人參醇提后藥渣中人參酸性多糖的分離純化工藝研究Δ

王貴金，杜紅娜，喬　莉，畢　丹，賈繼明（河北以嶺醫(yī)藥研究院有限公司，石家莊　050035）

·制劑與工藝·

人參醇提后藥渣中人參酸性多糖的分離純化工藝研究Δ

王貴金＊，杜紅娜，喬莉，畢丹，賈繼明#（河北以嶺醫(yī)藥研究院有限公司，石家莊050035）

目的：以人參醇提后的藥渣制備的噴霧粉為原料，優(yōu)化人參酸性多糖的分離、純化等工藝。方法：采用以D-半乳糖醛酸為對(duì)照品計(jì)的人參酸性多糖量等為指標(biāo)，優(yōu)化樹脂分離純化、脫鹽、干燥等制備工藝中的方法及條件，并進(jìn)行小試和中試工藝驗(yàn)證。結(jié)果：采用D900型陰離子交換樹脂分離純化人參酸性多糖，上樣量為7.2 mg/g（多糖粗品/干樹脂），徑高比為1∶7；先用水再用0.3 mol/L的NaCl溶液以2倍柱體積（BV）/h的流速洗脫5 BV；超濾法脫鹽，截留分子質(zhì)量為1 kD；選擇噴霧干燥方法制備人參酸性多糖粉末。小試驗(yàn)證試驗(yàn)中產(chǎn)品純度為94.7%，中試驗(yàn)證試驗(yàn)中各指標(biāo)的RSD≤2.42%（n＝3）。結(jié)論：優(yōu)化所得人參酸性多糖的分離、純化工藝穩(wěn)定可靠、簡(jiǎn)便易行，適合于工業(yè)化生產(chǎn)，且產(chǎn)品純度較高。

人參；酸性多糖；D-半乳糖醛酸；分離；純化；制備工藝

人參（Panax ginseng C.A.Mey）是我國(guó)的名貴中藥，具有多種藥效?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》將人參列為上品，言其具有“主補(bǔ)五臟，安精神，定魂魄，止驚悸，明目，開心益智，久服有輕身延年之功效”。因此，人參的各種有效成分及其藥理活性一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)，尤其是對(duì)人參皂苷的研究[1-3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，人參多糖中的人參果膠是人參中的另一種有效成分，其表現(xiàn)出多種生物活性，如增強(qiáng)機(jī)體免疫能力、輔助防治腫瘤、顯著抑制肝損傷和降血糖等[4-6]。人參多糖是由糖醛酸及各種中性糖組成的酸性雜多糖，研究表明，糖醛酸本身或含有糖醛酸結(jié)構(gòu)單元的低聚糖或多糖常表現(xiàn)出十分重要的生物活性[7-8]。

為了充分利用人參資源，筆者利用醇提后的人參藥渣為原料，通過醇沉、酶解、脫色、樹脂吸附、鹽析和脫鹽等方法，分離純化出人參酸性多糖，并以D-半乳糖醛酸含量代替?zhèn)鹘y(tǒng)的葡萄糖含量為特征性指標(biāo)對(duì)各工藝條件進(jìn)行篩選，以得到純度更高的人參酸性多糖。

1　材料

1.1儀器

Cary60型紫外-可見分光光度計(jì)（美國(guó)安捷倫科技公司）；XP105DR型十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器公司）；YC-1800型實(shí)驗(yàn)室低溫噴霧干燥機(jī)（上海雅程儀器設(shè)備有限公司）；DD6M型離心機(jī)（湖南湘立離心機(jī)廠）；超濾系統(tǒng)（美國(guó)PALL公司）。

