不同濃度雷公藤甲素肝損傷大鼠模型初步研究

張亞敏 林文津 徐小妹 徐榕青 于虹敏

福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院福建省醫(yī)學(xué)測(cè)試重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350001

不同濃度雷公藤甲素肝損傷大鼠模型初步研究

張亞敏 林文津 徐小妹 徐榕青 于虹敏

福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院福建省醫(yī)學(xué)測(cè)試重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350001

目的建立不同濃度雷公藤甲素肝損傷大鼠模型，為雷公藤譜毒相關(guān)性研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法以SD大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，尾靜脈注射給藥，優(yōu)選給藥劑量、取血時(shí)間，以大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）為檢測(cè)指標(biāo)，同時(shí)觀察大鼠肝臟病理變化。結(jié)果與空白對(duì)照組比較，尾靜脈給藥12 h后低、中、高三個(gè)劑量組（700、1000、1300μg/kg雷公藤甲素）大鼠血清ALT、AST水平均顯著增高（P約0.01），且大鼠肝臟均出現(xiàn)不同程度的肝損傷，呈現(xiàn)劑量依賴性。結(jié)論采用大鼠尾靜脈注射700、1000、1300μg/kg雷公藤甲素可以建立不同程度肝損傷大鼠模型。

雷公藤甲素；肝損傷；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；大鼠模型

雷公藤引起的毒性反應(yīng)事件頻繁報(bào)道，成為近半個(gè)世紀(jì)以來(lái)發(fā)生中毒事件最多的中草藥之一，其毒性在傳統(tǒng)中草藥中排第三，毒副作用發(fā)生率高達(dá)58.1%[1]。雷公藤甲素既是雷公藤中活性最高的環(huán)氧二萜內(nèi)酯化合物，同時(shí)也是引起毒副作用的主要成分[2-13]。肝臟是雷公藤甲素毒性作用最重要的靶器官之一[14-15]。建立雷公藤早期預(yù)警機(jī)制對(duì)及時(shí)調(diào)整給藥劑量（包括停藥）、防止肝損傷的進(jìn)一步惡化、實(shí)現(xiàn)雷公藤的安全用藥具有十分重要的意義[7-8]。本課題組目前已分別嘗試建立三維毛細(xì)管電泳指紋圖譜、雙向蛋白電泳指紋圖譜等與雷公藤肝損害的相關(guān)性，以期實(shí)現(xiàn)雷公藤肝腎毒性的早期預(yù)警。在雷公藤肝損害的譜毒相關(guān)性研究中，如何建立不同程度肝損害動(dòng)物模型，是保證研究取得預(yù)期成果的關(guān)鍵[16-20]。本試驗(yàn)研究不同給藥劑量雷公藤大鼠肝毒性，以建立不同程度肝損害動(dòng)物模型，為雷公藤譜毒相關(guān)性研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠（本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究遵循福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院所制訂的有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用的指南，并經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)），雌雄各半，體重180耀220g（1.3個(gè)月齡），由福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，動(dòng)物合格證號(hào)院SYXK（閩）2011-002。保持室溫25益，每天保證12h光照，空氣流通，相對(duì)濕度維持在40%耀50%之間。

1.2 試驗(yàn)藥物

本實(shí)驗(yàn)中使用的藥物雷公藤甲素購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)院1566-200201。1，2-丙二醇，氯化鈉，均為分析純級(jí)，實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.3 主要儀器

AL204型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；TGL-16G型高速離心機(jī)（上海博通公司）；5L/H50w型超純水機(jī)（Aquapr艾科浦）；KQ2200E型超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；酶標(biāo)儀（上海博通公司）。

1.4 藥液的制備

精密稱取雷公藤甲素對(duì)照品0.0100 g，置于50mL燒杯中，加入20 m L的1，2-丙二醇溶液，在熱水浴中超聲溶解30 min，然后，轉(zhuǎn)移到100 mL的容量瓶中，用0.9%的生理鹽水定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含100μg甲素的溶液，備用，即為雷公藤甲素注射液。高劑量組、中劑量組、低劑量組注射用藥液均通過(guò)此溶液稀釋一定的倍數(shù)得到。以20%的1，2-丙二醇作為稀釋溶液?？瞻讓?duì)照組為20%的1，2-丙二醇的氯化鈉溶液。

