補中益氣湯對A549/DDP與A549荷瘤BALB/c小鼠移植瘤生長的影響

高 原 王 瑩 陳 奇 井 歡 于 丹 潘 茜 王 哲 劉春英

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，遼寧 沈陽 110847)

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·基礎(chǔ)研究·

補中益氣湯對A549/DDP與A549荷瘤BALB/c小鼠移植瘤生長的影響

高 原 王 瑩 陳 奇1井 歡 于 丹 潘 茜 王 哲 劉春英

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，遼寧 沈陽 110847)

目的 觀察補中益氣湯對A549/DDP與A549荷瘤BALB/c小鼠移植瘤生長的影響。方法 BALB/c小鼠右腋窩皮下接種A549/DDP或A549細胞株，成瘤后連續(xù)腹腔注射順鉑25 d，2次/d，中藥治療組同時連續(xù)灌胃低、中、高劑量補中益氣湯25 d，2次/d。給藥后0、5、10、15、20、25 d，測量移植瘤的長徑與短徑，計算移植瘤的體積并繪制腫瘤的生長曲線。實驗結(jié)束后處死小鼠，剝離瘤組織并稱重，計算藥物抑瘤率及抑瘤作用提高率。結(jié)果 對于A549/DDP移植瘤，給藥10 d后，補中益氣湯開始縮小移植瘤體積，隨著給藥時間的延長和給藥劑量的增加，移植瘤體積逐漸縮??；給藥25 d后，隨著補中益氣湯劑量的增加，移植瘤重量隨之減輕，抑瘤率隨之增加，抑瘤作用提高率也隨之顯著增加。對于A549移植瘤，給藥5 d后，補中益氣湯即開始縮小移植瘤體積，隨著給藥時間的延長和給藥劑量的增加，移植瘤體積逐漸縮??；給藥25 d后，隨著補中益氣湯劑量的增加，移植瘤重量隨之減輕，抑瘤率隨之增加，抑瘤作用提高率也隨之顯著增加。結(jié)論 補中益氣湯能抑制BALB/c肺腺癌荷瘤小鼠腫瘤的生長，在順鉑耐藥與順鉑敏感的肺癌組織中均可發(fā)揮抑瘤作用。

補中益氣湯；A549/DDP；A549；移植瘤；BALB/c小鼠

肺癌以非小細胞肺癌(NSCLC)多見，占80%～85%；確診時70%的NSCLC多已發(fā)生淋巴結(jié)和(或)遠處臟器轉(zhuǎn)移，因此，NSCLC的治療多以化學(xué)治療為主〔1〕。NSCLC一線治療方案以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療為首選，但越來越多的患者表現(xiàn)出對鉑類藥物產(chǎn)生耐藥性，這種耐藥性還造成了患者對放療或其他不同藥理機制的化學(xué)藥物的敏感性降低〔2〕，嚴重影響NSCLC的臨床療效。研究表明補中益氣湯可有效提高機體免疫水平〔3〕，抑制瘤組織中的自由基〔4〕，抑制瘤體的生長及延長帶瘤機體的生存時間〔5〕，有效改善肺癌耐藥〔6〕，提高肺癌臨床療效等。本課題組前期體外實驗結(jié)果顯示補中益氣湯含藥血清可抑制A549/DDP細胞的生長〔7,8〕，干擾其對順鉑產(chǎn)生耐藥性，但對補中益氣湯抑制腫瘤生長，改善腫瘤順鉑耐藥的體內(nèi)研究鮮有報道。本實驗擬觀察補中益氣湯對小鼠負荷的A549/DDP和A549移植瘤體積、重量、生長曲線及抑瘤率的影響，探討其對腫瘤的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 動物和細胞株 BALB/c小鼠購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，SPF級，6周齡，雄性，體重16～20 g，動物許可證號SCXK(京)2012-0001。A549/DDP及A549均購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究中心。

1.2 化療藥物及中藥 順鉑購于大連美侖生物技術(shù)有限公司。補中益氣湯根據(jù)2010版《中華人民共和國藥典》中規(guī)定用藥及臨床常用劑量(黃芪18 g，人參6 g，白術(shù)9 g，甘草9 g，當歸3 g，陳皮6 g，升麻6 g，柴胡6 g)，全部藥材均購于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥房，通過遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥理實驗室的鑒定，加水浸泡30 min后，按湯劑常規(guī)方法煎熬，過濾并濃縮成生藥含量為1 g/ml的藥液，冷卻后4℃保存。按照“人和動物之間按體表面積折算的等效劑量比值表”計算出裸鼠等效劑量，設(shè)高劑量濃度為5.82 g/kg、中劑量濃度為2.91 g/kg、低劑量濃度為1.46 g/kg。