1.2藥材、藥品與試劑

人參醇提后藥渣經(jīng)水提制成的噴霧粉（自制，人參多糖含量：＞10%）；D-半乳糖醛酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111646-200301，供含量測(cè)定用）；淀粉酶（邢臺(tái)萬達(dá)生物有限公司，批號(hào)：20150901，活性：2 000 U/g）；活性炭（溧陽南山活性炭有限公司）；AB-8和D101型大孔吸附樹脂、D201型陰離子交換樹脂、聚酰胺吸附樹脂、JK008型陽離子交換樹脂和D900型陰離子交換樹脂（滄州寶恩吸附材料有限公司）；四硼酸鈉和間羥聯(lián)苯（美國(guó)Sigma公司）；水為蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1人參多糖粗品的制備

稱取人參醇提后藥渣經(jīng)水提制備的噴霧粉100 g，加入20倍量的水充分溶解[9-10]，經(jīng)離心（4 000 r/min，15 min，離心半徑20 cm，下同）去沉淀，上清液經(jīng)減壓濃縮，加入乙醇，使醇體積分?jǐn)?shù)為60%[11]。醇沉過夜，離心，沉淀經(jīng)60%乙醇洗脫2次后用水充分溶解，加入0.25%的中溫淀粉酶，65酶解30 min。加入1%的多糖專用大孔徑活性炭，脫色40 min，離心，去除活性炭。上清液經(jīng)微孔濾膜過濾，濾液減壓濃縮，加入乙醇，使醇體積分?jǐn)?shù)為60%，醇沉過夜，離心。沉淀經(jīng)60%乙醇洗脫2次，沉淀揮盡乙醇，得人參多糖粗品10g。

2.2間羥聯(lián)苯法測(cè)定D-半乳糖醛酸方法的建立[12]

2.2.1對(duì)照品溶液的制備精密稱取D-半乳糖醛酸15.54 mg，加水溶解并定容至100 ml量瓶中，制備成155.4 μg/ml的對(duì)照品溶液。

2.2.2線性關(guān)系考察精密量取D-半乳糖醛酸對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 ml于具塞試管中，加水至1.0 ml，在冰浴中預(yù)冷后加入12.5 mmol/L四硼酸鈉硫酸溶液6 ml，搖勻，在沸水浴中煮沸10 min。取出以冰浴冷卻至室溫，分別加入0.15%間羥聯(lián)苯溶液80 μl，搖勻，超聲5 min，室溫放置10 min。以1.0 ml水同上操作制得空白對(duì)照，于525 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）。以D-半乳糖醛酸質(zhì)量濃度（c）為橫坐標(biāo)、A值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A＝0.013 4c+0.008 5（r＝0.999 8），表明D-半乳糖醛酸檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為15.54～54.39μg/ml。

2.2.3精密度考察精密稱取同一份供試品溶液，吸取1.0 ml按“2.2.2”項(xiàng)下方法操作測(cè)定其吸光度，重復(fù)6次。結(jié)果RSD＝0.16%（n＝6）。

2.2.4加樣回收率試驗(yàn)精密稱取已知含量的人參多糖粗品3份，分別精密加入不同量的D-半乳糖醛酸，相應(yīng)稀釋過濾后制備成供試品溶液。按照“2.2.2”項(xiàng)下方法操作測(cè)定吸光度，代入回歸方程，計(jì)算得平均回收率為100.41%（RSD＝0.79%，n＝3）。

2.3樣品的樹脂純化工藝

2.3.1樹脂的預(yù)處理 （1）陰離子交換樹脂：用水浸泡24 h，再水洗至澄清，傾去水后加1 mol/L HCl溶液浸泡24 h，水洗至中性，最后加入1 mol/L NaOH溶液浸泡24 h，并用水洗至中性。（2）陽離子交換樹脂：用水浸泡24 h，再水洗至澄清，傾去水后加1 mol/L NaOH溶液浸泡24 h，水洗至中性，加入1 mol/L HCl溶液浸泡24 h，用水洗至中性。（3）大孔吸附樹脂和聚酰胺吸附樹脂：95%乙醇浸泡24 h，并以95%乙醇洗至加等量的水無氣泡產(chǎn)生，然后再水洗至無醇味。

