激活Notch信號的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對心肌梗死模型鼠炎性因子與心功能的影響

朱玲軍 項(xiàng)美香 王建安

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科，浙江 杭州 310009)

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激活Notch信號的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對心肌梗死模型鼠炎性因子與心功能的影響

朱玲軍 項(xiàng)美香 王建安

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科，浙江 杭州 310009)

目的 探討激活Notch信號的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)移植對心肌梗死(MI)模型鼠炎性因子與心功能的影響。方法 66只Wistar 大鼠通過結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)制作MI模型，其中60只建模成功，2 w后再將其隨機(jī)分為激活Noth 信號的MSCs 移植組、MSCs 移植組、培養(yǎng)液移植組及MI 模型組，即E、D、C、B組，每組各15只，分別采取相應(yīng)的處理。另選取10只Wistar大鼠作為對照組(A組)，給予假手術(shù)處理。移植后4 w，所有大鼠均行超聲心動(dòng)圖檢查及心臟組織免疫組織化學(xué)染色，測量大鼠各項(xiàng)心功能指標(biāo)及炎性細(xì)胞因子表達(dá)情況，并進(jìn)行比較。結(jié)果 移植4 w后，B、C、D、E組大鼠的LVEF、LVFs較A組降低，LVDd、LVDs較A組增高；而E組大鼠的LVEF、LVFs則較B、C、D組增加，LVDd、LVDs較B、C、D組降低(P<0.05)。B、C、D、E組大鼠的IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)水平均較A組明顯增加，而E組大鼠的IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)水平較B、C、D組明顯降低(P<0.05)。結(jié)論 MSCs移植既能改善MI大鼠的心功能，又能使炎性因子表達(dá)水平明顯下調(diào)，尤以激活Notch信號的MSCs移植效果更佳，表明Notch信號激活可促進(jìn)MSCs移植作用。

Notch信號；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；心肌梗死；心功能

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是一種具有自我更新、分化增殖和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，對損傷組織的再生及修復(fù)十分有幫助；此外，MSCs還具有來源豐富、取材方便等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于急性心肌梗死(MI)的治療〔1〕。多數(shù)學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)，急性MI經(jīng)MSCs移植治療后，不僅心肌瘢痕明顯減少，且心室重構(gòu)也明顯抑制，故心功能得到改善〔2〕。MI后心室重構(gòu)的發(fā)生和發(fā)展與機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，出現(xiàn)高表達(dá)的炎性細(xì)胞因子。許多體內(nèi)外研究顯示MSCs的免疫學(xué)特性較為獨(dú)特，能對多種免疫細(xì)胞的功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，并在相關(guān)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)中起調(diào)節(jié)作用，故MSCs移植可調(diào)節(jié)心肌梗死后炎癥反應(yīng)〔3〕。Notch 信號是對細(xì)胞命運(yùn)起關(guān)鍵作用的一種信號通路，主要參與細(xì)胞與細(xì)胞之間直接作用。已有報(bào)道顯示，在MSCs的分化中，Notch信號具有很好的調(diào)控作用，故Notch信號的激活參與MSCs移植后生物學(xué)功能的發(fā)揮〔4〕。本研究擬觀察激活Notch信號的BMSCs移植對MI后心功能及炎性因子表達(dá)的影響。

1 資料與方法

1.1 材料 美國Hyclone 公司生產(chǎn)的DMEM/F12 培養(yǎng)液，美國Roche 公司生產(chǎn)的4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，克隆人Notch1 ICN基因構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(pLXSN-ICN)，武漢博士的公司提供的兔抗大鼠多克隆抗體白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α抗體。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供及培養(yǎng)的76只質(zhì)量為200～250 g的Wistar 大鼠作為實(shí)驗(yàn)對象，雌雄各半，選取其中10只進(jìn)行假手術(shù)處理，作為對照組；66只進(jìn)行MI模型的建立，共60只成活，按隨機(jī)數(shù)表法將其分為B、C、D、E四組，每組各15只，分別給予不同的處理，B組僅為MI模型，未給予其他處理，C組進(jìn)行培養(yǎng)液移植，D組進(jìn)行MSCs 移植，E組進(jìn)行激活Noth 信號的MSCs 移植。

