基于VEGF調(diào)控SDF-1/CXCR4信號探討可樂定促進滋養(yǎng)細胞的增殖和遷移

張 瑾 趙欣媛 張建華

西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院產(chǎn)二科，陜西西安710024

基于VEGF調(diào)控SDF-1/CXCR4信號探討可樂定促進滋養(yǎng)細胞的增殖和遷移

張 瑾 趙欣媛 張建華

西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院產(chǎn)二科，陜西西安710024

目的探討可樂定（CLO）對滋養(yǎng)細胞增殖、遷移的促進作用及分子機制探討。方法不同濃度的CLO與HTR8-SVneo滋養(yǎng)細胞共培養(yǎng)，MTT和Transwell方法檢測HTR8-SVneo細胞的增殖和遷移，RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、基質(zhì)細胞衍生因子（SDF-1）及其趨化因子受體（CXCR4）的表達水平；將CLO分別與VEGF受體抑制劑（DC101）、CXCR4抑制劑（AMD3100）共同作用于HTR8-SVneo細胞，檢測細胞的增殖、遷移能力和CXCR4的表達水平。結(jié)果CLO顯著促進HTR8-SVneo細胞的增殖和遷移（P＜0.05），并上調(diào)VEGF、CXCR4的表達水平（P＜0.05）；抑制劑DC101和AMD3100均可抑制可樂定對滋養(yǎng)細胞增殖和遷移的促進作用，且VEGF可調(diào)控SDF-1、CXCR4的表達（P＜0.05）。結(jié)論CLO可通過VEGF激活SDF-1/CXCR4信號，促進HTR8-SVneo滋養(yǎng)細胞的增殖和遷移。

可樂定；HTR 8-SVneo細胞；增殖遷移；血管內(nèi)皮生長因子；基質(zhì)細胞衍生因子/基質(zhì)細胞衍生因子趨化因子受體

妊娠高血壓疾病是妊娠期特有的并發(fā)癥，嚴重危害母嬰健康，是孕產(chǎn)婦和胎兒發(fā)病和死亡的主要原因之一［1］。近年的研究表明，滋養(yǎng)層細胞通過遷移、入侵子宮內(nèi)壁，促進胚胎著床穩(wěn)定，完善胎盤的生長發(fā)育［2-3］。胚胎的穩(wěn)定著床、生長發(fā)育和胎盤的形成都與絨毛外滋養(yǎng)層細胞增殖遷移和浸潤等過程密切相關(guān)［4］?？蓸范ǎ╟lonidine，CLO）是咪唑類衍生物，化學(xué)名為N-（2，6-二氯苯基）-4，5-二氫-1H-咪唑-2-胺，是一種α2-腎上腺素受體激動劑，臨床上用于治療高血壓的一種中樞性降壓藥［5-6］，主要用于治療中、高度高血壓，與其他類降壓藥合用時具有協(xié)同作用［7］。有研究表明［8］，CLO可以促進血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的生成，調(diào)節(jié)胎盤血管內(nèi)皮細胞與滋養(yǎng)層細胞之間的交聯(lián)。VEGF可以上調(diào)基質(zhì)細胞衍生因子（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）及其趨化因子受體（chemokine receptor-4，CXCR4）的表達［9-11］，SDF-1/CXCR4信號具有抗凋亡作用［12］，而CXCR4拮抗劑可以抑制SDF-1/CXCR4信號，抑制人胰腺癌細胞的遷移和入侵［13］。本研究在已有工作的基礎(chǔ)上，以經(jīng)典的HTR8-SVneo滋養(yǎng)細胞為研究對象，探討CLO對滋養(yǎng)層細胞增殖和遷移的影響及可能的分子機制。

