超早期高壓氧治療對脊髓全橫斷損傷大鼠股骨骨鈣、骨生物力學(xué)及骨膠原的影響①

劉敏，伍賢平，童敏，伍西羽，周金平

·基礎(chǔ)研究·

超早期高壓氧治療對脊髓全橫斷損傷大鼠股骨骨鈣、骨生物力學(xué)及骨膠原的影響①

劉敏，伍賢平，童敏，伍西羽，周金平

目的探討超早期高壓氧治療對脊髓全橫斷損傷大鼠股骨骨鈣、骨生物力學(xué)及骨膠原的影響。方法75只Sprague-Daw ley大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（n=15）、模型組（n=20）和高壓氧組（n=40），其中高壓氧組又分為3小時(shí)組（高壓氧1組，n=20）和12小時(shí)組（高壓氧2組，n=20）。假手術(shù)組僅行椎板切除術(shù)，其他三組均行T10水平脊髓完全橫向切斷術(shù)。高壓氧1組和高壓氧2組分別于術(shù)后第3、12小時(shí)開始高壓氧治療，10 d為1個(gè)療程，共3個(gè)療程。治療后，各組取右股骨測定股骨生物力學(xué)性能參數(shù)，測定骨鈣、骨羥脯氨酸（Hyp）含量；HE染色和Masson染色觀察骨小梁和骨膠原形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果治療后，與假手術(shù)組比較，模型組股骨結(jié)構(gòu)力學(xué)和材料力學(xué)參數(shù)下降（P＜0.05），骨干重、骨鈣及Hyp含量減少（P＜0.05）；骨小梁及骨膠原數(shù)目減少，稀疏、斷裂、排列不整。與模型組和高壓氧2組比較，高壓氧1組股骨結(jié)構(gòu)力學(xué)和材料力學(xué)參數(shù)均增高，骨干重、骨鈣及Hyp含量增加（P＜0.05），骨小梁及骨膠原數(shù)目增多，連續(xù)性較好，排列較整齊。結(jié)論超早期高壓氧治療可明顯改善脊髓全橫斷損傷大鼠股骨骨鈣含量，改善骨膠原含量及質(zhì)量，改善生物力學(xué)性能。

脊髓全橫斷；高壓氧；超早期；股骨；骨鈣；骨生物力學(xué)；骨膠原；大鼠

［本文著錄格式］劉敏，伍賢平，童敏，等.超早期高壓氧治療對脊髓全橫斷損傷大鼠股骨骨鈣、骨生物力學(xué)及骨膠原的影響［J］.中國康復(fù)理論與實(shí)踐，2016，22（10）：1145-1150.

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脊髓損傷是一種嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷，常常帶來難以恢復(fù)的感覺運(yùn)動(dòng)功能障礙。繼發(fā)的骨質(zhì)疏松（osteoporosis，OP）因易致骨折［1-4］進(jìn)一步阻礙患者的康復(fù)進(jìn)程。有資料顯示，完全性脊髓損傷較不完全性脊髓損傷發(fā)生骨質(zhì)疏松的可能性高6.17倍［4］，完全性脊髓損傷者發(fā)生骨折的風(fēng)險(xiǎn)大于不完全性脊髓損傷患者［5］。Modlesky等用高分辨率MRI檢測病程2年以上的完全性脊髓損傷患者股骨遠(yuǎn)端、脛骨近端微觀結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后骨小梁微觀結(jié)構(gòu)衰退，骨折危險(xiǎn)度增加［6］。目前尚無有效的方法阻止脊髓損傷后骨質(zhì)疏松的發(fā)生［7］。

有關(guān)脊髓損傷后骨量的變化及骨質(zhì)疏松防治的研究具有重要的臨床意義。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，超早期高壓氧治療可改善脊髓全橫斷損傷大鼠脊髓水腫，促進(jìn)其后肢運(yùn)動(dòng)功能的部分恢復(fù)［8］，改善后肢骨密度［9-10］，并可改善其血生化及骨轉(zhuǎn)換［11］。但超早期高壓氧治療對脊髓全橫斷損傷大鼠骨質(zhì)量的影響如何目前國內(nèi)外尚未見報(bào)道。