1.3 建立大鼠MI模型 MI模型的建立采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)的方法進(jìn)行。先稱重，再腹腔內(nèi)注射麻醉，麻藥選取30 g/L戊巴比妥鈉，劑量為1.5 ml/kg。麻醉后將大鼠固定在操作臺上，消毒頸、胸部手術(shù)區(qū)域，行氣管切開后氣管插管并與呼吸機(jī)連接。選擇左前第3～4肋間隙距胸骨左緣4～5 mm處進(jìn)行開胸手術(shù)，手術(shù)在心電圖監(jiān)護(hù)下完成，心包打開后心臟暴露出來，在左心耳尖3～4 mm處對LAD進(jìn)行結(jié)扎處理。結(jié)扎完畢后觀察心電圖變化，若出現(xiàn)R波振幅升高、ST段弓背向上抬高，即可說明MI模型建立成功。結(jié)束操作后逐層關(guān)閉胸腔并縫合，自主呼吸恢復(fù)后撤離呼吸機(jī)并拔除氣管插管，術(shù)后給予抗感染治療，放入無菌、恒溫籠中飼養(yǎng)。

1.4 MSCs的分離培養(yǎng)及標(biāo)記 脫頸處死雄性Wistar大鼠并置于75%酒精中浸泡15 min，在無菌條件下將股骨和脛骨分離取出，并將周圍的肌肉組織完全剔除干凈。采用DMEM/F12培養(yǎng)液對骨髓腔進(jìn)行反復(fù)沖洗，并將得到的細(xì)胞懸液放入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行接種，置于孵箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。培養(yǎng)72 h后，換掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液將未貼壁細(xì)胞去除，之后換液每2 d進(jìn)行1次。待瓶底80%被貼壁細(xì)胞覆蓋時(shí)采用0.25%的胰酶進(jìn)行消化，并傳代，將3～6代大鼠MSCs細(xì)胞收集起來。在移植前對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，將無菌DAPI，50 mg/L加入重懸細(xì)胞中進(jìn)行孵育，37℃下30 min，完成后采用磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行離心洗滌，共6次。

1.5 構(gòu)建重組pLXSN-ICN 采用克隆人Notch1 ICN 基因進(jìn)行pLXSN-ICN的構(gòu)建，載體構(gòu)建完成轉(zhuǎn)染到MSCs細(xì)胞中。

1.6 MSCs 移植 MI模型建立2 w后，于原切口開胸進(jìn)入，用微量注射器吸取細(xì)胞懸液0.2 ml(細(xì)胞總數(shù)為1 ×106)并沿梗死區(qū)與正常心肌交界處多點(diǎn)注射到左心室前壁。培養(yǎng)液移植組采用同樣的方法進(jìn)行心室內(nèi)移植，但注入的是不含細(xì)胞的等量DMEM 培養(yǎng)液；假手術(shù)組以同樣的方法將等量DMEM 培養(yǎng)液多點(diǎn)注射到心前壁。

1.7 心功能檢測 移植4 w后，在麻醉狀態(tài)下，采用Sequoia 512型超聲儀對大鼠進(jìn)行心臟超聲檢查，探頭頻率為10 MHz，超聲檢查下可獲得胸骨旁左室長軸和乳頭肌水平短軸切面，對左心室舒張末徑(LVDd)、收縮末徑(LVDs)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)及短軸縮短率(LVFS)等指標(biāo)進(jìn)行測量。