1 料與方法

1.1 實驗材料與試劑

1.1.1 實驗材料HTR8-SVneo細胞，購于中科；上海生命科學(xué)研究；細胞中心。

1.1.2 實驗試劑CLO粉劑、AMD3100（CXCR4抑制劑，Sigma公司；DC101（VEGF受體抑制劑，英國Imclone公司）；胎牛血清（FBS，美國Gibco公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基（杭州四季青）；RT-PCR試劑盒、RTPCR引物（大連寶生物公司）；抗體（美國BIO SYSTEM公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組HTR8-SVneo細胞用RPMI-1640培養(yǎng)基（10%FBS）置于培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中孵育，選用處于生長期的細胞進行實驗。分組如下：①control組（Con），②CLO組（CLO作用濃度分別為0.1、1、10μmol/L），③CLO+DC101組（10μmol/LCLO，40μg/mLDC101），④CLO+AMD3100組（10μmol/LCLO，1μmol/L AMD3100），⑤CLO+DC101+AMD3100組（10μmol/LCLO，40μg/mLDC101，1μmol/LAMD3100）。1.2.2 MTT檢測細胞增殖細胞接種于培養(yǎng)板（0.2×104個/孔），按照以上分組分別加入不同濃度的CLO和抑制劑DC101、AMD3100，培養(yǎng)48 h后加入MTT，再培養(yǎng)4 h后加入DMSO，震蕩10min，酶標儀測定570 nm處的OD值。

1.2.3 Transwe l l檢測細胞遷移Transwell板上室加入HTR8-SVneo單細胞懸液（1×105個/孔），再按照以上分組加入不同濃度的CLO和抑制劑DC101、AMD3100，下室加入RPMI-1640培養(yǎng)液（10%FBS），培養(yǎng)48 h后甲醇固定濾膜下表面的細胞，蘇木精染色，高倍顯微鏡（200×）下計數(shù)。

1.2.4 RT-PCR檢測VEGF、CXCR4 mRNA表達細胞接種于培養(yǎng)板（1×105個/孔），按照分組加入不同濃度的CLO和抑制劑DC101、AMD3100，培養(yǎng)48 h后收集細胞，Trizol提取細胞總RNA，加入引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，RNA反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)條件：25℃5 min，42℃60 min，70℃5 min；SYBR-Premix Ex-TaqⅡ試劑盒及ABI7500 RT-PCR儀進行DNA擴增；產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠掃描成像。RT-PCR引物具體見表1。

1.2.5 Wes tern b l ot檢測VEGF、CXCR4蛋白表達細胞提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，總蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，再分別加入相應(yīng)的一抗稀釋液（1：1000），4℃封閉過夜，洗膜后加入二抗（1：500）孵育1 h，顯影成像。

表1 RT-PCR引物

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 11.5進行實驗數(shù)據(jù)分析，電泳圖像用Quanity One軟件進行灰度分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用One-way ANOVA。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 果

2.1 CLO促進HTR 8-SVneo細胞增殖和遷移

不同濃度CLO（0.1～10μmol/L）作用于HTR8-SVneo細胞發(fā)現(xiàn)，和Con組比較，CLO顯著促進細胞的增殖和遷移（P＜0.05），且呈劑量依賴關(guān)系。見圖1。

圖1 可樂定促進HTR8-SVneo細胞增殖和遷移

2.2 可樂定上調(diào)VEGF、SDF-1、CXCR 4的表達水平

與Con組比較，CLO促進滋養(yǎng)細胞VEGF、SDF-1和CXCR4mRNA和蛋白的表達，且隨著濃度的增加而上調(diào)（P＜0.05）。見圖2。由此可以推測，CLO對滋養(yǎng)細胞增殖、遷移的促進作用可能與上調(diào)VEGF、SDF-1、CXCR4的表達水平有關(guān)。

圖2 可樂定促進HTR8-SVneo細胞VEGF、CXCR4表達水平

2.3 DC101/AMD3100抑制HTR 8-SVneo細胞增殖和遷移

CLO（10μmol/L）分別與抑制劑DC101或AMD3100作用于滋養(yǎng)細胞，與CLO組比較，抑制VEGF、CXCR4的表達，滋養(yǎng)細胞的增殖和遷移指數(shù)明顯下降（P＜0.05）。見圖3。由此可知，VEGF和CXCR4可以促進滋養(yǎng)細胞的增殖和遷移。

