酒精對(duì)乳腺癌細(xì)胞表皮生長(zhǎng)因子受體-鈣激活中性蛋白酶通路及細(xì)胞遷移的影響

李勇杰，于慶龍，潘際剛，王宏健，宛 蕾，王旭東

1.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550025；

2.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550025

酒精對(duì)乳腺癌細(xì)胞表皮生長(zhǎng)因子受體-鈣激活中性蛋白酶通路及細(xì)胞遷移的影響

李勇杰1，于慶龍1，潘際剛1，王宏健1，宛 蕾2，王旭東1

1.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550025；

2.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550025

背景與目的：酒精（ethyl alcohol，EtOH）可促進(jìn)乳腺癌的惡性演進(jìn)，但其信號(hào)機(jī)制尚未完全明了。本研究通過(guò)觀察EtOH對(duì)乳腺癌細(xì)胞鈣激活中性蛋白酶（calcium-activated neutral protease，CANP）-周期蛋白E/局部黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）信號(hào)通路和細(xì)胞遷移的影響，以及表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）在其中的介導(dǎo)作用，探討EtOH促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移的信號(hào)機(jī)制。方法：以人乳腺腫瘤細(xì)胞系MCF-7為模型細(xì)胞（MCF-10A乳腺上皮細(xì)胞為對(duì)照）；采用蛋白［質(zhì)］印跡法（Western blot）分析周期蛋白E和FAK蛋白剪切反應(yīng)；通過(guò)傷口愈合實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移效應(yīng)；采用EGFR抑制劑（EGFR inhibitor，EGFR-I）或CANP抑制劑Calpeptin抑制EGFR或CANP活性，觀察抑制劑對(duì)EtOH誘導(dǎo)CANP1大亞基、周期蛋白E/ FAK蛋白剪切及細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果：以EtOH（0.3%）處理模型細(xì)胞可觀察到周期蛋白E和FAK出現(xiàn)明顯蛋白剪切且該效應(yīng)呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性，還觀察到EtOH刺激細(xì)胞遷移活動(dòng)（+47.30%，P＜0.05），但EtOH對(duì)MCF-10A細(xì)胞遷移無(wú)明顯影響；以Calpeptin（10 μmol/L）預(yù)處理模型細(xì)胞，可見(jiàn)EtOH（0.3%）或EGF（10 ng/mL）誘導(dǎo)的周期蛋白E/FAK蛋白剪切效應(yīng)受到明顯抑制；EGFR-I（3 μmol/L）可顯著抑制EtOH誘導(dǎo)的CANP1大亞基和周期蛋白E/ FAK蛋白剪切及細(xì)胞遷移效應(yīng)（-53.00%，P＜0.01）。結(jié)論：EtOH可通過(guò)EGFR激活乳腺癌細(xì)胞CANP信號(hào)活動(dòng)并促進(jìn)細(xì)胞遷移，EGFR-CANP通路參與介導(dǎo)EtOH與EGF之間的串話，提示EGFR-CANP信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子可為防止乳腺癌轉(zhuǎn)移的潛在藥物靶點(diǎn)。

酒精；表皮生長(zhǎng)因子受體；鈣激活中性蛋白酶；細(xì)胞遷移；乳腺癌

包括乳腺癌在內(nèi)的惡性腫瘤的主要致死原因在于腫瘤遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移。酒精（ethyl alcohol，EtOH）與乳腺癌發(fā)病的關(guān)系已經(jīng)得到流行病學(xué)數(shù)據(jù)的支持［1］。近年來(lái)的研究資料顯示，EtOH還可能參與促進(jìn)乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移［2-5］，從而影響乳腺癌患者的生存率。表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）參與促進(jìn)乳腺癌的發(fā)展［6］，乳腺癌細(xì)胞中高活性鈣激活中性蛋白酶（calcium-activated neutral protease，CANP）及CANP依賴(lài)性周期蛋白E蛋白剪切與乳腺癌的不良預(yù)后顯著相關(guān)［7-9］。腫瘤細(xì)胞的遷移活動(dòng)是乳腺癌轉(zhuǎn)移的早期和限速步驟之一。然而，EtOH是否可通過(guò)EGFR刺激乳腺癌細(xì)胞CANP信號(hào)活動(dòng)及細(xì)胞遷移，目前還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