2.3.2酸性多糖的樹脂純化工藝的確定 （1）樹脂型號(hào)的篩選。精密稱取多糖粗品0.4 g至200 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度為2.0 mg/ml的多糖溶液。分別精密稱取經(jīng)預(yù)處理的6種干樹脂約5.0 g，置于250 ml具塞錐形瓶中。分別精密加入2.0 mg/ml（c0）的多糖溶液25 ml，33下恒溫振蕩12 h，待樹脂充分吸附后過濾，測(cè)定吸附殘液中多糖質(zhì)量濃度（c）。按下列公式計(jì)算各樹脂的多糖吸附量q（mg/g）及多糖吸附率E（%）：q＝（c0－c）V/m；E＝（c0－c）/c0×100%。式中：V為溶液體積（ml），m為加入樹脂的質(zhì)量（g）。6種樹脂對(duì)多糖的靜態(tài)吸附試驗(yàn)結(jié)果顯示，D900型陰離子交換樹脂對(duì)多糖的吸附能力高于其他樹脂，以下試驗(yàn)均采用此樹脂進(jìn)行。不同類型樹脂吸附多糖的結(jié)果具體詳見表1。

表1　不同類型樹脂吸附多糖的結(jié)果Tab 1　The results of adsorption of ginseng polysaccharides by different types of resins

（2）動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)。精密稱取經(jīng)預(yù)處理的樹脂5.0 g，濕法裝柱，將2.0 mg/ml的多糖粗品溶液由滴液漏斗向柱中滴流，控制流速為2 ml/min。每隔2 min收集過柱液并測(cè)定多糖質(zhì)量濃度，以流出液質(zhì)量濃度為上樣液質(zhì)量濃度的10%來確定泄漏點(diǎn)，隨即停止上樣。根據(jù)測(cè)試的多糖質(zhì)量濃度，以A值為縱坐標(biāo)，以收集多糖溶液累積體積量（ml）為橫坐標(biāo)，繪制樹脂對(duì)多糖粗品溶液的動(dòng)態(tài)吸附穿透曲線，確定上樣量。結(jié)果顯示，當(dāng)上樣量達(dá)18 ml時(shí)，流出液質(zhì)量濃度為上樣液質(zhì)量濃度的10%。確定多糖粗品溶液上樣量為≤18 ml，即上樣量≤36 mg，即每1g樹脂上樣量≤7.2mg人參多糖粗品。

（3）洗脫劑的選擇。精密稱取經(jīng)預(yù)處理的樹脂約5.0 g，共6份，置于250 ml具塞錐形瓶中。分別加入25 ml 2.0 mg/ml的多糖粗品溶液，33下恒溫振蕩12 h后過濾，測(cè)定吸附殘液中多糖含量，計(jì)算吸附量。在上述已知吸附量的6份樹脂中，分別加入40 ml水以及0.1、0.2、0.3、0.5、1 mol/L NaCl溶液各40 ml進(jìn)行洗脫，33下恒溫振蕩24 h。分別測(cè)定洗脫液中多糖含量，篩選出解吸率最高的洗脫劑。計(jì)算解吸率（D，%）＝c×V/Q× 100%，c為解吸溶液中多糖的含量，V為解吸溶液的體積，Q為多糖的吸附量。結(jié)果，解吸率依次為0.96%、20.16%、60.32%、80.69%、75.34%、73.42%，表明隨著NaCl濃度的增加，多糖的解吸率呈不斷上升的趨勢(shì)；0.3 mol/L NaCl溶液達(dá)到最高，之后隨著NaCl濃度的繼續(xù)增加，解析率略有下降。據(jù)此結(jié)果，且為了后期除鹽方便，洗脫時(shí)可以先用水洗脫，再選擇0.3 mol/L NaCl溶液為洗脫劑。

