小白菜自交不親和性相關(guān)基因的分子標(biāo)記開發(fā)

賈永鵬　李霞　周國林等

摘要：以自交親和系WS-199和自交不親和系WS-85為親本雜交獲得的F2分離群體為供試材料，采用BSA法結(jié)合SNP芯片技術(shù)，篩選出與自交不親和性相關(guān)的SNP標(biāo)記，并將SNP差異位點(diǎn)序列信息與白菜基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析，并進(jìn)一步開發(fā)SSR標(biāo)記，共獲得了與自交不親和性相關(guān)的SSR分子標(biāo)記BrA1-2、BrA1-3和BrA1-14，為分子標(biāo)記輔助自交不親和性雜交種生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：小白菜；自交不親和性；SNP；分子標(biāo)記

中圖分類號(hào)：S634.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1001-3547（2016）08-0038-04

小白菜（Brassiea eampestris ssp.chinensis Makino）又稱不結(jié)球白菜，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，生長(zhǎng)期短，在適宜環(huán)境條件下可進(jìn)行周年種植，為我國長(zhǎng)江中下游及南方地區(qū)種植的重要蔬菜種類之一。小白菜的自交不親和現(xiàn)象十分普遍，利用自交不親和系生產(chǎn)F₁代雜交種成為小白菜雜種育種的重要方法之一。但是，由于自交不親和的表型容易受到環(huán)境條件和植株生理狀況的影響，導(dǎo)致植株的親和性難以判斷，致使在配置雜交組合和種子生產(chǎn)時(shí)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，準(zhǔn)確性差。利用分子標(biāo)記輔助選擇，可以大大提高育種的效率。

小白菜自交不親和性主要由s位點(diǎn)復(fù)等位基因控制。當(dāng)雄蕊花粉粒攜帶的s等位基因與雌蕊的基因相同時(shí)，花粉管生長(zhǎng)受到抑制，表現(xiàn)出自交不親和；當(dāng)花粉粒攜帶的s等位基因與雌蕊的基因不相同時(shí)，花粉管正常生長(zhǎng)，表現(xiàn)為自交親和。在育種實(shí)踐中，能夠快速鑒定自交不親和性的S單元型至關(guān)重要。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用分子標(biāo)記鑒定S單元型已成為目前主要的方法之一。前人做了很多研究，Nasrallah等利用SLG6的cDNA克隆作為探針，對(duì)多個(gè)不同S單元型的全基因組DNA進(jìn)行RFLP分析，獲得了多個(gè)與S單元型連鎖的RFLPs標(biāo)記，初步建立了一種利用DNA分子標(biāo)記技術(shù)快速鑒定s單元型的方法，可以在苗期鑒定材料的S單元型，比田間更加可靠；Nishio等利用PCR-RFLP對(duì)10個(gè)白菜和10個(gè)甘藍(lán)材料的SLG基因多態(tài)性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)這種方法可以在十字花科的蔬菜中鑒定S單元型以及F₁雜種的純度。寇小培以甘藍(lán)型油菜為材料，利用與自交不親和基因連鎖的分子標(biāo)記輔助選育油菜自交不親和系，最終得到了改良的甘藍(lán)型油菜自交不親和系。因此，分子標(biāo)記在自交不親和性中的利用越來越重要，而開發(fā)新的自交不親和性標(biāo)記成為當(dāng)前的重點(diǎn)。

本研究以自交親和系WS-199和自交不親和系WS-85為親本構(gòu)建的F2分離群體為材料，采用BSA法和油菜60K SNP芯片雜交技術(shù)，對(duì)小白菜自交不親和性相關(guān)基因的分子標(biāo)記進(jìn)行設(shè)計(jì)與開發(fā)，為后續(xù)利用自交不親和性進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種提供可靠的理論依據(jù)與技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試材料為自交親和系WS-199和自交不親和系WS-85（由武漢市蔬菜科學(xué)研究所栽培與采后室提供）為親本構(gòu)建的F₂分離群體。于2014年9月底，將F₂群體種子播于大田，2015年1月將幼苗移栽到大棚中（武漢市黃陂區(qū)武湖基地），2015年3月進(jìn)行套袋自交。所有材料依照田間常規(guī)方法進(jìn)行種植和管理。