圖3 DC101和AMD3100抑制HTR8-SVneo細胞的增殖和遷移

2.4 VEGF可調(diào)控SDF-1/CXCR 4信號

已知CXCR4是SDF-1特異受體，兩者交聯(lián)后可以產(chǎn)生信號通路，加入VEGF的抑制劑DC101后，SDF-1和CXCR4的表達水平顯著下降（P＜0.05）（圖4）。說明VEGF可以調(diào)節(jié)SDF-1/CXCR4信號的激活，進而發(fā)揮作用。

3 論

CLO可用于治療妊娠高血壓［5］，尤其與其它類降壓藥合用時具有協(xié)同作用，療效更加顯著［14］，但其作用機制還不十分清楚。我們前期的實驗結(jié)果表明，CLO在0.1～10μmol/L濃度范圍可顯著促進HTR8-SVneo滋養(yǎng)細胞的增殖和遷移。VEGF是血管內(nèi)皮生長因子，在妊娠過程中，VEGF及其受體主要在胎盤組織的滋養(yǎng)層細胞、血管內(nèi)皮細胞中表達，可以促進滋養(yǎng)層細胞增殖、侵襲等［15-16］。趨化因子SDF-1在胚胎發(fā)育、血管生成等生理過程中發(fā)揮重要作用［17］，文獻報道，CXCR4是目前已知的SDF-1特異受體［18］，兩者交聯(lián)后可以產(chǎn)生信號通路，參與人體很多生理活動，例如促進血管的生成［19-20］，作為淋巴細胞的共刺激分子參與免疫調(diào)節(jié)作用，參與妊娠期胚胎的著床過程［21］等。為了進一步探究可樂定的促滋養(yǎng)細胞增殖遷移的作用是否與VEGF和CXCR4有關(guān)，通過實驗發(fā)現(xiàn)可樂定可以上調(diào)滋養(yǎng)細胞VEGF和SDF-1/CXCR4的表達，且具有劑量依賴性，進一步探究可知，分別抑制VEGF、CXCR4的表達，可樂定對滋養(yǎng)細胞增殖、遷移的促進作用被減弱，說明CLO促進滋養(yǎng)細胞增殖和遷移的作用機制與VEGF、SDF-1/CXCR4的表達有關(guān)，且VEGF可以正向調(diào)控SDF-1/CXCR4的激活，從而得出結(jié)論，CLO通過VEGF激活SDF-1/CXCR4信號，從而發(fā)揮促進滋養(yǎng)細胞增殖和遷移的作用。絨毛外滋養(yǎng)層細胞在妊娠期發(fā)揮著十分重要的作用［22］，滋養(yǎng)層細胞的正常增殖、遷移、浸潤等，可以確保胎盤著床穩(wěn)定，胎兒健康發(fā)育［23］，還可分泌各種分子，促進子宮內(nèi)血管生成［24］。研究表明，娠高征患者胎盤著床淺，子宮螺旋小動脈障礙［25］，絨毛血管發(fā)生異常，這些病癥與滋養(yǎng)層細胞的增殖、遷移、浸潤至子宮肌壁間等密切相關(guān)［26-28］。本實驗結(jié)果表明CLO可以促進滋養(yǎng)細胞的增殖和遷移，且通過VEGF激活SDF-1/CXCR4信號發(fā)揮作用，說明VEGF和SDF-1/CXCR4信號可以作為CLO治療妊娠高血壓的新靶咖，為臨床研究提供依據(jù)。然而體內(nèi)是一個極其復(fù)雜的環(huán)境，各種分子和信號通路相互交聯(lián)相互作用，故具體的作用機制還有待進一步的深入研究。

圖4 DC101抑制HTR8-SVneo細胞SDF-1和CXCR4的表達

［1］Kintiraki E，Papakatsika S，Kotronis G，et al.Pregnancy-Induced hypertension［J］.Hormones（Athens，Greece），2015，14（2）：211-223.