（4）洗脫劑用量的確定。精密稱取經(jīng)預(yù)處理的樹脂5.0 g，濕法裝柱，將2.0 mg/ml的多糖粗品溶液由滴液漏斗向柱中滴流，控制流速為2 ml/min，上樣18 ml，靜置12 h。以0.3 mol/L NaCl溶液洗脫，控制流速為2 ml/min，每3 min收集1次過柱液并測(cè)定多糖質(zhì)量濃度，共收集42 ml。根據(jù)測(cè)得的多糖質(zhì)量濃度，繪制樹脂對(duì)多糖的動(dòng)態(tài)解吸曲線，確定洗脫劑用量。結(jié)果顯示，采用0.3 mol/L NaCl溶液進(jìn)行解吸時(shí)，洗脫峰集中、對(duì)稱，無明顯拖尾現(xiàn)象。30 ml的體積基本上可以將多糖完全洗脫下來，約為5倍柱體積（BV），故確定洗脫劑用量為5BV。

（5）洗脫體積流量的確定。取樹脂5.0 g濕法裝柱，按動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)方法，取多糖粗品溶液18 ml上樣，分別控制洗脫體積流量為1、1.5、2、2.5、3 BV/h，并用5 BV的0.3 mol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫，繪制不同洗脫體積流量下多糖量的曲線。結(jié)果表明，隨著洗脫體積流量的增大，樹脂對(duì)人參多糖的吸附量減少，這可能是因?yàn)橄疵擉w積流量過大，NaCl與多糖分子之間未發(fā)生足夠的接觸而使離子交換不完全所致。因此，從是否洗脫徹底、節(jié)省時(shí)間及大生產(chǎn)的可行性等方面進(jìn)行考慮，選擇洗脫體積流量為2BV/h。洗脫體積流量-多糖量曲線見圖1。

圖1　洗脫體積流量-多糖量曲線Fig 1　Elution volume flow-polysaccharide content curve

（6）徑高比的確定。取不同量的樹脂，用直徑為15 mm的玻璃色譜柱裝柱，使徑高比分別為1∶5、1∶7、1∶9，按最大上樣量（每1 g樹脂上樣量≤7.2 mg多糖粗品）精密吸取多糖粗品溶液，以2 BV/h的體積流量過樹脂，分別用3 BV的水洗脫，再用5 BV的0.3 mol/L NaCl溶液洗脫，收集洗脫液，測(cè)定多糖量，結(jié)果見表2。

表2　采用不同徑高比條件下多糖量測(cè)定結(jié)果（mg）Tab 2　Polysaccharide contents in case of different diameter to height ratios（mg）

由表2可知，隨著徑高比的增加，樹脂對(duì)多糖的吸附呈增加趨勢(shì)。綜合考慮多糖的吸附率及工業(yè)生產(chǎn)的可行性，選擇樹脂徑高比為1∶7。

綜上，酸性多糖的樹脂純化工藝為采用D900型陰離子樹脂，流速為2 BV/h，徑高比為1∶7，上樣量≤7.2 mg/g（多糖粗品/樹脂）；先用水洗脫，再用0.3 mol/L NaCl溶液洗脫，洗脫體積為5BV。

2.4鹽析方法的確定

取上述洗脫液，60減壓濃縮至溶液變渾濁為止，渾濁液至冰箱中冷藏過夜，離心，收集沉淀，加入純化水，加熱使沉淀溶解至澄清。

2.5脫鹽方法的確定

2.5.1脫鹽方法的選擇對(duì)上述鹽析后的溶液，選擇透析法與超濾法進(jìn)行脫鹽，以脫鹽后的溶液經(jīng)硝酸銀溶液檢測(cè)未見渾濁為終點(diǎn)。結(jié)果兩種方法除鹽效果均良好，考慮到大生產(chǎn)時(shí)透析法無法實(shí)現(xiàn)，故選擇超濾法脫鹽。