1.2試驗(yàn)方法

①F₂群體親和性調(diào)查、DNA的提取及BSA混池構(gòu)建 a.F₂群體親和性調(diào)查。在2015年3月對(duì)F₂群體中的開花植株進(jìn)行套袋自交，調(diào)查植株的角果生長(zhǎng)和膨大情況，以及植株的結(jié)實(shí)情況，最終判斷植株的親和性。

b.DNA提取。選取苗期的小白菜鮮嫩葉片，采用改良CTAB法提取DNA。用UV-1800 PC紫外分光光度計(jì)（上海譜達(dá)儀器有限公司）測(cè)定DNA濃度，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，取部分原液稀釋到50 ng/mL作模板，其他放于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

c.BSA混池構(gòu)建。從群體中選取性狀明顯的親和系植株和不親和系植株各17株，采用DNAsecure Plant Kit新型植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司，產(chǎn)品編號(hào)DP320）提取DNA，且DNA樣品保存在-80℃。利用組群分離分析法（BSA）構(gòu)建不親和池與親和池，對(duì)DNA進(jìn)行等量混合，構(gòu)成4個(gè)不親和基因池與4個(gè)親和基因池，用于芯片分析及后續(xù)引物篩選。

②SNP芯片設(shè)計(jì)采用油菜60K SNP芯片進(jìn)行雜交。a.DNA定量、擴(kuò)增。放在0.1 mol/L NaOH中變性，加入MA2和MSM，放在37℃雜交爐中擴(kuò)增20～24 h。

b.DNA片段化。加入FMS，在37℃干浴鍋1 h。

c.DNA富集。加入155μL異丙醇，在4℃冰箱中放置30 min，倒出液體，室溫下干燥1 h。

d.DNA片段回收。加入RA1，用銀箔紙封口，在48℃雜交鍋中培養(yǎng)1 h。

e.DNA變性。在干浴鍋于95℃下變性20 min。

EDNA與芯片雜交。準(zhǔn)備雜交盒，在芯片的每個(gè)樣品孔點(diǎn)樣12 μL，放在48℃雜交爐中16～24 h，轉(zhuǎn)速調(diào)至5檔。

g.洗芯片與染色。

h.芯片掃描。采用BeadArray Reader激光共聚焦掃描系統(tǒng)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

③SSR引物設(shè)計(jì)及篩選通過芯片數(shù)據(jù)分析處理，將獲得的差異序列和白菜基因組進(jìn)行Blast對(duì)比分析，選取同源序列相似度高的基因序列區(qū)段，進(jìn)行下一步SSR引物的開發(fā)，并提交到http：∥wsmartins.net/websat/數(shù)據(jù)庫。SSR引物由上海生工工程公司（武漢）合成。

PCR反應(yīng)體系：DNA模板1 μL，引物1μL，10xPCR Buffer 1μL，dNTPs 0.2 μL，Mg²⁺0.8 μL，Taq聚合酶0.2μL，用ddH20補(bǔ)充至10 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃3 min；94℃ 30 s，55～56℃ 30 s，72℃30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min；25℃ 30 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物采用6%聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳檢測(cè)，在電壓200 V下70～80 min后，進(jìn)行銀染和顯影，用清水沖洗干凈。在室溫下自然晾干，統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增條帶，并拍照保存。

2結(jié)果與分析

2.1 SNP芯片分析

對(duì)不同混池間芯片分析后，將SNP數(shù)據(jù)經(jīng)Genome Studio軟件進(jìn)行基因分型處理，通過不親和與親和數(shù)據(jù)之間的比較分析，共獲得100個(gè)差異位點(diǎn)，然后從芯片對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)庫中下載這100個(gè)差異位點(diǎn)序列，將下載的100個(gè)差異位點(diǎn)序列和白菜基因組進(jìn)行對(duì)比，選取同源序列相似度大于98%的位點(diǎn)數(shù)據(jù)。分析表明，這些位點(diǎn)主要集中分布在白菜基因組的第1連鎖群（2517 659～24 006 839）和第10連鎖群（8 961 370-16 442 481）。

