P16蛋白在不同年齡小鼠卵巢中的表達(dá)變化及其與氧化應(yīng)激的關(guān)系

彭 璇 陳宗海 嚴(yán)米婭 田 勇

(湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，湖北 恩施 445000)

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P16蛋白在不同年齡小鼠卵巢中的表達(dá)變化及其與氧化應(yīng)激的關(guān)系

彭 璇 陳宗海 嚴(yán)米婭 田 勇1

(湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，湖北 恩施 445000)

目的 研究P16蛋白在不同年齡小鼠卵巢組織中的表達(dá)變化及其與卵巢衰老過(guò)程中氧化應(yīng)激的關(guān)系。方法 選用12、24、36、48周齡自然衰老C57BL/6小鼠為模型。通過(guò)測(cè)定8羥基脫氧鳥(niǎo)苷(8-OHdG)的含量變化來(lái)反映卵巢組織氧化損傷程度。采用免疫組織化學(xué)方法分別檢測(cè)各組小鼠卵巢中P16蛋白、8-OHdG的表達(dá)和分布。結(jié)果 P16和8-OHdG在卵巢間質(zhì)中均隨增齡表達(dá)增加，12周齡表達(dá)明顯低于其他各組(P<0.01)；48周齡與24周齡、36周齡分別進(jìn)行比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而在各年齡組不同級(jí)別卵泡的顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞中均未發(fā)現(xiàn)二者的表達(dá)。P16的表達(dá)和8-OHdG的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.998，P<0.01)。結(jié)論 P16蛋白在小鼠卵巢組織衰老過(guò)程中的表達(dá)呈上升趨勢(shì)，這種變化與卵巢氧化應(yīng)激增加有關(guān)。

P16蛋白；8羥基脫氧鳥(niǎo)苷；氧化應(yīng)激；衰老；卵巢

P16基因可以通過(guò)兩條相關(guān)的途徑來(lái)抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展：一是通過(guò)促進(jìn)DNA損傷的修復(fù)介導(dǎo)細(xì)胞周期的停滯，二是控制細(xì)胞內(nèi)能引起DNA氧化損傷的活性氧簇(ROS)的募集〔1〕。自由基衰老理論提出機(jī)體ROS的大量募集可以攻擊生命大分子物質(zhì)，使其功能發(fā)生改變，最終引起組織器官的功能減退或消失，即衰老的發(fā)生。但是卵巢的衰老有其自身的特點(diǎn)，其發(fā)生發(fā)展機(jī)制還未完全清楚。P16基因在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激所致組織細(xì)胞衰老中發(fā)揮了重要的作用。另外自由基衰老理論提出活性氧自由基損傷組織器官中的DNA可以產(chǎn)生大量的8羥基脫氧鳥(niǎo)苷(8-OHdG)，其含量可代表組織細(xì)胞中氧化損害嚴(yán)重程度，是目前公認(rèn)的氧化損傷標(biāo)志物之一〔2〕。而P16基因在卵巢中的表達(dá)及與自由基氧化損傷在卵巢衰老過(guò)程的相互作用尚不清楚。本研究探討P16和自由基DNA氧化損傷產(chǎn)物8-OHdG在卵巢中的表達(dá)變化及二者在卵巢衰老中的相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 12、24、36、48周齡的雌性C57BL/6小鼠(北京華阜康生物科技有限公司提供，飼養(yǎng)于湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物房)，進(jìn)行陰道涂片選取動(dòng)情間期，以10%速眠新Ⅱ0.08 ml/g腹腔注射麻醉，偏背取正中切口，分離雙側(cè)卵巢，去包膜留取卵巢組織，4%多聚甲醛固定。

1.2 免疫組織化學(xué)染色 采用鏈霉親和素-生物素復(fù)合物技術(shù)(SP)法:卵巢組織經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋；常規(guī)脫蠟至水，PBS浸泡后3%過(guò)氧化氫孵育20 min，PBS洗3次，每次5 min，抗原修復(fù)10 min，PBS洗3次，每次5 min，5%正常山羊血清37℃封閉30 min后加入兔P16單克隆抗體和小鼠8-OHdG單克隆抗體(美國(guó)Abcam公司ab62623)，4℃過(guò)夜，PBS洗3次后加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育25 min，PBS洗3次后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，室溫孵育20 min，PBS洗3次，DAB顯色，充分沖洗后蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片,顯微鏡下觀察。