有文獻(xiàn)表明盡管骨密度和骨強(qiáng)度高度相關(guān)［12］，測定簡單而快捷，并常常用于對骨脆性和骨折危險(xiǎn)性進(jìn)行預(yù)測［13］；但大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究的結(jié)果表明，骨密度不是預(yù)測骨質(zhì)疏松性骨折的唯一標(biāo)準(zhǔn)，單純骨量增加，骨質(zhì)量不一定相應(yīng)增加，有時(shí)反而降低［14-15］。有學(xué)者認(rèn)為在預(yù)測骨折方面骨密度只占70%～80%的作用，而力學(xué)結(jié)構(gòu)方面的因素占20%～30%。有些患者骨密度很低卻未發(fā)生骨折，有些患者骨密度尚未低到骨質(zhì)疏松水平卻發(fā)生了骨折，這說明骨折與非骨折患者的骨密度之間存在較大的重疊。因?yàn)閱渭儨y定骨密度不能發(fā)現(xiàn)包括器官和組織水平的結(jié)構(gòu)特性信息，不能完全反映骨的力學(xué)完整性，所以近年來人們更傾向于從骨的力學(xué)和結(jié)構(gòu)特性方面預(yù)測骨折危險(xiǎn)度［16］。骨的力學(xué)性能測試是評價(jià)骨質(zhì)量最直接和最有說服力的指標(biāo)之一。對于骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型，任何治療最重要的目是改善骨的生物力學(xué)性能。

本研究通過對已采用超早期高壓氧治療的脊髓全橫斷損傷大鼠模型，取股骨標(biāo)本進(jìn)行三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)測定大鼠骨生物力學(xué)指標(biāo)，并測定骨膠原及骨鈣的變化，以進(jìn)一步探討超早期高壓氧治療對脊髓全橫斷損傷大鼠骨質(zhì)量的影響。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物分組

清潔級(jí)雌性Sprague-Daw ley大鼠75只，3月齡，體質(zhì)量195～240 g，由本院動(dòng)物室提供，合格證號(hào)SCXK（湘）2003-0003。隨機(jī)分成假手術(shù)組（n=15）、模型組（n=20）及高壓氧組（n=40），其中高壓氧組又分為3小時(shí)組（高壓氧1組，n=20）和12小時(shí)組（高壓氧2組，n=20）。

1.2方法

假手術(shù)組僅行T10椎板切除，不損傷脊髓。模型組、高壓氧組均行T10椎板切除并在該水平橫斷脊髓。實(shí)驗(yàn)過程中對動(dòng)物處置方法符合2006年科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》［17］。

1.2.1模型制備［18］

大鼠術(shù)前禁食12 h，稱重，10%水合氯醛0.3m l/ 100 g（中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院制劑室）腹腔注射麻醉，俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，胸背部剃毛備皮，75%酒精消毒，鋪消毒巾。按肋骨確定椎體序列，自背部正中切開T8-12椎體水平的皮膚、皮下及筋膜，剝離豎脊肌，暴露T9-11椎體棘突及雙側(cè)椎板。模型組和高壓氧組均切除T10椎板，充分暴露T10椎體水平的脊髓，以彎頭眼科鑷輕輕挑起脊髓并用尖銳刀片橫切脊髓，動(dòng)物即刻出現(xiàn)擺尾，雙下肢抽搐或尿失禁，以無菌紗布按壓止血后逐層縫合。假手術(shù)組僅行T10椎板切除，不損傷脊髓，之后逐層縫合。

1.2.2高壓氧處理

HBO1組及HBO2組分別在脊髓損傷后3 h、12 h開始高壓氧治療。將YLC0.5/1A型嬰兒純氧艙（武漢701研究所）改作動(dòng)物艙使用。門縫洗艙法［19］洗艙10min至艙內(nèi)氧濃度達(dá)93%～95%，將艙門關(guān)緊，20m in內(nèi)加壓到2.2個(gè)絕對大氣壓（absolute atmosphere，ATA），穩(wěn)壓40m in（吸氧濃度97%～99%），后用20m in勻速減至環(huán)境壓出艙。為保持艙內(nèi)氧濃度，穩(wěn)壓全過程持續(xù)低流量等量換氣。10 d為1個(gè)療程，共3個(gè)療程，其中第1療程每天2次，第2、3療程每天1次，每個(gè)療程后休息6 d。