1.8 免疫組織化學(xué)檢測 心功能檢測完畢后，迅速開胸取出心臟，將其表面的包膜及脂肪組織清除掉，并用冰鹽水沖洗，沖洗干凈后對標(biāo)本進(jìn)行固定，置于40 g/L甲醛溶液中24 h，24 h后依次進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、常規(guī)石蠟包埋及連續(xù)切片等處理，切片厚度保持在3 μm，分別使用抗IL-1β 、IL-6 、TNF-α抗體對石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，操作嚴(yán)格按照說明書上的步驟進(jìn)行。在光學(xué)顯微鏡下對切片進(jìn)行觀察，若細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色，即為陽性(+)表達(dá)的細(xì)胞。每張切片在顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野計(jì)算陽性率，并取平均值。

1.9 觀察指標(biāo) 檢測各組大鼠移植4 w后的心功能指標(biāo)及心肌炎性因子表達(dá)情況，指標(biāo)包括LVEF、LVDd、LVDs、LVFS、IL-1β、IL-6、TNF-α。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件，計(jì)量資料兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間差異比較采用方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠術(shù)后4 w心功能指標(biāo)的比較 術(shù)后4 w，與A組比較，B、C、D、E組大鼠的LVEF、LVFS均明顯下降，以E組的下降幅度最??；B、C、D、E組大鼠的LVDd、LVDs均明顯增加，以E組的增加幅度最小(P<0.05)。與B、C、D三組相比，E組的LVEF、LVFS明顯增加，而LVDd、LVDs明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠術(shù)后4 w心功能指標(biāo)的比較±s)

2.2 各組大鼠術(shù)后4 w炎性因子的表達(dá)情況比較 術(shù)后4 w，與A組比較，B、C、D、E組大鼠的IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)水平均明顯增加，以E組的增加幅度最小(P<0.05)。與B、C、D三組相比，E組的IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠術(shù)后4 w炎性因子的表達(dá)情況比較±s)

3 討 論

MI對人類健康的威脅較大，心肌細(xì)胞一旦出現(xiàn)損害將無法修復(fù)和分化，并被成纖維細(xì)胞取代，最終改變心臟結(jié)構(gòu)導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生。心肌細(xì)胞的減少及心室重構(gòu)均不能從根本上通過藥物治療及冠狀動(dòng)脈血運(yùn)重建術(shù)得到改變，但干細(xì)胞移植治療則能有效改善這一點(diǎn)，外源性干細(xì)胞植入心肌后可再生為具有正常功能的心肌細(xì)胞，對瘢痕組織的形成具有很好的抑制作用，從而使心功能得以改善〔5〕。MSCs是一種可分化為多種細(xì)胞的多能干細(xì)胞，不僅能多向分化、自我更新、大量增殖，還具有體外易培養(yǎng)、獲取方便等優(yōu)點(diǎn)，因此在MI干細(xì)胞移植治療中的應(yīng)用前景較好。

研究證實(shí)，在BMI的治療中MSCs 移植已經(jīng)取得了很好的效果〔6〕。目前，臨床上已證實(shí)MSCs 移植MI心功能的改善是通過向心肌細(xì)胞分化、促進(jìn)血管生成及改善心肌重構(gòu)等機(jī)制來完成的，但尚未清楚其確切治療機(jī)制，仍存在一定的爭議〔7〕。本研究表明心肌缺血損傷后大鼠的心功能顯著惡化，但MSCs移植組大鼠各項(xiàng)心功能指標(biāo)較MI模型組、培養(yǎng)液移植組改善更加明顯，這一結(jié)果提示MSCs移植對BMI后心功能的改善十分有效。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為MSCs移植對心功能的改善可能與其向心肌細(xì)胞分化、分泌多種生長因子以促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管新生以及抑制心肌細(xì)胞凋亡等機(jī)制有關(guān)〔8〕。