2.5.2超濾法脫鹽截留分子質(zhì)量的選擇取5份鹽析后的樣品，每份含酸性多糖900 mg，分別選擇截留分子質(zhì)量為1、3、5、10、30 kD的不同超濾膜包進(jìn)行脫鹽。超濾洗脫溶劑為超純水，超濾時(shí)的壓力為進(jìn)口2.5 bar、回流口1.8 bar，蠕動(dòng)泵的轉(zhuǎn)速為10 r/min，期間不斷補(bǔ)充洗脫溶劑。檢測(cè)溶劑為10%硝酸銀溶液，超濾脫鹽的終點(diǎn)為母液和流出液加入硝酸銀溶液后均無渾濁發(fā)生。溶液回收并定容，分別測(cè)定不同溶液中酸性多糖量并計(jì)算純度和酸性多糖損失率（P，%）＝（M0－M）/M0× 100%，其中M0為超濾前樣品中酸性多糖量（900 mg），M為超濾后酸性多糖量，結(jié)果見表3。

表3　不同截留分子質(zhì)量超濾條件對(duì)酸性多糖量的影響Tab 3　Effects of acidic polysaccharide contents on ultra-filtration by different molecular weight cut-off

從表3可知，采用截留分子質(zhì)量為3、5、10、30 kD的超濾膜包脫鹽后酸性多糖的損失比較多，產(chǎn)品純度也偏低，故將超濾截留分子質(zhì)量選擇為1kD。

2.6干燥方式的確立

綜合比較減壓干燥、冷凍干燥、噴霧干燥這3種方式的效果。結(jié)果，減壓干燥后樣品復(fù)溶性較差，冷凍干燥和噴霧干燥后樣品復(fù)溶效果相近、顏色也比較接近。為了節(jié)能和工業(yè)化生產(chǎn)需要，故選擇噴霧干燥為樣品的干燥方式。

2.7小試工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

按上述試驗(yàn)確定的方案，取樹脂約400 g裝柱（260 mm× 50 mm），按照陰離子交換樹脂預(yù)處理方法處理備用。取多糖粗品3 g（相當(dāng)于原噴霧粉30 g），溶于300 ml純化水后上樹脂柱，收集過柱液，控制洗脫體積流量為2 BV/h，然后用3 BV的水洗脫。合并過柱液和水洗液，定容后留樣（水洗留樣液），最后用5 BV、0.3 mol/L的NaCl溶液洗脫，控制洗脫體積流量為2 BV/h，收集洗脫液，得到酸性多糖的NaCl洗脫液。經(jīng)鹽析法純化和超濾法除鹽，最后噴霧干燥得酸性多糖粉末1.8 g。測(cè)定醇提藥渣噴霧粉、多糖粗品、水洗留樣液、酸性多糖粉末中酸性多糖量和純度，計(jì)算轉(zhuǎn)移率和出膏率：轉(zhuǎn)移率＝（M－M0）/ M0×100%，式中M為多糖粗品、水洗留樣液、酸性多糖粉末中酸性多糖量，M0為藥渣噴霧粉中酸性多糖量；出膏率＝G/G0× 100%，其中G為多糖粗品、酸性多糖粉末的固形物量，G0為藥渣噴霧粉的投料量，結(jié)果見表4。

表4　小試工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab 4　The results of the lab-scale test

2.8中試工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

按“2.7”項(xiàng)的試驗(yàn)方案，稱取人參醇提后藥渣經(jīng)水提制備的噴霧粉3份各1 kg，按照多糖粗品制備工藝得多糖粗品110 g，經(jīng)樹脂純化、鹽析、除鹽、噴霧干燥得酸性多糖粉末61、64、63 g。測(cè)定3批中試樣品制備過程中醇提藥渣噴霧粉、多糖粗品和干燥后酸性多糖粉末中酸性多糖的含量和純度，以及轉(zhuǎn)移率和出膏率，結(jié)果見表5。

表5　中試工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（%%）Tab 5　The results of the pilot-scale test（%%）

由表5可知，將優(yōu)化后的制備工藝進(jìn)行放大試驗(yàn)，3批產(chǎn)品中各指標(biāo)的RSD≤2.42%（n＝3），且所得酸性多糖的純度和轉(zhuǎn)移率與小試試驗(yàn)結(jié)果相符，說明該工藝穩(wěn)定可靠，可用于工業(yè)化大生產(chǎn)。