1.3 試劑 DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購于美國HyClone公司。

1.4 移植瘤動物模型的制備 在37℃、5% CO2孵育條件下，A549、A549/DDP細胞分別在含有10%胎牛血清的DMEM和RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。細胞以0.25%的胰酶消化傳代，每隔1～2 d傳代一次。分別將收集好的對數(shù)生長期的A549/DDP或A549細胞株，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度至5×107/ml，按相應(yīng)實驗分組接種0.2 ml腫瘤細胞于裸鼠腋窩皮下。接種腫瘤細胞8 d成瘤即移植瘤動物模型制備成功。

1.5 實驗分組及給藥 60只BALB/c 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2 w，按隨機數(shù)字表法分為10組，A組(A549/DDP荷瘤對照組)、B組(A549/DDP荷瘤+順鉑組)、C組(A549/DDP荷瘤+順鉑+低劑量補中益氣湯組)、D組(A549/DDP荷瘤+順鉑+中劑量補中益氣湯組)、E組(A549/DDP荷瘤+順鉑+高劑量補中益氣湯組)、a組(A549荷瘤對照組)、b組(A549荷瘤+順鉑組)、c組(A549荷瘤+順鉑+低劑量補中益氣湯組)、d組(A549荷瘤+順鉑+中劑量補中益氣湯組)、e組(A549荷瘤+順鉑+高劑量補中益氣湯組)，每組6只，造模成功后隔天開始給予不同藥物干預(yù)。A組、a組蒸餾水灌胃，1 ml/只，2次/d；B組、b組10 mg/kg順鉑腹腔注射，2次/d；C組、c 組低劑量補中益氣湯灌胃1 ml/只，2次/d，同時10 mg/kg順鉑腹腔注射，2次/d；D組、d組中劑量補中益氣湯灌胃1 ml/只，2次/d，同時10 mg/kg順鉑腹腔注射，2次/d；E組、e組高劑量補中益氣湯灌胃1 ml/只，2次/d，同時10 mg/kg順鉑腹腔注射，2次/d。分別于給藥后0、5、10、15、20、25 d用游標卡尺測量皮下移植瘤的最大長徑(a)和橫徑(b)，計算移植瘤體積：移植瘤體積= a×b2/2，緩制腫瘤生長曲線。給藥后25 d時處死全部BALB/c 小鼠，無菌剝?nèi)∫浦擦霾⒎Q其質(zhì)量；計算各組藥物的抑瘤率：抑瘤率=(對照組瘤質(zhì)量-藥物組瘤質(zhì)量)/對照組瘤質(zhì)量×100%；抑瘤作用提高率(%)=(藥物組抑瘤率-對照組抑瘤率)/對照組抑瘤率×100%。

2 結(jié) 果

2.1 BALB/c小鼠的一般狀態(tài)及致瘤率 各組BALB/c小鼠荷瘤后活動良好，未出現(xiàn)明顯的拒食、躁動、便溏等癥狀。荷瘤8 d后，各組BALB/c小鼠均有腫瘤結(jié)節(jié)生長，瘤塊直徑達到2～3 mm，經(jīng)病理學(xué)診斷符合肺腺癌組織學(xué)特征。各組BALB/c小鼠致瘤率均達到100%。

2.2 給藥后不同時點各組荷瘤BALB/c小鼠移植瘤的體積及腫瘤生長曲線 在A549/DDP細胞荷瘤BALB/c小鼠各組中，單獨順鉑治療20 d后移植瘤體積開始縮小，25 d后縮小更為顯著，與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；而聯(lián)合補中益氣湯治療10 d后移植瘤體積就開始縮小，與對照組、順鉑組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。隨著治療時間的延長以及中藥濃度的增加，移植瘤體積縮小的幅度進一步加大，呈現(xiàn)顯著的時間依賴性和劑量依賴性。見表1。在A549細胞荷瘤BALB/c小鼠各組中，單獨順鉑治療5 d后移植瘤體積就開始縮小，與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，其后隨著治療時間的延長，移植瘤體積逐漸縮??；而聯(lián)合補中益氣湯治療5 d后移植瘤體積較順鉑組進一步縮小(P<0.05)。隨著治療時間的延長以及中藥濃度的增加，移植瘤體積縮小的幅度進一步加大，呈現(xiàn)顯著的時間依賴性和劑量依賴性。見表2。

