新型腫瘤抑素對C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞抑制作用的影響

任吉祥 劉 爽 孫 洋 周慶偉

(長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長春 130021)

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新型腫瘤抑素對C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞抑制作用的影響

任吉祥 劉 爽1孫 洋1周慶偉2

(長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長春 130021)

目的 探討新型腫瘤抑素對C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖及Caspase-3蛋白表達的影響。方法 采用CCK-8檢測不同濃度的新的腫瘤抑素對C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖并用Western印跡檢測對Caspase-3蛋白的表達。結(jié)果 新的腫瘤抑素作用C6膠質(zhì)瘤24 h空白對照組與卡莫司汀組比較差異有顯著性(P<0.05)，與其他實驗組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05);48 h空白組與卡莫斯汀組、1 500、2 000 μg/ml組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；72 h時空白對照組與卡莫斯汀組、1 500、2 000 μg/ml組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)?？瞻讓φ战M與卡莫司汀組、1 500、2 000 μg/ml組比較Caspase-3蛋白表達有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。結(jié)論 新型腫瘤抑素可能通過調(diào)控Caspase-3蛋白表達抑制C6腫瘤細胞增殖。

新的腫瘤抑素；C6神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤

研究表明，膠質(zhì)瘤常浸潤人腦重要功能區(qū)或附近區(qū)域，手術(shù)無法將腫瘤完全切除，術(shù)后易復發(fā)，放、化療雖可殺傷腫瘤細胞，但同時亦會損傷部分正常腦組織，會出現(xiàn)嚴重的全身不良反應，臨床治療效果不佳〔1〕。生物活性肽是一類活性較高的化合物，因其結(jié)構(gòu)簡單、分子量小，易透過血管屏障等特點，甚至能夠通過細胞滲透直接進入細胞內(nèi)，克服了目前很多藥物不能直接進入細胞內(nèi)等問題〔2，3〕。本文探討新的腫瘤抑素對膠質(zhì)瘤細胞的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料 C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞(購自中國科學院上海細胞生物學研究所),卡莫司汀(中國天津金耀藥業(yè)有限公司，批號：1407011)。DMEM細胞培養(yǎng)基、胎牛血清、TRIS-base、Bis Acrylamide、Acrylamide、Glycine、Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒、兔抗-caspase-3、HRP 羊抗兔IgG、抗β-actin(武漢博士德生物工程有限公司)；CCK-8溶液(碧云天生物技術(shù)研究所)。倒置光學顯微鏡 NiKon ECLIPSE 80i(日本尼康公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(日本三樣電機株式會社制造，產(chǎn)品型號：NCO-15AC)；AN YANG 超凈臺(蘇州安洋科技發(fā)展有限公司，型號：BSC-BOOⅡB2)；酶聯(lián)免疫檢測儀(中國北京普朗新有限公司，DNM-9602)。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8檢測不同濃度的新型腫瘤抑素對C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤增殖的影響 取對數(shù)期細胞，胰酶消化后制成細胞懸液，細胞計數(shù)調(diào)整至1×104/ml；接種至96孔板；實驗隨機分為空白對照組、卡莫司汀組(0.391 mg/ml)、新型腫瘤抑素(1 000、1 500、2 000 μg/ml)組,每組設(shè)4個復孔，細胞貼壁后，除空白對照組外，每組加入不同的藥物，37℃、5%CO2孵育；分別在加藥24、48、72 h時每孔加入CCK-8溶液20 μl，放置孵箱孵育1 h后，采用酶標儀檢測OD值。

1.2.2 Western印跡檢測不同濃度的新的腫瘤抑素對Caspase-3蛋白表達的影響 取對數(shù)期細胞，胰酶消化后制成細胞懸液，細胞計數(shù)調(diào)整為3×105/ml，細胞接種至6孔板，隨機分為空白對照組、卡莫司汀組(0.391 mg/ml)、新型腫瘤抑素(1 000、1 500、2 000 μg/ml)組,每組設(shè)4個復孔，細胞貼壁后，除空白對照組外，每組加入不同濃度的藥物，置37℃，5%CO2孵育，孵育48 h取出6孔板，提取蛋白；電泳后，在恒定電流200 mA條件下轉(zhuǎn)膜90 min；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用5%脫脂奶粉常溫搖床封閉1 h；棄去封閉液，加入一抗(1∶300稀釋)；置于4℃孵育過夜；TBST洗膜15 min，共3次；加入二抗(1∶3 000稀釋)，常溫搖床搖1 h；TBST洗膜15 min，共3次；加入顯影液；用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析檢測目的蛋白Caspase-3表達。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS18.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 CCK-8檢測不同濃度的新型腫瘤抑素對C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤增殖的影響 24 h時只有空白對照組與卡莫司汀組比較有顯著差異(P<0.05)，與其他組比較均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，其余組間比較也無統(tǒng)計學意義(P>0.05)：48 h時空白對照組與卡莫斯汀組、1 500、2 000 μg/ml組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；72 h時空白對照組與卡莫斯汀組、1 500、2 000 μg/ml組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1,表1。