［2］Goldman-Wohl D，Yagel S.Regulation of trophoblast invasion：from normal implantation to pre-eclampsia［J］. Molecular and Cellular Endocrinology，2002，187（1）：233-238.

［3］黃今，馬海英.胎盤滋養(yǎng)層細胞的功能［J］.東南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2015（2）：304-308.

［4］Underhill LA，Robins JC.Trophoblast Development in the murine preimplantation embryo［J］.Seminars in Reproductive Medicine，2016，34（1）：57-62.

［5］徐云根，張寧，何義，等.可樂定治療原發(fā)性頑固性高血壓的療效觀察［J］.藥學(xué)實踐雜志，2013，31（3）：210-211，214.

［6］Krieger EM，Drager LF，Giorgi D，et al.Resistant hypertension optimal treatment trial：a randomized controlled trial［J］.Clinical cardiology，2014，37（1）：1-6.

［7］de Souza Hobaika AB，da Cruz Trigueiro M，de Souza VP， et al.Late maternal hypotension after administration of a mini-dose of clonidine added to epidural analgesia for labor［J］.SOJAnesthesiol Pain Manag，2014，1（1）：2.

［8］Xu B，Charlton F，Makris A，et al.Antihypertensive drugs methyldopa，labetalol，hydralazine，and clonidine improve trophoblast interaction with endothelial cellular networks in vitro［J］.Journal of Hypertension，2014，32（5）：1075-1083.

［9］武莉芳，劉苑，楊海霞，等.妊娠高血壓疾病患者內(nèi)皮功能及炎性因子的變化［J］.疑難病雜志，2014，12（9）：966-967，970.

［10］Hong X，Jiang F，Kalkanis SN，et al.SDF-1 and CXCR4 are up-regulated by VEGF and contribute to glioma cell invasion［J］.Cancer Letters，2006，236（1）：39-45.

［11］Tang JM，Wang JN，Zhang L，etal.VEGF/SDF-1 promotes cardiac stem cellmobilization and myocardial repair in infarcted heart［J］.Cardiovascular Research，2011，91（3）：402-411.

［12］Jaleel MA，Tsai AC，Sarkar S，et al.Stromal cell-derived factor-1（SDF-1）signalling regulates human placental trophoblast cell survival［J］.Molecular human reproduction，2004，10（12）：901-909.

［13］MoriT，DoiR，KoizumiM，etal.CXCR4 antagonist inhibits stromal cell-derived factor 1-induced migration and invasion of human pancreatic cancer［J］.Molecular Cancer Therapeutics，2004，3（1）：29-37.

［14］錢岳晟.抗高血壓藥物的聯(lián)合應(yīng)用（下）［J］.中華醫(yī)學(xué)信息導(dǎo)報，2004，19（24）：18.

［15］項靜英，陸牡丹，，趙軍，等.胎盤生長因子在妊娠期高血壓疾病中的表達及意義［J］.中國婦幼保健，2011，26（12）：1865-1866.

［16］Bills VL，Hamdollah-Zadeh M，Soothill PW，etal.The role of VEGF-A 165 b in trophoblast survival［J］.BMC Pregnancy and Childbirth，2014，14（1）：1-8.

［17］Hitchon C，Wong K，Ma G，eta.l.Hypoxia-induced production of stromal cell-derived factor1（CXCL12）and vas-cular endothelial growth factor by synovial fibroblasts［J］. Arthritis Rheum，2002，46（10）：2587-2597.

［18］徐楗熒，楊桂艷，劉彥，等.基質(zhì)細胞衍生因子-1（SDF-1）表達與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的關(guān)系［J］.生殖與避孕，2014，34（6）：511-514..