3　討論

人參作為我國(guó)珍貴的植物資源雖被廣泛使用，但在工業(yè)上多數(shù)都是將醇提后的人參皂苷用于制劑生產(chǎn)，而醇提后的藥渣則被遺棄。本課題本著“變廢為寶”的理念，以人參醇提后的藥渣為原料對(duì)人參酸性多糖的制備工藝進(jìn)行了研究。

在選擇工藝中的脫色劑時(shí)，筆者首次使用多糖專用的大孔徑活性炭，結(jié)果其對(duì)多糖溶液脫色作用明顯；選擇的D900型陰離子交換樹脂可實(shí)現(xiàn)人參中中性多糖和酸性多糖的有效分離；脫鹽采用超濾法代替?zhèn)鹘y(tǒng)使用的透析法，不僅可節(jié)約時(shí)間，而且適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

本工藝制備的人參酸性多糖，其純度以D-半乳糖醛酸計(jì)，采用間羥聯(lián)苯法測(cè)定結(jié)果在90%以上，而目前報(bào)道的人參多糖純度以D-半乳糖醛酸計(jì)最高的僅達(dá)到了55%以上[13]；而人參多糖純度達(dá)到90%以上的都是以葡萄糖計(jì)采用苯酚-濃硫酸法測(cè)定計(jì)算而得的，但以葡萄糖計(jì)其中包含了較大比例的人參中性多糖，故并不全是酸性多糖的量。因此，本工藝采用以D-半乳糖醛酸計(jì)含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化工藝所制備的產(chǎn)品中以人參酸性多糖為主要成分，其純度也更高。

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（編輯：劉萍）

Study on Separation and Purification Technology of Ginseng Acidic Polysaccharides in the Residue after Ethanol Extraction from Panax ginseng

WANG Guijin，DU Hongna，QIAO Li，BI Dan，JIA Jiming（Hebei Yiling Medicine Research Institute Co.，Ltd.，Shijiazhuang 050035，China）

OBJECTIVE：To optimize the separation and purification technology of ginseng acidic polysaccharides，with the spray powder made of the residue after ethanol extraction from Panax ginseng as the raw material.METHODS：Taking the content of ginseng acidic polysaccharides，which was calculated with D-galacturonic acid as the reference substance，as the index，the method and condition in the preparation technology including resin separation and purification，desalination and drying were optimized，and the lab-scale test and pilot-scale test were conducted for verification.RESULTS：The D900 anion resin was used to purify and separate ginseng acidic polysaccharides，where elution was made successively with water and 0.3 mol/L NaCl solution at a flow rate of 2 BV/h，with a sample amount of 7.2 mg/g（crude polysaccharide/dry resin），a diameter to height ratio of 1∶7 and an elution volume of 5 BV.The ultrafiltration method was used for desalination，where molecular weight cut-off was 1 kD.Spray drying was chosen for the preparation of ginseng acidic polysaccharides powder，the purity of which was 94.7%in the lab-scale test. In the pilot-scale test，the RSDs of all indexes were lower than or equal to 2.42%（n＝3）.CONCLUSIONS：The optimized separation and purification technology of ginseng acidic polysaccharides is stable，reliable，simple，easy，and it is suitable for industrialized production of high-purity products.

Panax ginseng；Acidic polysaccharides；D-galacturonic acid；Separation；Purification；Preparation technology

R285；R284.2

A

1001-0408（2016）28-3957-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.28.21

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）資助項(xiàng)目（No.2012CB518600）

＊工程師，碩士。研究方向：新藥開發(fā)。電話：0311-66703003。E-mail：guijinwang@126.com

正高級(jí)工程師，博士。研究方向：新藥開發(fā)。E-mail：jiajiming@yiling.cn

（2016-01-08

2016-03-18）