類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血miR—146a及miR—155的表達(dá)及臨床意義

馮佳　夏燕　陳安平　楊年安　田瑞　龔書識(shí)　袁林

【摘 要】目的：探討類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血淋巴細(xì)胞中miR-146a及miR-155的表達(dá)及臨床意義。方法：應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)30例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者及30例健康者外周血淋巴細(xì)胞中miR-146a、miR-155的表達(dá)水平，并且與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者紅細(xì)胞沉降率、C-反應(yīng)蛋白、DAS28評(píng)分、免疫球蛋白M型類風(fēng)濕因子進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果：miR-146a及miR-155在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血淋巴細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)水平均高于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者miR-146a、miR-155的表達(dá)水平與紅細(xì)胞沉降率、C-反應(yīng)蛋白、DAS28呈正相關(guān)（P < 0.05），與免疫球蛋白M型類風(fēng)濕因子無相關(guān)性（P > 0.05）。結(jié)論：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血miR-146a和miR-155表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)水平與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病情活動(dòng)相關(guān)，提示miR-146a和miR-155可作為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病活動(dòng)的有效指標(biāo)。

【關(guān)鍵詞】 關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕；外周血；miR-146a；miR-155

【ABSTRACT】Objective：To investigate the expression and clinical significance of miR-146a and miR-155 in peripheral blood lymphocytes of patients with rheumatoid arthritis.Methods：The real time fluorescent quantitative PCR was used to detect the expression levels of miR-146a and miR-155 in peripheral blood lymphocytes of 30 cases of rheumatoid arthritis and 30 healthy people.A correlation analysis was made between above detected levels and patients erythrocyte sedimentation rate，C-reactive protein，DAS28 score and immunoglobulin M rheumatoid factor.Results：The relative expression levels of miR-146a and miR-155 in the peripheral blood lymphocytes of patients with rheumatoid arthritis were higher than those of the control group，and the difference was statistically significant（P < 0.05）.The expression levels of miR-146a and miR-155 were positively correlated（P < 0.05）with erythrocyte sedimentation rate，C-reactive protein and DAS28 and had no correlation（P > 0.05）with immunoglobulin M rheumatoid factor.Conclusion：The expression of miR-146a and miR-155 in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis up-regulates and the expression level is related to disease activity，suggesting that miR-146a and miR-155 can be used as effective indicators of disease activity of rheumatoid arthritis.

【Keywords】 arthritis，rheumatoid；peripheral blood；miR-146a；miR-155

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種主要侵犯全身各處關(guān)節(jié)，同時(shí)其他器官或組織也可受累的慢性全身性自身免疫性疾病。主要病理改變?yōu)槎喟l(fā)性、對(duì)稱性、慢性增生性滑膜炎，可以引起關(guān)節(jié)軟骨和關(guān)節(jié)囊的破壞，最后導(dǎo)致關(guān)節(jié)強(qiáng)直畸形[1]。miRNAs是一類長約20～24個(gè)核苷酸的非編碼RNA，通過對(duì)基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，從而參與很多生物學(xué)過程。近年來的研究表明，miR-146a及miR-155分子在RA患者中異常表達(dá)，與RA的起病和發(fā)展有著密切的關(guān)系，miR-146a及miR-155能否成為新型生物標(biāo)記物而應(yīng)用于臨床已成為研究熱點(diǎn)[2]。本研究通過檢測(cè)miR-146a及miR-155在RA患者外周血的表達(dá)水平，并結(jié)合臨床相關(guān)指標(biāo)，分析其與RA疾病活動(dòng)程度相關(guān)性，初步探討miR-146a及miR-155在RA發(fā)病及疾病進(jìn)展中的

意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年12月至2016年3月在湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院風(fēng)濕免疫科就診的門診及住院RA患者30例，男9例，女21例；年齡33～59歲，中位數(shù)48.6歲。所有患者均符合1987年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ACR）RA分類診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。選擇同期在本院體檢的30例健康者作為對(duì)照組，男10例，女20例；年齡30～60歲，