1.5 給藥方法

采用尾靜脈注射給藥的方法，先將大鼠固定在固定器內(nèi)，讓其尾巴完全暴露在外，注射前需用75%乙醇輕輕地將尾部擦拭均勻，使得大鼠尾部的血管擴(kuò)張，選取大鼠尾部?jī)蓚?cè)的靜脈進(jìn)行尾靜脈注射，給藥前先禁食一晚，給藥后大鼠自由飲水，進(jìn)食。

1.6 采樣方法

采用眼球后靜脈叢取血的方法取血，取血前需用乙醚先進(jìn)行麻醉，注意每次取血量不多于1mL。

1.7 觀測(cè)指標(biāo)

觀察給藥前后大鼠的攝食量、大便、小便、行為、皮毛等的變化。動(dòng)物處死后還需進(jìn)行解剖，觀察其肝臟的變化。測(cè)定大鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）的含量。

1.8 最佳采樣時(shí)間的選擇

隨機(jī)抽取SD大鼠3只，尾靜脈注射給藥，給藥劑量為600μg/kg。分別于給藥前及給藥后4、8、12、24、28、32、36 h進(jìn)行眼眶采血，采血量約為0.5 mL，4000 r/min離心10 min（離心半徑6 cm），得到血清，置于4益冰箱保存，測(cè)定大鼠血清中ALT、AST含量，結(jié)果顯示在12 h左右大鼠ALT、AST達(dá)到最大值，故選取第12小時(shí)作為采樣時(shí)間。

1.9 最佳給藥劑量的選擇

將體重180耀220 g的SD大鼠隨機(jī)分為9組，分別注射雷公藤甲素700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1600μg/kg。于注射前和注射后12 h采樣，觀察注射后SD大鼠的死亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1600μg/kg劑量組SD大鼠在給藥后36 h內(nèi)死亡，1400μg/kg劑量組SD大鼠在給藥后48 h內(nèi)死亡，其他劑量組未有大鼠死亡，所以給藥劑量應(yīng)選擇低于1400μg/kg的給藥劑量。選定1300μg/kg作為高劑量組給藥劑量。

1.10 不同給藥劑量雷公藤甲素SD大鼠肝毒性

將體重180耀220 g的SD大鼠隨機(jī)分為4組，除一組作為空白對(duì)照組外，低、中、高三個(gè)劑量組分別注射雷公藤甲素700、1000、1300μg/kg。于注射前和注射后12 h采樣，觀察SD大鼠活動(dòng)情況，測(cè)定血清中ALT、AST的水平，大鼠肝臟采用4%多聚甲醛固定，脫水、浸蠟包埋后切片，貼于載玻片上，用二甲苯梯度脫蠟，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，在200倍光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)依標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P約0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠的一般狀態(tài)

高、中、低劑量三個(gè)劑量組給藥后的大鼠均出現(xiàn)活動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍、被毛無(wú)光澤、輕微掉毛等現(xiàn)象，高劑量組尤為明顯，所有的SD大鼠基本拒食。高、中、低三個(gè)劑量組的大鼠均有棕色便腹瀉的情況，高劑量組大鼠腹瀉等毒性癥狀則更為明顯。

2.2 不同劑量組大鼠ALT、AST水平比較

與空白對(duì)照組比較，大鼠尾靜脈給藥700、1000、1300μg/kg雷公藤甲素12 h后，高、中、低劑量組大鼠血清中ALT、AST水平均顯著增高，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P約0.01）。見表1。

