明顯的降低NF-κBp65表達(dá)，升高IκB-α蛋白表達(dá) (P<0.05)。結(jié)論 TFV能抑制HepG-2 細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，機制可能與促進(jìn)IκB-α蛋白表達(dá)，下調(diào)NF-κBp65蛋白表達(dá)有關(guān)。

肝癌；HepG-2細(xì)胞；馬鞭草總黃酮；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

近年來，肝癌的發(fā)病率逐年呈上升的趨勢，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，手術(shù)治療及放療、化療等非手術(shù)治療方案都不理想，而中醫(yī)對該病的治療取得了一定成就〔1〕。馬鞭草為馬鞭草科植物馬鞭草的全草或帶根全草，味苦性涼，具有抗癌、抗早孕和免疫調(diào)節(jié)作用。研究表明，馬鞭草富含黃酮類化合物〔2〕。本研究以肝癌HepG-2細(xì)胞為研究對象，采用不同濃度馬鞭草總黃酮(TFv)對人肝癌HepG-2細(xì)胞株給藥，觀察對人肝癌HepG-2細(xì)胞株增殖與凋亡作用的影響，探討TFV對人肝癌細(xì)胞HepG-2細(xì)胞株抑制作用可能的機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 TFV由漯河醫(yī)專天然藥物化學(xué)教研室提供(純度為90%)，溶于二甲基亞砜(DMSO)中，完全培養(yǎng)基稀釋成不同濃度，過濾除菌4℃保存。MTT細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；碘化丙啶(PI)購自Invitrogen；DMEM、胰酶購自Gibco公司；其余試劑為分析純試劑。

1.2 細(xì)胞及培養(yǎng) HepG-2 細(xì)胞株由漯河醫(yī)專分子生物學(xué)實驗室傳代保種。10%小牛血清的DMEM液中，37℃，5%CO2培養(yǎng)傳代，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化貼壁細(xì)胞。

1.3 方法

1.3.1 TFV對肝癌HepG-2細(xì)胞的毒性作用 取對數(shù)期的HepG-2細(xì)胞，細(xì)胞濃度調(diào)整至5×104個/ml，取100 μl接種于96孔板，貼壁后24 h同步化，去除培養(yǎng)液。實驗設(shè)陰性對照組、TFV組(50、100、200、300、400、500、600 mg/L)，空白對照組(不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液)，每孔200 μl，每組3個復(fù)孔。37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，檢測前4 h加入MTT (5 mg/ml)15 μl/孔，4 h后吸去培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μl/孔，震蕩10 min，酶聯(lián)免疫檢測儀于570 nm檢查光密度值，計算抑制率。

1.3.2 MTT法測定TFV對肝癌HepG-2細(xì)胞增殖的影響 取對數(shù)期的HepG-2細(xì)胞，細(xì)胞濃度調(diào)整至5×104個/ml，取100 μl接種于96孔板，貼壁后24 h同步化，去除培養(yǎng)液。實驗設(shè)陰性對照組、陽性對照組(0.3 μmol/L 5-FU)、TFV組(100、150、200 mg/L)和溶媒對照組(0.1%DMSO培養(yǎng)基)，空白對照組(不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液)，每孔200 μl，每組3個復(fù)孔。37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24、48 h，檢測前方法同上。

1.3.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 參照1.3.2法設(shè)置陰性對照組、陽性對照組、TFV組(100、150、200 mg/L)。培養(yǎng)48 h時分別于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測TFV對肝癌HepG-2細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響 參照1.3.2法設(shè)置陰性對照組、陽性對照組、TFV組(100、150、200 mg/L)、空白對照組。培養(yǎng)24 h后，將懸浮和貼壁細(xì)胞收集于1.5 ml EP管中，4℃的70% 冰乙醇固定24 h后，經(jīng)PI染色，EPICS-XL型流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析。Annexin V/PI雙染色法檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.3.5 Western 印跡方法檢測NF-κB p65和IκB-α蛋白的表達(dá) 參照1.3.2法設(shè)置陰性對照組、陽性對照組、TFV組(100、150、200 mg/L)和空白對照組。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后終止培養(yǎng)，常規(guī)方法提取蛋白質(zhì)，Bradford 法測定總蛋白的量。SDS-PAGE凝膠電泳，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫封閉 1 h。5%山羊血清(PBS 稀釋)封閉，室溫孵育 60 min；加入 1∶300 稀釋(1% BSA-PBS 稀釋)的 NF-κBp65和IκBα一抗，1∶500 稀釋的 β-actin，4℃孵育過夜，加入抗 NF-κBp65和IκBα 二抗(1∶3 000)和β-actin 二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h。行ECL反應(yīng)，顯色。以同一泳道NF-κBp65、 IκBα和 β-actin 條帶灰度值比反映蛋白表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行χ2檢驗及方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 TFV對肝癌HepG-2細(xì)胞的毒性作用 TFV對 HepG-2 細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒性作用，藥物的濃度-抑制率曲線呈 S形，符合 Logistic曲線。根據(jù)生長抑制率采用綜合法計算半數(shù)抑制量 IC50，MTT 結(jié)果顯示TFV對 HepG-2 細(xì)胞的 IC50值為 229.04 mg/L。

2.2 TFV對HepG-2生長速度及凋亡的影響 與陰性對照組比較，TFV組抑制HepG-2細(xì)胞的增長明顯，并具有濃度依賴性，其中200 mg/L濃度抑制效果尤其明顯(P<0.01)，與HepG-2陽性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而0.1%DMSO對HepG-2細(xì)胞的增長影響較小。與陰性對照組比較，TFV可以促進(jìn)HepG-2細(xì)胞凋亡(P<0.01，P<0.05)，且具有濃度依賴性，其中200 mg/L濃度促進(jìn)效果明顯(P<0.01)，與陽性對照組無差異(P>0.05)。見表1。