中位數(shù)46.1歲。2組均排除糖尿病、高血壓、心臟病、惡性腫瘤及其他自身免疫性疾病。2組患者在性別、年齡等方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。本實(shí)驗(yàn)得到當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)支持，且所有參與者均簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器 人外周血淋巴細(xì)胞分離液（天津?yàn)蠊荆?；miRcute miRNA Isolation Kit及miRcute miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit（TIANGEN公司）；SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）（TaKaRa公司）；miR-146a、miR-

155、U6引物（TIANGEN公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（LC480，瑞士）。

1.3 外周血淋巴細(xì)胞（PBMCs）提取 抽取RA患者及正常人外周血2 mL，取2 mL PBS液與血液1∶1混勻后，沿管壁小心加于4 mL淋巴細(xì)胞分離液面上，置于1500 r·min-1離心機(jī)離心20 min。

此時(shí)可見試管中不同組分的條帶，從上至下分別為血漿層，淋巴細(xì)胞層（乳白色），分離液層和紅細(xì)胞層。用移液器輕輕吸取淋巴細(xì)胞層，置于1.5 mL

無RNA酶的離心管中，加適量的PBS稀釋，置于2000 r·min-1離心機(jī)離心10 min洗滌，棄上清，用PBS再洗1次，白色沉淀即為淋巴細(xì)胞。

1.4 miRNA提取 向每支裝有PBMCs的EP管中加入1 mL裂解液MZ，混勻，室溫放置5 min，加入200 μL氯仿，蓋緊管蓋，劇烈震蕩15 s，室溫放置5 min后，4℃，置于12 000 r·min-1離心機(jī)離心15 min，樣品分3層：黃色的有機(jī)相，中間層和無色的水相，把水相轉(zhuǎn)到新的無RNA酶的離心管中。嚴(yán)格按照miRNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5 miRNA cDNA第一鏈合成 取5 μL miRNA加入到20 μL體系中。嚴(yán)格按照miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。合成的cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系20 μL：SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）10 μL，PCR Forward Primer（10 μM） 0.4 μL，PCR Reverse Primer

（10 μM） 0.4 μL，Template 2 μL，dH2O 7.2 μL。

以上操作均在冰上進(jìn)行，反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 5 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本目的基因，即miR-146a和miR-155的CT值分別用各自的內(nèi)參基因（即U6）進(jìn)行歸一化處理，即△CT樣本 = CT目的基因

- CT內(nèi)參，分別得到△CT實(shí)驗(yàn)樣本和△CT對(duì)照樣本值，然后計(jì)算兩者差值，即△△CT = △Ct樣本-△Ct對(duì)照，最后計(jì)算2-△△CT，其表示實(shí)驗(yàn)組目的基因表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組變化的倍數(shù)。

1.7 28個(gè)關(guān)節(jié)疾病活動(dòng)度評(píng)分（DAS28） 參照Prevoo等[4]的計(jì)算方法，DAS28評(píng)分由以下參數(shù)計(jì)算得出：腫脹關(guān)節(jié)數(shù)（SJC）、壓痛關(guān)節(jié)數(shù)（TJC）、紅細(xì)胞沉降率（ESR），計(jì)算公式為：DAS28=（0.56×sqrt TJC+0.28×sqrt SJC+0.7×lnESR）×1.08 + 0.16。

1.8 ESR、C-反應(yīng)蛋白（CRP）、免疫球蛋白M（IgM）型類風(fēng)濕因子（RF）的測(cè)定 ESR、CRP、IgM型RF分別采用魏氏法、免疫比濁法、ELISA法檢測(cè)，以上指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果由湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）；miR-146a、miR-155表達(dá)水平與各指標(biāo)的關(guān)系采用Person相關(guān)分析。以P < 0.05

為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-146a、miR-155在RA患者及健康者PBMCs

的表達(dá)水平 miR-146a及miR-155在RA患者PBMCs中的相對(duì)表達(dá)水平分別是對(duì)照組的2.436倍

及1.982倍，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

2.2 miR-146a及miR-155的表達(dá)與RA患者ESR、CRP、DAS28評(píng)分及IgM型RF的相關(guān)性

RA患者miR-146a、miR-155的表達(dá)水平與ESR、CRP、DAS28呈正相關(guān)（P < 0.05），與IgM型RF無相關(guān)性（P > 0.05）。