MI常伴一定程度的免疫炎癥反應(yīng)，心肌組織中炎性細(xì)胞因子的異常表達(dá)可在神經(jīng)內(nèi)分泌激活的共同作用下對MI發(fā)生發(fā)展起促進(jìn)作用，可推動(dòng)心室重構(gòu)。近年來多項(xiàng)研究證實(shí)，在MI的發(fā)生發(fā)展中炎癥細(xì)胞因子起著十分重要的作用，其中IL-1β、IL-6、TNF-α被證實(shí)為是參與MI心室重構(gòu)的重要炎性因子。上述炎性因子在正常心肌組織中較少表達(dá)，僅在心肌缺血損傷時(shí)出現(xiàn)高水平表達(dá)，因此，可通過抑制上述炎性因子的表達(dá)來延緩心室重構(gòu)。國內(nèi)外大量研究顯示，MSCs移植除了能向心肌細(xì)胞分化、改善心室重構(gòu)外，還具有獨(dú)特的免疫抑制特性，移植后可抑制免疫和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)〔9〕。本研究結(jié)果表明在MI發(fā)生發(fā)展中免疫細(xì)胞因子起著十分重要的作用，MSCs 移植可通過對上述炎性因子的抑制作用而起到對MI的治療作用。這與相關(guān)文獻(xiàn)〔10〕報(bào)道一致。這是由于炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平的抑制可減少負(fù)性肌力作用，有助于心肌重構(gòu)的緩解，從而改善心功能。

Notch信號在多細(xì)胞生物(如果蠅、哺乳動(dòng)物等)的發(fā)育過程中起關(guān)鍵調(diào)控作用，可參與幾乎所有涉及細(xì)胞分化的生命活動(dòng)。目前，關(guān)于MSCs分化特性的研究較多，但少有文獻(xiàn)報(bào)道其分化機(jī)制〔10〕。有學(xué)者的研究采用克隆人Notch1 ICN 基因構(gòu)建pLXSN-ICN，并將ICN基因通過逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染到大鼠MSCs中，對MSCs分化情況的觀察結(jié)果顯示，Notch1可在MSCs中表達(dá)，提示在MSCs的增殖分化中Notch信號具有調(diào)控作用。本研究表明激活Notch 信號的MSCs移植對心功能的改善效果更好。這與激活的Notch 信號轉(zhuǎn)染MSCs后促進(jìn)其向心肌細(xì)胞分化的作用有關(guān)。而心肌炎性細(xì)胞因子檢測結(jié)果顯示，激活Notch 信號的MSCs移植可更好的調(diào)節(jié)MI后出現(xiàn)的免疫炎癥反應(yīng)，從而抑制心室重構(gòu)。這是由于Notch信號可調(diào)控MSCs的增殖分化，通過促進(jìn)MSCs移植對抗炎與促炎細(xì)胞因子表達(dá)平衡的調(diào)節(jié)而對MI后免疫炎癥反應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而有助于心功能的改善。

1 馬樹人，謝雄偉.激活Notch信號的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植促心肌梗死模型鼠血管新生研究〔J〕.蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2011；31(1)：93-7.

2 謝雄偉，馬樹人.激活Notch信號的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞心肌移植促進(jìn)血管新生〔J〕.江蘇醫(yī)藥，2011；37(14)：1623-6.

3 楊昕蕾，姜春明，孫唐娜，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對異丙腎上腺素致心力衰竭大鼠心功能及炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014；14(2)：235-9.

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5 Karpov AA，Uspenskaya YK，Minasian SM，etal.The effect of bone marrow-and adipose tissue-derived mesenchymal stem cell transplantation on myocardial remodelling in the rat model of ischaemic heart failure〔J〕.Int J Exp Pathol，2013；94(3)：169-77.

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〔2015-10-19修回〕

(編輯 袁左鳴)

浙江省衛(wèi)生廳課題(No.2015KYB164)

朱玲軍(1977-)，男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事心血管內(nèi)科方面的研究。

R54

A

1005-9202(2016)19-4707-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.015