圖1 各時間C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤增殖鏡下改變(×10)

表1 CCK-8檢測不同濃度的新型腫瘤抑素對C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤增殖的影響

與空白對照組比較：1)P<0.05；與卡莫司汀組比較：2)P<0.05

2.2 Western印跡檢測不同濃度的新型腫瘤抑素對Caspase-3蛋白表達的影響 卡莫斯汀組(1.53±0.01)、1 500 μg/ml(0.96±0.00)、2 000 μg/ml新型腫瘤抑素組(0.50±0.01)Caspase-3蛋白表達均有所下調(diào)，與空白對照組(2.09±0.01)比較有顯著差異(P<0.05)。1 000 μg/ml新型腫瘤抑素組Caspase-3表達量為1.33±0.01。

3 討 論

腫瘤細胞與正常細胞在很多生物學特性上都很相似,當藥物作用于腫瘤細胞時,通常正常細胞也會受到很大的影響。選擇性抑制腫瘤細胞生長或誘導腫瘤細胞進入凋亡途徑是目前癌癥研究的熱點和主流。腫瘤細胞是一類代謝率高且生長迅速的細胞，在腫瘤細胞中,很多與細胞增殖和遷移相關(guān)的通路都被過度激活,這提示在腫瘤細胞中存在大量可供選擇的位點〔4〕。本研究表明作用48 h新形腫瘤抑素對C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞生長有抑制作用并成一定的劑量依賴性。Caspase-3 是介導細胞凋亡的一類蛋白水解酶是哺乳動物細胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，參與細胞凋亡的級聯(lián)反應，在膠質(zhì)瘤的惡性進展中也發(fā)揮重要作用〔5〕。Caspase-3需在活化狀態(tài)下能參與細胞凋亡〔6〕。Caspase-3蛋白酶激活機制非常復雜,受多種因素調(diào)控,存在不同的活化途徑。本實驗結(jié)果顯示，卡莫斯汀組、新型腫瘤抑素1 500、2 000 μg/ml組均能顯著下調(diào)Caspase-3蛋白表達，說明小分子肽可能通過抑制Caspase-3蛋白表達從而抑制腫瘤細胞生長。

1 張婧婧.Angiopep-2介導的雙靶向納米載體的研究及其在大鼠C6膠質(zhì)瘤MR顯像中的價值〔D〕.合肥：安徽醫(yī)科大學,2015.

2 何平均，倪淑欣，王文權(quán)，等.抗腫瘤寡肽類藥物研究進展〔J〕.中國醫(yī)藥生物技術(shù)，2009;4(4):288-90.

3 邱曉燕.抗菌肽的免疫功能和應用前景〔J〕.生物學通報，2002;37(1):24-5.

4 瞿家桂.神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞致瘤性相關(guān)基因、抗腫瘤藥物以及健康人群認知功能的研究〔D〕.合肥：中國科學技術(shù)大學,2014.

5 蔡風景,徐朝陽,陳峻嚴,等.雷公藤甲素對C6膠質(zhì)瘤細胞凋亡及TNF-α、NF-κb和Caspase-3表達的影響〔J〕.中藥藥理與臨床,2013(6):14-7.

6 呂 軍,楊連粵.Caspase-3與肝癌細胞凋亡〔J〕.華夏醫(yī)學,2004;17(5):839-41.

〔2016-05-13修回〕

(編輯 郭 菁)

1 吉林大學藥學院 2 吉林大學再生醫(yī)學研究所

周慶偉(1959-)，男，教授，主要從事藥理學研究。

任吉祥(1977-)，男，副教授，主要從事中醫(yī)內(nèi)科腦病臨床研究。

R73

A

1005-9202(2016)19-4705-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.014