2.2 SSR分子標(biāo)記開發(fā)

針對(duì)第1和第10連鎖群上包含的差異堿基序列區(qū)段，在線設(shè)計(jì)SSR引物32對(duì)，部分引物序列如表1。將32對(duì)引物在親和池與不親和池中進(jìn)行DNA擴(kuò)增，共有3對(duì)引物BrA1-2、BrA1-3和BrA1-14在混合池中表現(xiàn)出多態(tài)性（圖1）。

2.3群體單株驗(yàn)證

利用引物BrA1-2對(duì)F₂群體中的親和單株進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，90株親和單株中僅有2個(gè)交換單株，遺傳距離約2.2 cM（圖2）。

3討論與結(jié)論

Batemant4]首次提出了關(guān)于自交不親和性受單位點(diǎn)復(fù)等位基因控制的遺傳模式，為自交不親和性研究奠定了重要基礎(chǔ)。在s復(fù)等位基因位點(diǎn)上包含有S位點(diǎn)特異性糖蛋白SLG、S位點(diǎn)受體激酶SRK、S位點(diǎn)富含半胱氨酸蛋白SCR和SP11。當(dāng)花粉中的SCR或SP11與柱頭中的SRK、SLG相互識(shí)別，引發(fā)了自交不親和反應(yīng)。葛婷婷㈣利用不結(jié)球白菜（矮腳黃）002和210為親本，構(gòu)建了F₂分離群體，開發(fā)到了一個(gè)與自交不親和基因連鎖的分子標(biāo)記BrSS15。Katsunori等利用Kal-22（Brasscia rapa substx rapa）和Hal-400（B.rapa substp.pekinensis）構(gòu)建了F₂群體，通過對(duì)群體進(jìn)行2 a的自交不親和性調(diào)查和統(tǒng)計(jì)，結(jié)合884對(duì)SSR標(biāo)記和55對(duì)SNP與indel標(biāo)記進(jìn)行了自交不親和性的QTL分析，定位到了5個(gè)高度不親和性QTL位點(diǎn)BrHLSI-1、BrHLSI-2、BrHLSI-3、BrHLSI-4和BrHLSI-5，它們分別分布在白菜第7、3、2、10、6連鎖群上，而BrPUB8在第1連鎖群。BrPUB8是PUB8的同源基因，而PUB8可能是調(diào)控假性自花授粉植物自交不親和性的關(guān)鍵基因。

隨著全基因組序列鑒定技術(shù)的快速發(fā)展，SNP標(biāo)記作為最新分子標(biāo)記類型，具有密度高、分布范圍廣、分型簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，在分子遺傳研究中逐漸興起，已成功應(yīng)用在油菜QTL定位和全基因組關(guān)聯(lián)分析的研究當(dāng)中。而在白菜研究上，目前，利用油菜60K SNP芯片技術(shù)開發(fā)標(biāo)記非常少見。由于進(jìn)行傳統(tǒng)的雜交測(cè)試（親和指數(shù)法）時(shí)，植株結(jié)實(shí)會(huì)受到外界環(huán)境的影響，因此親和性難以判斷，耗費(fèi)較長(zhǎng)的時(shí)間和較多的人力。本研究將BSA分析法和SNP芯片技術(shù)結(jié)合起來，對(duì)小白菜中普遍存在的自交不親和現(xiàn)象進(jìn)行快速標(biāo)記開發(fā)，并能較快應(yīng)用于自交不親和基因類型的鑒定，加快育種的進(jìn)程，為白菜雜交組合的配置和實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)育種與分子育種的結(jié)合提供參考。