針刺對(duì)圍絕經(jīng)期大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Fas蛋白表達(dá)的影響

曹俊紅

(河南省中醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450002)

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針刺對(duì)圍絕經(jīng)期大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Fas蛋白表達(dá)的影響

曹俊紅

(河南省中醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450002)

目的 探討針刺對(duì)圍絕經(jīng)期大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡及B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)蛋白、介導(dǎo)細(xì)胞凋亡蛋白(Fas)表達(dá)的影響及針刺治療圍絕經(jīng)期綜合征的作用機(jī)制。方法 從32只SD雌性大鼠中篩選出符合圍絕經(jīng)期特征的SD雌性大鼠24只，隨機(jī)分為針刺組、藥物組、圍絕經(jīng)期組，各8只，另選擇8只5個(gè)月雌性SD大鼠作為青年大鼠組，采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL法)、免疫組化法檢測(cè)卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡及Bcl-2、Fas表達(dá)，采用IMS細(xì)胞圖像分析法對(duì)染色圖像進(jìn)行分析，對(duì)各組陽(yáng)性染色面積均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)比各組組間的差異。結(jié)果 與青年大鼠組相比，圍絕經(jīng)期大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡、Bcl-2蛋白表達(dá)、Fas蛋白表達(dá)均具有極顯著差異(P<0.01)；針刺治療后大鼠體內(nèi)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡減少(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)提高(P<0.05)，F(xiàn)as蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，針刺組與藥物組之間大鼠體內(nèi)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡、Bcl-2蛋白及Fas蛋白的表達(dá)無(wú)顯著性差異(P>0.05)。結(jié)論 針刺具有抑制圍絕經(jīng)期大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡、增加Bcl-2蛋白表達(dá)及降低Fas蛋白表達(dá)的作用。

針刺；圍絕經(jīng)期；顆粒細(xì)胞；B淋巴細(xì)胞瘤-2基因；介導(dǎo)細(xì)胞凋亡蛋白

圍絕經(jīng)期又稱(chēng)女性更年期，是女性生殖功能由旺盛走向衰退的階段。在此期間，女性身體內(nèi)卵泡加劇閉鎖、數(shù)量減少，導(dǎo)致雌性激素分泌不足，卵巢逐漸停卵并走向功能衰竭〔1〕?，F(xiàn)代研究表明，卵泡閉鎖與細(xì)胞的凋謝密不可分，其中顆粒細(xì)胞的大量凋亡直接誘使卵泡閉鎖急劇化，雌性激素分泌減少，雌二醇水平降低〔2〕。本研究采用針刺療法干預(yù)大鼠體內(nèi)顆粒細(xì)胞的凋亡，為針刺治療圍絕經(jīng)期綜合征的作用機(jī)制研究提供方向。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 選取11～14個(gè)月SD雌性大鼠32只，體重(380±20)g；5個(gè)月SD雌性大鼠8只，體重(300±20)g，均由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(質(zhì)量合格證號(hào)：滬醫(yī)動(dòng)證字05號(hào))。

1.2 儀器與試劑 毫針(直徑0.22 mm，長(zhǎng)13 mm，購(gòu)于蘇州華佗醫(yī)療器械有限公司)，石蠟切片機(jī)(型號(hào)HAQ-78J，北京科譽(yù)興業(yè)科技發(fā)展有限公司)，萬(wàn)能顯微鏡(型號(hào)LR66238，OPTON)，攝像機(jī)(型號(hào)HC-X920MGK-K，Panasonic)，電熱恒溫水溫箱(型號(hào)HH.W21.600S，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，電子天平(型號(hào)UTP313，上?；ǔ彪娖饔邢薰?；IMS醫(yī)用圖像分析系統(tǒng)；更年安片(華潤(rùn)三九藥業(yè)有限公司)，Envision免疫組化試劑，Bcl-2，F(xiàn)as抗體(美國(guó)Santacruz公司)，其他試劑均由實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 方法