1.2.3大鼠飼養(yǎng)及護(hù)理

術(shù)后每只動(dòng)物肌肉注射青霉素16萬U/d，連續(xù)1周。每天定量供應(yīng)充足飼料和水，在安靜、通風(fēng)、清潔環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，任意進(jìn)食大鼠全價(jià)顆粒飼料（約含鈣1.5%和磷0.9%，本院動(dòng)物室）和自來水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～25℃，相對濕度40%～70%。

模型組、高壓氧1組和高壓氧2組均采用相同的護(hù)理。①人工排尿：術(shù)后每天早晚2次，排尿時(shí)，左手撐起大鼠腹部，右手觸摸找到充盈的膀胱，然后按住膀胱底，自上而下輕柔擠壓，逼尿排出；②防止壓瘡：擠壓膀胱排尿后，及時(shí)清理會(huì)陰或包皮，使其保持干燥，被尿液浸濕的肢體及時(shí)用溫肥皂水清洗，并用電吹風(fēng)吹干。將動(dòng)物放在軟墊上，并常改變體位，局部撒敷壓瘡粉。預(yù)防后肢水腫。

1.3指標(biāo)測定

1.3.1股骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)力學(xué)指標(biāo)測定

取用生理鹽水紗布包裹的大鼠右股骨，-20℃保存。測試前4～6 h常溫解凍，用游標(biāo)卡尺測定股骨長軸、短軸，然后將股骨放在萬能材料試驗(yàn)機(jī)上（跨距= 20mm），以2mm/m in的速度下壓股骨中段，記錄載荷-變形曲線。之后用游標(biāo)卡尺測量長軸、短軸方向的壁厚，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)根據(jù)有關(guān)力學(xué)公式［20］計(jì)算有關(guān)參數(shù)，即最大載荷、破壞載荷、最大橈度、能量吸收、極限強(qiáng)度、破壞強(qiáng)度、彈性模量及剛度系數(shù)等。

1.3.2骨鈣及羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）含量測定

將上述完成生物力學(xué)測試的右股骨于80℃烤箱烘烤至恒重，稱量骨干重，然后將標(biāo)本置于6mmol/L鹽酸中，108℃恒溫消化24 h，取過濾液，將濾液分成兩份，一份用Hyp試劑盒測定骨Hyp的含量；一份用乙二胺四乙酸絡(luò)合滴定法測骨鈣含量。

1.3.3形態(tài)學(xué)觀察

每組各取左股骨一只（已剔除表面軟組織），4%多聚甲醛固定，10%EDTA磷酸鹽緩沖液脫鈣，常規(guī)方法脫水，石臘包埋，切片，厚5μm，分別進(jìn)行HE染色和Masson三色法染色，采用Olympus-BH2顯微鏡觀察骨小梁形態(tài)和骨膠原纖維形態(tài)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以（xˉ±s）表示，采用方差分析進(jìn)行比較，并根據(jù)方差齊性或不齊性分別采用LSD或Tamhane作兩兩比較。顯著性水平α=0.05。

2　結(jié)果

2.1死亡情況

實(shí)驗(yàn)期間，共死亡大鼠20只，其中模型組、高壓氧1組和高壓氧2組分別為8只、5只、7只死亡，總死亡率26.7%。脊髓損傷后死亡率33.3%，主要死因?yàn)槲改c道、泌尿系并發(fā)癥及自噬后創(chuàng)面感染，死亡者未列入統(tǒng)計(jì)。

2.2股骨干重、骨鈣及Hyp含量

假手術(shù)組股骨干重、骨鈣及Hyp含量均高于其他三組（P＜0.05）。高壓氧1組股骨干重、骨鈣及Hyp含量均高于模型組及高壓氧2組（P＜0.05）。見表1。

2.3股骨結(jié)構(gòu)力學(xué)性能參數(shù)

假手術(shù)組股骨最大載荷、破壞載荷、最大橈度及能量吸收均明顯高于其他三組（P＜0.05）。高壓氧1組各指標(biāo)高于模型組及高壓氧2組（P＜0.05）。見表2。

2.4股骨材料力學(xué)性能參數(shù)比較

假手術(shù)組股骨彈性模量、剛度系數(shù)、極限強(qiáng)度和破壞強(qiáng)度均高于其他組（P＜0.05）。高壓氧1組各指標(biāo)高于模型組及高壓氧2組（P＜0.05）。見表3。