1　材料和方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

人乳腺癌細(xì)胞MCF-7（ER+）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)。MCF-10A乳腺上皮細(xì)胞由重慶第三軍醫(yī)大學(xué)生物化學(xué)教研室惠贈(zèng)。培養(yǎng)基（Dulbecco modified Eagle medium，DMEM）、無(wú)酚紅DMEM、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、胰蛋白酶及青霉素-鏈霉素購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；活性炭處理胎牛血清（charcoalstripped fetal bovine serum，CS-FBS）購(gòu)自法國(guó)BioWest公司；二甲亞楓（dimethylsulfoxide，DMSO）購(gòu)自美國(guó)MPBio公司；人表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）購(gòu)自英國(guó)Peprotech公司；鈣蛋白酶抑制劑Calpeptin購(gòu)自德國(guó)Calbiochem公司；抗周期蛋白E和局部黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）單克隆抗體、抗β-actin抗體、羊抗小鼠IgG-HRP及羊抗兔IgG-HRP購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；EtOH購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；EGFR抑制劑（EGFR inhibitor，EGFR-I）購(gòu)自德國(guó)Merk公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM（高糖，含10%FBS和1%青霉素-鏈霉素）中。MCF-10A細(xì)胞在含10%馬血清、10 ng/mL霍亂毒素、10 μg/mL胰島素、50 ng/mL氫化可的松、20 ng/mL EGF及1%青霉素-鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液中，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 EtOH處理

細(xì)胞在有酚紅完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)自60%滿度后，換成加2.5%CS-FBS的無(wú)酚紅DMEM培養(yǎng)24 h，再以無(wú)血清、無(wú)酚紅DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后按實(shí)驗(yàn)要求加入體積分?jǐn)?shù)0～0.5%的EtOH處理0～24 h。

1.4 EGFR及CANP抑制劑作用的觀察

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為E t O H（0.3%）組、EtOH（0.3%）+Calpeptin（15 μmol/L）組、EGFR-I（3 μmol/L）組和EtOH（0.3%）+EGFR-I（3 μmol/L）組，按實(shí)驗(yàn)要求加入相應(yīng)抑制劑預(yù)處理模型細(xì)胞，再加入EtOH處理0～24 h觀察細(xì)胞遷移變化或裂解細(xì)胞提取蛋白定量后進(jìn)行蛋白印跡分析。

1.5 傷口愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

細(xì)胞種植在12孔板中，有酚紅條件下培養(yǎng)至90%～100%滿度后，無(wú)菌條件下用200 μL槍頭在培養(yǎng)皿底作輕柔十字劃痕，形成單細(xì)胞層無(wú)細(xì)胞區(qū)（寬約1.5 mm），然后以PBS清洗2～3次，以除去漂浮細(xì)胞。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，更換有酚紅或無(wú)酚紅培養(yǎng)基（含1.5%CS-FBS）繼續(xù)培養(yǎng)，按實(shí)驗(yàn)要求加入藥物處理。于倒置顯微鏡下，分別在0和24 h時(shí)間點(diǎn)照相，觀察和分析對(duì)照組和處理組劃痕寬度的變化。各實(shí)驗(yàn)組24 h細(xì)胞遷移距離（mm）=24 h劃痕寬度-0 h劃痕寬度；24 h細(xì)胞遷移率=（24 h對(duì)照組劃痕寬度-24 h處理組劃痕寬度）/24h對(duì)照組劃痕寬度×100%。

1.6 蛋白［質(zhì)］印跡法（Western blot）檢測(cè)目標(biāo)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量變化

細(xì)胞培養(yǎng)至70%滿度，按實(shí)驗(yàn)要求處理細(xì)胞后，加入RIPA細(xì)胞裂解液（使用前20 min加蛋白酶抑制劑使其終濃度為1 mmol/L），在冰上溫育15 min以利充分裂解，然后在4 ℃以20 627×g離心15 min。取樣品上清液留用，采用BCA試劑盒（購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行蛋白定量。進(jìn)行Western blot檢測(cè)時(shí)，每個(gè)泳道按30 μg蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行上樣， SDSPAGE電泳分離蛋白，然后將分離蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜（購(gòu)自美國(guó)Millipore公司）上；5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，以TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min；然后按要求加入FAK單克隆抗體（1∶2 500）或抗CANPI/II小亞基抗體（1∶2 000）室溫雜交1～2 h或4 ℃溫育過(guò)夜。一抗處理后以TBST洗膜3次后，再加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗（1∶2 000）室溫雜交1 h，PVDF膜以化學(xué)發(fā)光試劑盒（購(gòu)自美國(guó)Millipore公司）進(jìn)行顯色，以Syngene Imaging System進(jìn)行成像，以Quantity One對(duì)蛋白印跡條帶進(jìn)行處理和分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析處理。數(shù)據(jù)以表示，組內(nèi)兩樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 EtOH誘導(dǎo)MCF-7乳腺癌細(xì)胞周期蛋白E和FAK蛋白剪切及細(xì)胞遷移