1.3.1 圍絕經(jīng)期大鼠模型的確立 參照文獻(xiàn)〔3〕，對(duì)雌性SD大鼠進(jìn)行陰道組織采樣，并于顯微鏡下觀察HE染色后組織學(xué)變化，連續(xù)15 d，動(dòng)情周期呈無(wú)規(guī)律變化的大鼠確立為圍絕經(jīng)期大鼠模型。

1.3.2 分組處理 根據(jù)陰道組織采樣法，從32只雌性大鼠中篩選出符合圍絕經(jīng)期特征的雌性大鼠24只，隨機(jī)分為針刺組、藥物組、圍絕經(jīng)期組，每組8只。針刺組：參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》相關(guān)方法，對(duì)大鼠“腎俞”、“足三里”及“三陰交”進(jìn)行針刺處理，進(jìn)針深度分別為0.5 cm、0.3 cm、0.3 cm，小幅捻轉(zhuǎn)后，留針20 min，1次/d，治療15次〔4〕。藥物組：參照人與動(dòng)物藥用計(jì)量換算方法，將更年安片制成濃度為12%的混懸液，對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃處理，1次/d，治療15次。5個(gè)月雌性SD大鼠作為青年大鼠組，與圍絕經(jīng)期組均只進(jìn)行抓取刺激，1次/d，持續(xù)15次〔5〕。

1.3.3 樣本采集 治療結(jié)束后，斷頭處死所有大鼠，迅速取出右側(cè)卵巢，10%甲醛固定后，石蠟包埋切片，備用。

1.3.4 指標(biāo)檢測(cè)方法 采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL法)、免疫組化法卵巢顆粒細(xì)胞凋亡和B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(bcl-2)、介導(dǎo)細(xì)胞凋亡蛋白(Fas)表達(dá)。

1.3.5 評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) 以切片中卵巢顆粒細(xì)胞染色的深淺程度作為判定依據(jù)，對(duì)各組卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行比較；以被染色卵巢顆粒細(xì)胞染色面積作為指標(biāo)，采用IMS細(xì)胞圖像分析法對(duì)其均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件計(jì)量資料組間比較采用單因素方差分析，方差檢驗(yàn)齊者用LSD法，方差不齊者用Games-Howell法檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用Ridit檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的檢測(cè)結(jié)果 圍絕經(jīng)期大鼠體內(nèi)卵巢顆粒細(xì)胞顏色普遍較深，多呈棕褐色；針刺組和藥物組次之，多呈棕色或淺棕色；青年大鼠組顏色最淺。在卵巢顆粒細(xì)胞凋亡對(duì)比中，圍絕經(jīng)期組與青年大鼠組有極顯著性差異(P<0.01)，圍絕經(jīng)期與針刺組具有顯著性差異(P<0.05)，藥物組與絕圍經(jīng)期組、藥物組與針刺組均無(wú)顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)圖1，表1。

2.2 卵巢顆粒細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 圖2可見(jiàn)，圍絕經(jīng)期大鼠體內(nèi)卵巢顆粒細(xì)胞Bcl-2蛋白染色普遍較淺；針刺組與藥物組顏色較深，呈淺棕色、棕黃色；青年大鼠組顏色最深，多呈棕褐色。在卵巢顆粒細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)對(duì)比中，圍絕經(jīng)期組與青年大鼠組具有極顯著性差異(P<0.01)，圍絕經(jīng)期與針刺組、藥物組具有顯著性差異(P<0.05)，針刺組與藥物組無(wú)顯著性差異(P>0.05)，見(jiàn)表1。表明圍絕經(jīng)期大鼠體內(nèi)卵巢顆粒細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)低于青年大鼠組，針刺和藥物可提高卵巢顆粒細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)，兩者治療效果差別不明顯。見(jiàn)圖2。

圖1 卵巢顆粒細(xì)胞(TUNEL染色，×400)

圖2 卵巢顆粒細(xì)胞Bcl-2表達(dá)(免疫組化染色，×400)

2.3 卵巢顆粒細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 圍絕經(jīng)期大鼠體內(nèi)卵巢顆粒細(xì)胞Fas蛋白染色較深，針刺組與藥物組顏色次之，多呈先棕色或淺棕色 青年大鼠組最深，呈褐色或棕褐色。圍絕經(jīng)期組與青年大鼠組、針刺組、藥物組均具有極顯著性差異(P<0.01)，針刺組與藥物組無(wú)顯著性差異(P>0.05)，見(jiàn)表1，圖3。