2.5股骨骨小梁形態(tài)變化

假手術(shù)組骨小梁數(shù)目多，小梁間距小，連續(xù)性及完整性好，無吸收、穿孔及斷裂現(xiàn)象，小梁厚度均一。模型組骨小梁數(shù)目明顯減少稀疏，間距增大，連續(xù)性差，小梁明顯吸收、穿孔、斷裂。高壓氧1組骨小梁數(shù)目明顯增多，間距小，連續(xù)性及完整性較好，小梁厚度較均一，骨小梁吸收、穿孔、中斷現(xiàn)象明顯減少。高壓氧2組骨小梁數(shù)目明顯減少，間距大，連續(xù)性及完整性較差，小梁厚度不均一，骨小梁吸收、穿孔、中斷現(xiàn)象較明顯。見圖1。

2.6股骨骨膠原形態(tài)變化

假手術(shù)組骨膠原纖維粗壯，致密緊奏呈板層樣，排列規(guī)則，連續(xù)性好，無斷裂及溶解現(xiàn)象，染色為鮮綠色（成熟色）。模型組骨膠原纖維數(shù)目明顯減少，稀疏，形態(tài)變細(xì)，排列不規(guī)則，并可見明顯斷裂、溶解現(xiàn)象，著色較差，染色為淺綠色。高壓氧1組骨膠原纖維明顯增粗，增多，排列較規(guī)則、密集，連續(xù)性較好，膠原纖維斷裂及溶解現(xiàn)象明顯減少，纖維之間有斜向纖維相連，染色為鮮綠色。高壓氧2組骨膠原纖維數(shù)目明顯減少，排列稀疏，連續(xù)性較差，膠原纖維斷裂及溶解現(xiàn)象較明顯，染色為淺綠色。見圖2。

表1　治療后各組大鼠股骨干重、骨鈣及骨HYP含量比較（mg/g）

表2　治療后各組大鼠股骨結(jié)構(gòu)力學(xué)性能參數(shù)比較

表3　治療后各組大鼠股骨材料力學(xué)性能參數(shù)比較

圖1　治療后各組骨小梁形態(tài)變化（HE染色，200×）

圖2　治療后各組骨膠原形態(tài)變化（Masson三色法，200×）

3　討論

生物力學(xué)特性是反映骨生長代謝情況的一個(gè)重要指標(biāo)，它是骨量、骨結(jié)構(gòu)連續(xù)性、骨皮質(zhì)厚度及骨材料特性的綜合反映［21-23］。骨生物力學(xué)參數(shù)可較直接地反映骨的抗骨折能力，是評定治療手段有效性的客觀依據(jù)。三點(diǎn)彎曲力學(xué)試驗(yàn)是評價(jià)骨的生物力學(xué)特征較為常用的手段，其反映骨結(jié)構(gòu)力學(xué)指標(biāo)主要有最大載荷、破壞載荷、最大橈度及能量吸收等，反映骨的整體抗骨折能力，骨皮質(zhì)厚薄及骨小梁多少均可引起它們的變化，即骨的幾何形態(tài)決定骨的結(jié)構(gòu)力學(xué)特性；反映骨材料力學(xué)指標(biāo)則主要有骨彈性模量（又稱內(nèi)在硬度）、骨剛度系數(shù)（又稱外在硬度）、極限強(qiáng)度和破壞強(qiáng)度等參數(shù)，反映骨的自身強(qiáng)度和韌性，與骨的大小及形態(tài)無關(guān)，主要由骨的構(gòu)成成分及膠原的含量、排列決定，即與骨無機(jī)質(zhì)含量及骨膠原等有機(jī)質(zhì)相關(guān)［24-25］。骨膠原含量增加，形成提供骨礦化框架機(jī)械支持功能的膠原纖維增多，使得鈣鹽等無機(jī)質(zhì)沉積礦化，從而能夠預(yù)防及治療骨質(zhì)疏松［26-27］。骨Hyp為Ⅰ型膠原的代謝物，測量骨Hyp含量可以很好地預(yù)測骨質(zhì)疏松的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［28］。同樣，這些變化也直接影響骨的綜合力學(xué)強(qiáng)度。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，脊髓橫斷大鼠出現(xiàn)明顯骨質(zhì)疏松表現(xiàn)。超早期高壓氧治療可明顯改善脊髓全橫斷損傷大鼠股骨骨鈣及骨膠原蛋白含量，改善股骨骨小梁及骨膠原的形態(tài)，并改善其生物力學(xué)性能。