［19］Ziegler M，Hughes C.The SDF-1/CXCR4 axis utilizes mTOR signal transduction to promote angiogenesis（278.8）［J］.The FASEB Journal，2014，28（1 Supplement）：278.

［20］Liao YX，F(xiàn)u ZZ，Zhou CH，et al.AMD3100 reduces CXCR4-mediated survival and metastasis of osteosarcoma by inhibiting JNK and Akt，but not p38 or Erk1/2，pathways in in vitro and mouse experiments［J］.Oncology reports，2015，34（1）：33-42.

［21］孟麗嬋，權(quán)會麗.胎盤中SDF-1/CXCR4的表達與妊娠期高血壓疾病的關(guān)系［J］.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2012，20（10）：65-67.

［22］Ji L，Brkic J，Liu M，et al.Placental trophoblast cell differentiation：physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia［J］.Molecularaspectsofmedicine， 2013，34（5）：981-1023.

［23］Lee CQ，Gardner L，Turco M，et al.What is trophoblast？A combination of criteria define human first trimester trophoblast［J］.Stem Cell Reports，2016，6（2）：257-272..

［24］徐京晶.絨毛外滋養(yǎng)細胞在妊娠子宮螺旋動脈重塑過程中的作用機制研究［D］.武漢：華中科技大學(xué)，2010.

［25］Jovanovic M，Stefanoska I，Radojcic L，et al.Interleukin-8（CXCL8）stimulates trophoblast cellmigration and invasion by increasing levels of matrix metalloproteinase（MMP）2 and MMP9 and integrinsα5 andβ1［J］.Reproduction，2010，139（4）：789-798.

［26］耿麗紅，王冬梅，喬拉.妊高征胎盤中VEGF的表達和滋養(yǎng)細胞分泌功能的關(guān)系［J］.新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2003，26（5）：467-469.

［27］Enders AC.Fine structure of anchoring villi of the human placenta［J］.Am FAnat，1968，122（3）：419-452.

［28］Bolte AC，van Geijn HP，Dekker GA.Pathophysiology of preeclampsia and the role of serotonin［J］.Eur JObstet Gynecol Reprod Biol，2001，95（1）：12-21.

Clonidine promotes HTR8-SVneo cells proliferation and m igration ability via activating SDF-1/CXCR4 signal by VEGF

ZHANG Jin ZHAO Xinyuan ZHANG Jianhua
The Second Division of Obstetrics，Second Affiliated Hospital to Medical School of Xi'an Medical College，Shaanxi Province，Xi'an 710024，China

Ob jective To investigate the effects of Clonidine on proliferation and migration of HTR8-Svneo cells and exploremechanism.Methods MTT and Transwellmethodswere used to determine the proliferation andmigration abilities of HTR8-SVneo cells after incubated with Clonidine.Vascular endothelial growth factor（VEGF）and stromal cellderived factor-1（SDF-1），chemokine receptor-4（CXCR4）were evaluated by RT-PCR and Western blot.The proliferation and migration weremeasured after incubated with VEGFR inhibitor（DC101）or CXCR4 antagonist（AMD3100）.And CXCR4 expression level was evaluated after incubated with DC101.Results Clonidine can promote proliferation and migration of HTR8-SVneo cells（P＜0.05）.VEGF and CXCR4 expression level were notably up-regulated（P＜0.05）. DC101 and AMD3100 inhibit HTR8-SVneo cells proliferation，migration and DC101 suppressed CXCR4 expression（P＜0.05）.Conclusion Clonidine promotes proliferation and migration abilities of HTR8-SVneo cells by activating SDF-1/CXCR4 signaling via VEGF.

Clonidine；HTR8-SVneo cells；Proliferation；Migration；Vascular endothelial growth factor；Stromal cellderived factor-1/chemokine receptor-4

R714.25

A

1673-7210（2016）05（c）-0035-05

2016-02-17本文編輯：蘇暢）