2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 陰性對照組和溶媒對照組HepG-2細(xì)胞增殖旺盛，排列整齊，細(xì)胞飽滿，呈現(xiàn)星形或梭形，折光度好；而TFV組和陽性對照組細(xì)胞與陰性對照組比較，形態(tài)改變明顯，細(xì)胞間隙增加，細(xì)胞排列混亂，細(xì)胞體積明顯發(fā)生改變，胞內(nèi)顆粒增加，部分細(xì)胞脫落，數(shù)目減少，細(xì)胞碎片增加。其中TFV組伴隨濃度變化更加明顯。見圖1。

2.4 TFV對HepG-2細(xì)胞周期的影響 經(jīng) TFV處理24 h，與陰性對照組相比，G0/G1 期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)逐漸減少，而 S期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)逐漸增加(P<0.05或<0.01),同時 G2/M 期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)也逐漸增加(P<0.05)，并具有濃度依賴性，說明TFV 能造成HepG-2細(xì)胞S期和G2/M期阻滯。見表2。

表1 TFV對HepG-2生長速度的影響

與陰性對照組比較:1)P<0.01,2)P<0.05;下表同

圖1 TFV對HepG-2生長形態(tài)的影響(HE，×200)

2.5 TFV對HepG-2細(xì)胞NF-κBp65、IκB-α蛋白表達(dá)的影響 TFV處理24 h之后,HepG-2細(xì)胞中NF-κBp65的蛋白表達(dá)量較陰性對照組NF-κBp65蛋白表達(dá)量明顯下降(P<0.05或P<0.01)，TFV組HepG-2細(xì)胞中IκB-α蛋白表達(dá)水平較陰性對照組IκB-α蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)，并呈濃度依賴性，與陽性對照組比較無差異(P>0.05)。見表2、圖2。

表2 TFV對HepG-2細(xì)胞周期的影響

A：陰性對照組；B：陽性對照組;C、D、E：200、150、100 mg/L TFV組 圖2 TFV對細(xì)胞NF-κBp65、IκB-α蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

肝癌是常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率較高，并出現(xiàn)上升趨勢。目前手術(shù)治療及放療、化療等已取得較大進(jìn)展，但治療后高復(fù)發(fā)和高轉(zhuǎn)移率影響治療效果。因此，采用天然、安全和高效低毒的天然藥物進(jìn)行抗癌治療具有重要意義〔3〕。TFV為天然的抗炎抗腫瘤藥物，具有抗癌、抗腫瘤、消心腦血管疾病、抗炎鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫力、降血糖、治療骨質(zhì)疏松、抑菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗輻射等作用〔4〕。

本實驗提示TFV能顯著抑制肝癌HepG-2 細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)部分細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生碎片或變小。這與朱利群等〔5〕研究結(jié)果一致，顯示TFV對癌細(xì)胞的增殖抑制及凋亡促進(jìn)作用。本研究結(jié)果表明TFV可能通過某種方式影響了HepG-2 細(xì)胞DNA的合成或造成DNA的損傷，最終導(dǎo)致DNA復(fù)制不完全，提示可通過阻滯HepG-2細(xì)胞的周期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡是一個錯綜復(fù)雜的過程，而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡在抗腫瘤治療中具有重要作用。NF-κBp65、IκB-α蛋白表達(dá)在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，NF-κB為核轉(zhuǎn)錄因子，以同源或異源二聚體形式存在，多數(shù)為p50和p65組成的二聚體組成參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔6〕，調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及惡性轉(zhuǎn)化，其活性受到 IκB的抑制，在某些刺激因素刺激下IκB 可發(fā)生磷酸化而失活，NF-κB被激活，并進(jìn)入細(xì)胞核結(jié)合于特異基因，調(diào)控基因進(jìn)行表達(dá)，參與細(xì)胞周期和 DNA 復(fù)制，上調(diào)存活基因或抑制促凋亡因子，保護(hù)細(xì)胞免于凋亡〔7〕。IκB 是NF-κB強抑制物，已證實NF-κB 的活化對腫瘤細(xì)胞抵抗凋亡是必需的〔8〕，而IκB可通過抑制 NF-κB 活性而抑制體外實體瘤細(xì)胞的生長，并導(dǎo)致腫瘤發(fā)生率明顯減低，說明 NF-κB 和 IκB 的表達(dá)失衡是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵〔9〕。本研究結(jié)果提示TFV能通過這增加 IκB的表達(dá)、抑制IκB的降解、抑制NF-κB活性來調(diào)控HepG-2細(xì)胞的增殖，通過對細(xì)胞周期和DNA復(fù)制的影響，下調(diào)編碼抗凋亡作用的細(xì)胞因子，誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，TFV明顯抑制人肝癌HepG-2細(xì)胞增殖，通過對細(xì)胞周期和DNA復(fù)制的影響，細(xì)胞周期阻滯在S和G2/M期，推測TFV通過影響NF-κB 和 IκB 的表達(dá)誘導(dǎo)人肝癌HepG-2細(xì)胞凋亡，具有明顯的體外抗肝癌活性。

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〔2015-04-13修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

河南省高等學(xué)校青年骨干教師資助計劃項目(No.2015GGJS-288)；漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校2015年度基礎(chǔ)科學(xué)研究項目(No.2015-S-LMC03)

1 漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校生化教研室

任麗平(1984-)，女，講師，碩士，主要從事藥理藥效研究。

R966

A

1005-9202(2016)19-4721-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.022