表1 不同劑量組大鼠ALT、AST水平比較（U/L，x±s）

2.3 大鼠肝臟病理切片光鏡觀察

從SD大鼠肝臟病理切片的觀察中發(fā)現(xiàn)，低劑量組肝細(xì)胞發(fā)生了輕度退變，肝血竇輕度擴(kuò)張；中劑量組大鼠中央靜脈周圍肝細(xì)胞輕度退變，肝血竇輕度擴(kuò)張，匯管區(qū)擴(kuò)大，小膽管增生，少量慢性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，膽管增生；高劑量組大鼠的中央靜脈周圍肝細(xì)胞輕度退變，肝血竇輕度擴(kuò)張，近中央靜脈周圍肝細(xì)胞輕度退變，中央靜脈瘀血，周邊肝細(xì)胞輕度退變，匯管區(qū)輕度擴(kuò)大，少量慢性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖1。

圖1 不同劑量組大鼠肝臟病理切片光鏡觀察（HE染色，200伊）

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)高、中、低劑量組SD大鼠血清中ALT、AST兩個(gè)生化指標(biāo)在注射雷公藤甲素后有較大增高，ALT、AST的相對(duì)變化量與空白對(duì)照組有顯著差異。當(dāng)注射劑量超過(guò)一定濃度，ALT和AST的增高值隨著給藥劑量的增大而增加，呈現(xiàn)劑量依賴性，超過(guò)1400μg/kg大鼠將出現(xiàn)死亡。故要想制備不同程度肝損害動(dòng)物模型，一定要控制好給藥劑量這個(gè)關(guān)鍵因素。

目前臨床上使用的雷公藤制劑為雷公藤多苷片[21]和雷公藤內(nèi)酯軟膏，還沒有雷公藤甲素注射液制劑，所以在試驗(yàn)劑量的選擇上，本研究主要參考文獻(xiàn)[8]的給藥劑量。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中還研究了200、300μg/kg等多個(gè)劑量組的生化指標(biāo)在給藥前后的變化，結(jié)果顯示只有當(dāng)雷公藤甲素的濃度達(dá)到一定濃度后，才引起ALT、AST升高，超過(guò)一定劑量后大鼠死亡，這與雷公藤甲素的治療窗較窄相一致。

本研究發(fā)現(xiàn)不同的大鼠對(duì)雷公藤甲素的敏感性不同，臨床使用時(shí)由于患者個(gè)體差異較大，可以考慮應(yīng)用個(gè)體化給藥方案來(lái)降低雷公藤甲素在臨床應(yīng)用中的毒性，本研究所建立的不同劑量雷公藤甲素肝毒性大鼠模型為下一步開展雷公藤譜毒相關(guān)性研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Primary study of rat models w ith liver in jury established by different concentrations of triptolide

ZHANG Yamin LINWenjin XU Xiaomei XU Rongqing YU Hongmin
Fujian Academy of Medical Sciences Fujian Key Laboratory of Medical Measurement,Fujian Province,Fuzhou 350001,China

Ob jective To establish ratmodels with liver injury by different concentrations of triptolide,so as to lay the foundation for the relevant researches of spectrum poison of Tripterygium wilfordii.Methods SD ratswere taken as ex-perimental animals and injected via tail vein,the dosage of administration and time of collecting blood were taken opti-mization.The serum alanine aminotransferase(ALT),aspartate aminotransferase(AST)in ratswere taken as testing in-dexes,and the liver pathologic changes in rats were observed at the same time.Results Compared with blank control group,the levels of serum ALT,AST in rats of low,medium and high dose group(700,1000,1300μg/kg of triptolide) after administration for 12 hours via tail vein were significantly increased(P約0.01),and all the rats liver showed dif-ferent degrees of injury,at a dose-dependentmanner.Conclusion Injection of 700,1000,1300μg/kg of triptolide via tail vein can establish ratmodelswith different degrees of liver injury.

Triptolide;Liver injury;Alanine aminotransferase;Aspartate aminotransferase;Ratmodels

R285.5

A

1673-7210（2016）07（a）-0007-03

院2016-03-06本文編輯院張瑜杰）

福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2014J01296）。