表1 各組卵巢顆粒細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Fas蛋白表達(dá)結(jié)果

與圍絕經(jīng)期組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

圖3 卵巢顆粒細(xì)胞Fas表達(dá)(免疫組化染色，×400)

3 討 論

圍絕經(jīng)期是女性絕經(jīng)前一段時(shí)間，多伴隨著月經(jīng)紊亂、抑郁、煩躁、失眠、潮熱、盜汗、骨質(zhì)疏松等癥狀，隨著現(xiàn)代社會(huì)生活壓力增大，圍絕經(jīng)期綜合征已經(jīng)成為影響患者的身心健康和家庭和睦的一個(gè)主要因素，成為醫(yī)學(xué)界亟待解決的重大疾患之一〔6〕。中醫(yī)根據(jù)對(duì)圍絕經(jīng)期綜合征的辨證論治，認(rèn)為腎虛該病之本〔7〕；臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)中藥及體針治療對(duì)更年期綜合征均具有較好的治療效果，其中針刺療效高，副作用小，易于操作，易于患者接受，具有廣闊的發(fā)展前景〔8〕。

近年來(lái)，有學(xué)者分別從器官、基因等方面對(duì)圍絕經(jīng)期綜合征進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究〔9〕，發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)前，女性卵巢內(nèi)顆粒細(xì)胞不斷的增殖與分化，為卵泡細(xì)胞的發(fā)育、成熟提供有利環(huán)境，成熟卵泡的數(shù)量維持在生殖需要的正常范圍內(nèi)，卵巢功能正常運(yùn)行。進(jìn)入圍絕經(jīng)期，卵巢內(nèi)顆粒細(xì)胞不斷凋亡，導(dǎo)致卵泡發(fā)生強(qiáng)烈閉鎖，無(wú)法回到正常發(fā)育軌道，數(shù)量也急劇減少，患者體內(nèi)雌激素、孕激素水平降低，卵巢功能緩慢走向衰竭。因此，卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡與卵巢的衰退具有密不可分的聯(lián)系。而卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡是由多基因共同參與調(diào)控的結(jié)果，如Bcl-2蛋白、Fas蛋白、P53等，其中Bcl-2具有抑制凋亡作用，顆粒細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)與卵泡的閉鎖相關(guān)。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)圍絕經(jīng)期大鼠卵巢內(nèi)顆粒細(xì)胞凋亡和Fas蛋白表達(dá)均明顯高于青年大鼠組，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著低于青年大鼠，針刺和藥物治療都具有抑制卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，提高卵巢顆粒細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)，抑制Fas蛋白的表達(dá)的作用，提高體內(nèi)雌性激素水平，其中針刺治療組效果要略?xún)?yōu)于藥物治療組，但結(jié)果不具有顯著性差異。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，針刺治療圍絕經(jīng)期綜合征可能是通過(guò)抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)Bcl-2基因、Fas基因的表達(dá)，減緩卵泡的閉鎖性衰退過(guò)程，增加了體內(nèi)卵泡發(fā)育成熟的幾率，使得患者體內(nèi)雌性激素水平提高而發(fā)揮治療效果。

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2 Frye JB，Lukefahr AL，Wright LE，etal.Modeling perimenopause in Sprague-Dawley rats by chemical manipulation of the transition to ovarian failure〔J〕.Comp Med，2012；62(3)：193-202.

3 Shengqiang L，Wenna L，Yachan L，etal.Effect of Chaihushugan San on expression of the Raf/mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase pathway in the hippocampi of perimenopausal rats induced by immobilization stress〔J〕.J Tradit Chin Med，2015；35(4)：445-52.

4 余光曙.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：75-82.

5 張大方，金若敏.藥理與中藥藥理實(shí)驗(yàn)〔M〕.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出社，2008：6.

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〔2015-11-09修回〕

(編輯 袁左鳴)

曹俊紅(1973-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)婦產(chǎn)科方面的研究。

R71

A

1005-9202(2016)19-4714-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.019