表1 A549/DDP荷瘤BALB/c小鼠各組移植瘤體積

與A組比較:1)P<0.05；與B組比較:2)P<0.05

2.3 給藥25 d后各組移植瘤瘤重、抑瘤率及抑瘤作用提高率 在A549/DDP細胞荷瘤BALB/c小鼠各組中，單獨順鉑治療后移植瘤體積輕度縮小，移植瘤重量輕度減輕，與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；聯(lián)合低、中、高劑量的補中益氣湯治療后移植瘤體積均顯著縮小，移植瘤重量均顯著減輕，與對照組、順鉑組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，隨著補中益氣湯劑量的增加，移植瘤體積隨之縮小，移植瘤重量隨之減輕，抑瘤率隨之增加，抑瘤作用提高率也隨之顯著增加。見表3。

表2 A549荷瘤BALB/c小鼠各組移植瘤體積

與a組比較:1)P<0.05；與b組比較:2)P<0.05

在A549細胞荷瘤BALB/c小鼠各組中，單獨順鉑治療后移植瘤體積就已顯著縮小，移植瘤重量也已顯著減輕，與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；聯(lián)合低、中、高劑量的補中益氣湯治療后移植瘤體積進一步縮小，移植瘤重量進一步減輕，與對照組、順鉑組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，隨著補中益氣湯劑量的增加，移植瘤體積隨之縮小，移植瘤重量隨之減輕，抑瘤率隨之增加抑瘤作用提高率也隨之增加。見表4。

表3 A549/DDP細胞荷瘤裸鼠各組移植瘤重量、抑瘤率及抑瘤作用提高率

與A組比較:1)P<0.05；與B組比較:2)P<0.05

表4 A549細胞荷瘤裸鼠各組移植瘤重量、抑瘤率及抑瘤作用提高率

與a組比較:1)P<0.05；與b組比較:2)P<0.05

3 討 論

肺癌屬“肺積”、“痞癖”、“咳嗽”、“咯血”等范疇，其病機特點是全身虛為本，局部瘀痰毒互結(jié)成積為標，正虛不僅是肺癌發(fā)生的內(nèi)因，也是肺癌轉(zhuǎn)變的重要因素，而其中正氣不足又以后天脾胃虛弱為基礎(chǔ)，土不生金為關(guān)鍵。脾肺兩臟關(guān)系密切，為母子之臟，脾土能生肺金。由于脾氣虛衰，水濕不運，濕濁內(nèi)生，化痰成飲，而痰飲則上傳至肺，聚集于肺，形成痰濕瘀滯；同時脾氣虛衰，運化失司，水谷精微化源不足，導(dǎo)致肺氣不足，即為土不能生金。因此，金元時期著名醫(yī)家李東垣在《脾胃論》中曰：“其治肝、心、肺、腎，有余不足，或補或瀉，惟脾胃之藥為切”。培土生金法適用于脾肺同虛癥，即肺癌晚期患者〔9〕，此時患者由于病久肺氣本虛，邪踞胸中日久更傷肺氣，肺氣虧虛，子病及母，累及脾胃；加之化療藥進一步損傷脾胃，脾胃虛衰導(dǎo)致氣血生化無源，更使正氣虧虛、氣血瘀滯，故臨床肺病經(jīng)久不愈，易產(chǎn)生耐藥〔10〕。

補中益氣湯即為李東垣《內(nèi)外傷辨惑論》的經(jīng)典方，該方中重用黃芪，補中益氣、升陽固表；參、術(shù)、草甘溫益氣、健脾益胃；橘皮理氣行滯；當歸補血和營；升麻、柴胡協(xié)同芪、參以升舉清陽之氣，全方健脾胃以治氣虛之本，升提下陷陽氣，以達培土生金之效。

順鉑對耐藥腫瘤的抑制生長作用起效時間(>25 d)顯著慢于敏感腫瘤(5 d)。聯(lián)合補中益氣湯后，無論是在耐藥還是敏感腫瘤中，順鉑抑制腫瘤生長的作用均增強且順鉑對耐藥腫瘤抑制生長起效時間提前(10 d)。補中益氣湯對耐藥腫瘤與敏感腫瘤均表現(xiàn)出時間依賴性抑制和劑量依賴性抑制作用。給藥25 d后，順鉑仍對耐藥腫瘤的生長無抑制作用，而對敏感腫瘤的生長呈顯著抑制。隨著補中益氣湯劑量的增加，順鉑抑制腫瘤生長的作用逐漸加強，可在順鉑耐藥與順鉑敏感的腫瘤中均可發(fā)揮有效的抑瘤作用。

1 Hu L,Liang G,Yuliang W,etal.Assessing the effectiveness and safety of liposomal paclitaxel in combination with cisplatin as first-line chemotherapy for patients with advanced NSCLC with regional lymph-node metastasis:study protocol for a randomized controlled trial(PLC-GC trial)〔J〕.Trials,2013;14:45.