3 討 論

Bhanjia等[5]首次發(fā)現(xiàn)在RA患者的血漿中存在抗GW小體的自身抗體，GW與miRNAs介導(dǎo)的mRNA降解和翻譯抑制有關(guān)，并發(fā)現(xiàn)一些miRNA在RA患者的外周血單核細(xì)胞、關(guān)節(jié)液、關(guān)節(jié)滑膜組織及滑膜成纖維細(xì)胞中上調(diào)，其中包括miR-146a及miR-155。陳巖等[6]研究認(rèn)為，miR-146a、miR-155均與天然免疫和適應(yīng)性免疫細(xì)胞的生成有關(guān)，在某些免疫性炎癥性疾病或炎癥環(huán)境中會(huì)過表達(dá)，可能通過下調(diào)toll/白細(xì)胞介素-1（IL-1）受體信號(hào)下游分子，進(jìn)而負(fù)反饋對(duì)免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)做出微調(diào)。

miR-146前體經(jīng)加工后有2種形式：miR-146a和miR-146b。Nakasa等[7]發(fā)現(xiàn)，RA患者滑膜組織中的成熟miR-146a和初始miR-146a/b的表達(dá)量明顯高于骨關(guān)節(jié)炎患者。miR-146a主要在滑膜組織表面和襯里層表達(dá)。同時(shí)在RA滑膜成纖維細(xì)胞中miR-146a/b經(jīng)IL-1和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）刺激后明顯上調(diào)。尹志華等[8]發(fā)現(xiàn)，miR-146a在RA患者PBMCs和血漿中的表達(dá)水平均高于對(duì)照組，表明在RA患者滑膜細(xì)胞、組織及外周血中miR-146a的異常表達(dá)，可能與miRNAs的免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。近年來研究報(bào)道，miR-155在免疫反應(yīng)中有著極為重要的生物學(xué)作用。Pauley等[9]發(fā)現(xiàn)，RA患者PBMCs中miR-155的表達(dá)水平是健康對(duì)照組的1.8倍。于萍等[10]發(fā)現(xiàn)，RA患者滑膜成纖維細(xì)胞（SFs）中miR-155的表達(dá)明顯高于骨關(guān)節(jié)炎患者，且miR-155可抑制RASFs中基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）的分泌，因此認(rèn)為，miR-155可以通過下調(diào)特定MMPs分子的表達(dá)來抑制RASFs增殖和降低侵襲能力，減少組織損傷，這也為RA提供了有前景的治療方向。以上研究表明，miR-146a及miR-155與RA的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

ESR、CRP是判定RA炎癥活動(dòng)度和病情緩解的可靠指標(biāo)。DAS28評(píng)分是判定RA活動(dòng)程度的通用標(biāo)準(zhǔn)。IgM型RF約見于85%～95%的RA患者，是臨床診斷的重要指標(biāo)[11]。測(cè)定血清ESR、CRP、IgM型RF結(jié)合DAS28評(píng)分，更能反映RA患者病情狀況。

本研究檢測(cè)30例RA患者及30例健康者PBMCs中miR-146a及miR-155的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-146a及miR-155在RA患者的表達(dá)水平均高于健康者，與國外學(xué)者的研究結(jié)果一致，miR-146a及miR-155表達(dá)顯著上調(diào)可能與RA中豐富的炎性細(xì)胞因子有關(guān)。進(jìn)一步研究miR-146a及miR-155表達(dá)水平與ESR、CRP、DAS28評(píng)分及IgM型RF的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)RA患者miR-146a、miR-155的表達(dá)水平與ESR、CRP、DAS28呈正相關(guān)，與IgM型RF無相關(guān)性，這提示miR-146a及miR-155的表達(dá)上調(diào)與RA病情活動(dòng)性相關(guān)。

綜上，本研究認(rèn)為，miR-146a和miR-155在RA患者PBMCs中的表達(dá)水平與RA病情活動(dòng)性相關(guān)，可作為RA疾病活動(dòng)的有效指標(biāo)，對(duì)RA病情嚴(yán)重程度的判斷有一定價(jià)值。為了進(jìn)一步闡明miR-146a和miR-155在RA發(fā)病機(jī)制中的作用，筆者將會(huì)加大樣本量深入研究，為RA的診斷和治療提供新的思路。

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收稿日期：2016-05-17；修回日期：2016-07-20