1.3 結(jié)果判讀 根據(jù)染色細(xì)胞所占面積和細(xì)胞染色強(qiáng)度兩項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)分判斷。染色細(xì)胞面積評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分染色細(xì)胞<5%；1分染色細(xì)胞5%～25%；2分染色細(xì)胞25.1%～50%；3分染色細(xì)胞50.1%～75%；4分染色細(xì)胞>75%。細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：不顯色0分；淺黃色1分；棕黃色2分；深棕色3分。綜合評(píng)分=(染色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)+細(xì)胞染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù))/2，0～0.5為(-)；0.6～1.5(+)；1.6～2.5為()；>2.5為()。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行秩和檢驗(yàn)、Kruskal Wallis檢驗(yàn)、Mann-Whitney檢驗(yàn)，兩因素相關(guān)分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)。

2 結(jié) 果

2.1 P16蛋白在卵巢組織中的表達(dá) P16蛋白在卵巢中主要表達(dá)于圍繞卵泡周?chē)拈g質(zhì)，各級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞及卵母細(xì)胞中未見(jiàn)明顯表達(dá)，見(jiàn)圖1。卵巢間質(zhì)細(xì)胞中的P16蛋白隨增齡其表達(dá)逐漸增強(qiáng)，各年齡組總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；12周齡與其他各周齡分別比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；48周齡與其他各周齡比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而24、36周齡組間進(jìn)行比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 8-OHdG蛋白在卵巢組織中的表達(dá) 8-OHdG蛋白在卵巢中主要定位于間質(zhì)，在24 w、48 w的始基卵泡和初級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞及卵母中可略見(jiàn)表達(dá)，而在次級(jí)卵泡和竇狀卵泡中未見(jiàn)明顯表達(dá)，見(jiàn)圖1。卵巢間質(zhì)細(xì)胞中8-OHdG蛋白隨著年齡的增加其表達(dá)顯著增強(qiáng)，各年齡組總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；12周齡與其他各周齡分別比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；48周齡與其他各周齡比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而24、36周齡組間進(jìn)行比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 P16蛋白和8-OHdG蛋白在卵巢組織中表達(dá)的相互關(guān)系 卵巢組織中P16蛋白表達(dá)-34例，+7例，14例，15例；8-OHdG蛋白表達(dá)-35例，+7例，15例，2例，卵巢組織中P16蛋白和8-OHdG蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.998，P<0.01)。

表1 P16蛋白在不同周齡小鼠卵巢間質(zhì)的表達(dá)(n=15，n)

與12周齡組比較：1)P<0.05；與24周齡組比較：2)P<0.05，下表同

表2 8-OHdG蛋白在不同周齡小鼠卵巢間質(zhì)的表達(dá)(n=15，n)

圖1 P16蛋白、8-OHdG蛋白在不同周齡小鼠卵巢組織中的表達(dá)變化(DAB，×400)