正常骨由骨基質(zhì)和細(xì)胞組成，細(xì)胞包括骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞。骨基質(zhì)包括有機(jī)質(zhì)和無機(jī)質(zhì)兩類，有機(jī)質(zhì)中90%為Ⅰ型膠原蛋白，它是骨的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，并使其具有一定強(qiáng)度；無機(jī)質(zhì)主要包括羥磷灰石和膠體磷酸鈣，以結(jié)晶的形式沉積于膠原上，無機(jī)質(zhì)與膠原相結(jié)合，使骨骼既有一定的硬度，又有一定的彈性。骨的形成是鈣磷灰石等骨礦物質(zhì)沉積在成骨細(xì)胞分泌的骨基質(zhì)中的過程［30］。鈣、磷是骨礦物質(zhì)的主要成分，Hyp是骨基質(zhì)骨膠原的主要氨基酸。超早期高壓氧可能通過及時(shí)迅速改善脊髓損傷部位的缺血缺氧，促進(jìn)神經(jīng)纖維再生和傳導(dǎo)功能恢復(fù)，使骨細(xì)胞活性逐漸恢復(fù)［11，31］，并迅速改善骨微循環(huán)，增強(qiáng)骨微循環(huán)調(diào)節(jié)功能，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)Hyp的合成和鈣鹽沉積，改善骨小梁及骨膠原的形態(tài)和微細(xì)結(jié)構(gòu)，既增加骨骼的硬度，又增加骨骼的韌性，從而防止骨生物力學(xué)性能的下降。

總之，超早期高壓氧治療可明顯改善脊髓全橫斷損傷大鼠股骨骨鈣含量，改善骨膠原含量及質(zhì)量，并改善其生物力學(xué)性能，為其臨床應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Effect of Ultra-early Hyperbaric Oxygenation on Bone Calcium，Biomechanical Properties and Bone Collagen of Femur in Ratswith Complete SpinalCord Transection Injury

LIUMin，WU Xiɑn-ping，TONGMin，WU Xi-yu，ZHOU Jin-ping
Department of Rehabilitation，The Second Xiangya Hospital，Central South University，Changsha，Hunan 410011，China
Correspondence to LIUMin.E-mail：lium in22626@126.com

Objective To explore the effectof ultra-early hyperbaric oxygenation（HBO）on bone calcium，biomechanicalpropertiesand bone collagen of femur in ratswith complete spinal cord transaction. Methods A totalof 75 Sprague-Daw ley ratswere random ly divided into sham group（n=15），model group（n=20）and HBO group（n=40）.HBO group was divided into three hours group（HBO1 group，n=20）and twelve hours group（HBO2 group，n=20）.All groups underwent laminectomy at T10，while themodel group，HBO1 group and HBO2 group underwent complete spinal cord transection at the same level.Three hours and twelve hours after surgery，HBO1 group and HBO2 group

HBO，respectively，for three courseswith ten days in a course.A fter treatment，the femoral biomechanical properties，bone calcium and hydroxyproline（Hyp）were determined.Themorphology of bone trabecula and the bone collagen was observed with HE staining and Masson triad color staining，respectively.Results After treatment，comparedwith the sham group，the femoralbiomechanicalproperties，the contentof bone calcium and Hyp decreased in themodelgroup（P＜0.05）；compared with themodelgroup and HBO2 group，they increased in HBO1 group（P＜0.05）.The numberof bone trabecula and the bone collagen decreased，and derangementand sparsenesswere observed in themodel group；however，the changeswere substantiallymild in HBO1 group.Conclusion Ultra-early HBO could increase the content of bone calcium and Hyp of femur，improve themorphology of the femur bone collagen，and improve the femoral biomechanical properties in ratswith complete spinal cord transection.

complete spinal cord transection；hyperbaric oxygenation；ultra-early stage；femur；bone calcium；bone biomechanical properties；bone collagen；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.10.007

湖南省科技廳基金項(xiàng)目（No.2008SK3108）。

中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院，湖南長沙市410011。作者簡介：劉敏（1965-），女，漢族，湖南長沙市人，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向：高壓氧醫(yī)學(xué)。E-mail：liumin22626@126.com。

R651.2

A

1006-9771（2016）10-1145-06

（2016-04-25

2016-09-05）