2 Chang A.Chemotherapy,chemoresistance and the changing treatment landscape for NSCLC〔J〕.Lung Cancer,2011;71(1):3-10.

3 黃秋萍.補中益氣湯及其拆方的免疫調(diào)節(jié)作用〔J〕.醫(yī)學(xué)導(dǎo)刊，2008;14(2)：72-3.

4 江蔚新，蔣 燕，李宇彬，等.補中益氣湯對EAC小鼠癌細胞膜LPO含量的影響〔J〕.黑龍江醫(yī)藥，1997;10(2)：88-9.

5 李 濱，齊鳳琴，李燕敏，等.補中益氣湯抗腫瘤作用的實驗研究〔J〕.中醫(yī)藥學(xué)報，2006;34(1)：22-3.

6 韓 燁，鄭 心.培土生金法在中晚期肺癌治療中的應(yīng)用〔J〕.江西中醫(yī)藥，2015;4(3)：43-4.

7 易佳麗，劉春英.補中益氣湯含藥血清干擾A549/DDP生長作用的實驗研究〔J〕.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2013;10(17)：4-7.

8 井 歡，唐 瑩，于 丹，等.補中益氣湯含藥血清對A549/DDP細胞生長周期作用的影響〔J〕.中國生化藥物雜志，2014;34(2)：48-50.

9 葉霈智，田劭丹.培土生金法在肺癌治療中的應(yīng)用淺析〔J〕.實用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2005;19(5)：397-8.

10 張 芳，孟憲明.培土生金法對氣虛痰濕型肺癌化療減毒增效的臨床研究〔J〕.西部中醫(yī)藥，2014;27(10)：94-5.

〔2015-12-30修回〕

(編輯 郭 菁)

Effect of Buzhong Yiqi decoction on the growth of transplantation tumor of BALB/c mice with A549/DDP cells and A549 cells

GAO Yuan, WANG Ying, CHEN Qi,et al.

Department of Pathology, College of Basic Medical Science, Liaoning University of Chinese Traditional Medicine, Shenyang 110847, Liaoning, China

Objective To observe the effect of Buzhong Yiqi decoction on the growth of transplantation tumor of BALB/c mice with lung adenocarcinoma cisplatin-resistant cells (A549/DDP) and cisplatin-sensitive cells (A549).Methods The lung tumor-bearing model was established by inoculation of A549/DDP cells and A549 cells into BALB/c nude mice subcutaneously. The mice were treated by intraperitoneal injection of cisplatin for 25 d, twice per day. Simultaneously, the animals in traditional Chinese medicine groups also were put into low, medium and high dose of Buzhong Yiqi decoction for 25 d, twice per day. At 0, 5, 10, 15, 20, 25 d，the long and short diameter of transplantation tumor were measured, then the volume was calculated and the growth curve of tumor was drew. At last, all the mice were executed. The weight of transplantation tumor was weighed, then the tumor inhibitory rate and tumor inhibitory increasing rate were calculated.Results For transplantation tumor with A549/DDP cells, Buzhong Yiqi decoction reduced the volume of transplantation tumor after 10 d of administration, and lost the weight of transplantation tumor, increased the tumor inhibitory rate and tumor inhibitory increasing rate after 25 d of administration. For transplantation tumor with A549 cells, Buzhong Yiqi decoction reduced the volume of transplantation tumor after 5 d of administration, and lost the weight of transplantation tumor, increased the tumor inhibitory rate and tumor inhibitory increasing rate after 25 d of administration.Conclusions Buzhong Yiqi decoction could inhibit the growth of transplantation tumor of BALB/c mice. It might play a role in a tumor suppressor in the cisplatin-sensitive and cisplatin-resistant lung tumor tissues.

Buzhong Yiqi decoction; A549/DDP；A549；Transplantation tumor; BALB/c mice

國家自然科學(xué)基金項目(No.81403303)；中國博士后科學(xué)基金面上資助(No.2014M551122)；中國博士后科學(xué)基金特別資助(No.2015T80266)；遼寧省自然科學(xué)基金項目(No.2013020178)

1 遼寧省體育科學(xué)研究所生理研究室

劉春英(1962-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥治療腫瘤機制的研究。

高 原(1980-)，女，博士，副教授，主要從事中藥調(diào)節(jié)腫瘤耐藥作用及其機制的研究。

R734.2

A

1005-9202(2016)19-4673-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.001