3 討 論

P16基因是一種抑癌基因，通過(guò)抑制CDK4/6活性，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在G1期；同時(shí)P16蛋白的表達(dá)增加可以看作細(xì)胞衰老的一種標(biāo)志。8-OHdG是ROS引起DNA氧化損傷的代謝產(chǎn)物，其表達(dá)的增加可以引起相應(yīng)組織細(xì)胞的功能減退，加快衰老的發(fā)生，因此它可作為多種組織細(xì)胞衰老的標(biāo)志物。體外研究結(jié)果顯示 P16蛋白表達(dá)增加與氧化應(yīng)激所致造血干細(xì)胞、神經(jīng)祖細(xì)胞、成纖維細(xì)胞，胰島細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞的衰老密切相關(guān)〔2〕。另外，體內(nèi)外各種傷害性刺激如氧自由基，電離輻射、紫外線(xiàn)等均能誘導(dǎo)P16蛋白的高表達(dá)，并且這些條件導(dǎo)致的P16蛋白表達(dá)的增加與多條細(xì)胞信號(hào)通路相關(guān)〔1，3〕。但是Adiam等〔4〕學(xué)者在禿頂患者皮膚乳頭細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激引起細(xì)胞衰老是通過(guò)P16/RB通路介導(dǎo)的；Choi等〔5〕學(xué)者還發(fā)現(xiàn)P16調(diào)節(jié)人類(lèi)皮膚腫瘤細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激可以通過(guò)染色質(zhì)重塑因子BRG1、 RAS-JNK-JUN-AP-1信號(hào)通路來(lái)調(diào)控。上述文獻(xiàn)提示通過(guò)P16調(diào)節(jié)ROS可能高度依賴(lài)于細(xì)胞所處的環(huán)境和細(xì)胞本身的功能狀態(tài)。

本研究結(jié)果顯示P16蛋白主要表達(dá)于卵巢間質(zhì)，且隨增齡表達(dá)增加，而在顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞以及卵泡膜細(xì)胞中表達(dá)甚少，未表現(xiàn)出增齡改變。Janzen等〔6〕發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增加骨髓干細(xì)胞中的P16蛋白表達(dá)上調(diào)，并且其在調(diào)節(jié)干細(xì)胞的增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用；Baker等〔7〕通過(guò)對(duì)高表達(dá)P16蛋白的細(xì)胞進(jìn)行P16蛋白沉默之后，發(fā)現(xiàn)衰老細(xì)胞又重新恢復(fù)生理活性，衰老相關(guān)的表型也隨之減輕或者消失。Jinhwan等〔8〕報(bào)道，卵巢中氧化損傷產(chǎn)物在間質(zhì)的表達(dá)隨增齡變化，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其抗氧化酶基因隨增齡表達(dá)下降，這與本研究結(jié)果相一致。同時(shí)本研究顯示P16蛋白和8-OHDG蛋白在卵巢組織中的表達(dá)呈正相關(guān)。這些結(jié)果說(shuō)明氧化損傷引起卵巢功能改變主要是引起間質(zhì)的變化，而這種變化與P16蛋白的表達(dá)密切相關(guān)。Krishnamurthy等〔9〕報(bào)道P16蛋白隨增齡表達(dá)增加導(dǎo)致了前腦祖細(xì)胞和神經(jīng)形成能力降低。但是P16蛋白在氧化應(yīng)激引起卵巢衰老的過(guò)程中是通過(guò)何種途徑還不清楚。因此如果能找到一個(gè)復(fù)雜的抑制和激活P16蛋白關(guān)鍵調(diào)節(jié)點(diǎn)并加以適當(dāng)調(diào)控可能是控制卵巢衰老發(fā)生的關(guān)鍵所在。目前在對(duì)P16基因的調(diào)控過(guò)程還沒(méi)有一個(gè)統(tǒng)一的定論，P16蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)是一個(gè)復(fù)雜的機(jī)制，它涉及外遺傳學(xué)控制和眾多的轉(zhuǎn)錄因子，核心蛋白復(fù)合體(PRC)1/2以及組蛋白脫乙酰基酶在抑制P16蛋白的表達(dá)中都發(fā)揮了重要的作用〔10〕。因此我們推測(cè)P16蛋白高表達(dá)可能參與調(diào)節(jié)活性氧自由基引起的卵巢衰老過(guò)程，二者共同引起卵巢衰老的發(fā)生。而P16蛋白是如何調(diào)控卵巢衰老及在卵巢中P16蛋白表達(dá)受何種機(jī)制調(diào)控都應(yīng)是以后研究的重點(diǎn)方向。

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〔2015-05-03修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

1 恩施州中心醫(yī)院婦產(chǎn)科

彭 璇(1981-)，女，副教授，在讀博士，主要從事基因免疫的發(fā)生機(jī)制研究。

R310.4430

A

1005-9202(2016)19-4712-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.018