以體積分?jǐn)?shù)為0～0.5%的EtOH刺激模型細(xì)胞3 h，可觀察到周期蛋白E和FAK的蛋白剪切呈劑量依賴(lài)性；以體積分?jǐn)?shù)為0.3%EtOH刺激模型細(xì)胞0～3 h可觀察到時(shí)間依賴(lài)性蛋白剪切。以體積分?jǐn)?shù)為0.3%的EtOH刺激模型細(xì)胞，可見(jiàn)細(xì)胞遷移明顯增快（47.3%±4.0%）。以體積分?jǐn)?shù)為0.3%的EtOH刺激對(duì)MCF-10A乳腺上皮細(xì)胞無(wú)明顯影響（圖1）。

2.2 EtOH誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞周期蛋白E和FAK的蛋白剪切依賴(lài)鈣蛋白酶

以CANP抑制劑Calpeptin預(yù)處理模型細(xì)胞1 h，發(fā)現(xiàn)Calpeptin阻斷EtOH誘導(dǎo)的周期蛋白和FAK蛋白剪切；以EGF（10 ng/mL）刺激模型細(xì)胞可引起與EtOH相似的蛋白剪切效應(yīng)，而此效應(yīng)同樣可以被Calpeptin所阻斷（圖2）。

2.3 EGFR介導(dǎo)EtOH誘導(dǎo)的鈣蛋白酶依賴(lài)性周期蛋白E/FAK蛋白剪切和細(xì)胞遷移

以EGFR-I預(yù)處理細(xì)胞1 h，再以體積分?jǐn)?shù)為0.3%的EtOH刺激模型細(xì)胞3 h，觀察EGFR-I對(duì)EtOH誘導(dǎo)的CANP1、周期蛋白E/FAK剪切反應(yīng)及細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EGFR-I可明顯抑制或阻斷EtOH誘導(dǎo)的上述剪切反應(yīng)，同時(shí)EGFR-I也可明顯抑制EtOH誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移效應(yīng)（53.0%±4.1%，圖3）。

圖 1 EtOH誘導(dǎo)MCF-7乳腺癌細(xì)胞周期蛋白E和FAK蛋白剪切及細(xì)胞遷移Fig. 1 EtOH stimulated the truncation of cyclin E/FAK and migration in MCF-7 breast cancer cells

圖 2 EtOH或EGF誘導(dǎo)的周期蛋白E和FAK蛋白剪切可被鈣蛋白酶抑制劑阻斷Fig. 2 EtOH- or EGF-induced proteolysis of cyclin E/FAK was profoundly reduced by calpain inhibitor， calpeptin

圖 3 EGFR-I 對(duì)EtOH誘導(dǎo)鈣蛋白酶1及周期蛋白E/FAK蛋白剪切和細(xì)胞遷移的影響Fig. 3 Effects of EGFR-I on the proteolysis of calpain1 and cyclin E/FAK and migration induced by EtOH in MCF-7 cells

3　討　論

近年來(lái)，我國(guó)乳腺癌發(fā)病率呈快速增高趨勢(shì)，形勢(shì)不容樂(lè)觀［10］。防止乳腺癌轉(zhuǎn)移是提高患者生存率和生活質(zhì)量的關(guān)鍵，因而對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移的細(xì)胞分子機(jī)制進(jìn)行深入研究具有重要理論和實(shí)際意義?，F(xiàn)有資料顯示，EtOH可通過(guò)EGFR誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化從而促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲［2］。EtOH還可通過(guò)雌激素及Nm23-ITGA5信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌的發(fā)展及腫瘤細(xì)胞侵襲行為［3-4］，EtOH促進(jìn)乳腺癌惡性演進(jìn)還可能與p38γ及巨噬細(xì)胞有關(guān)［5-6］。本研究顯示，EtOH可刺激MCF-7細(xì)胞CANP敏感性底物蛋白分子周期蛋白E和FAK發(fā)生剪切形成小分子產(chǎn)物并促進(jìn)細(xì)胞遷移，但EtOH對(duì)MCF-10A乳腺上皮細(xì)胞遷移無(wú)明顯影響。CANP依賴(lài)性周期蛋白E和FAK與乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)［8-9，11］，提示EtOH促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移可能與胞內(nèi)CANP活性有關(guān)。

本研究組前期研究顯示，EtOH可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞周期蛋白E發(fā)生蛋白剪切［11］，提示EtOH的作用可能與胞內(nèi)CANP有關(guān)。Luo等［12］觀察了EtOH對(duì)低侵襲性乳腺癌細(xì)胞（BT-20、MCF-7及T47D）EGFR家族表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)EtOH可上調(diào)T47D細(xì)胞erbB2、erbB3及erbB4表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞遷移。EGFR（erbB1）信號(hào)通路在乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中也具有重要促進(jìn)作用［7］，但其信號(hào)機(jī)制尚未完全明確。本研究顯示，EGF也可誘導(dǎo)與EtOH相似的周期蛋白E和FAK蛋白剪切效應(yīng)，而以CANP抑制劑Calpeptin預(yù)處理模型細(xì)胞，則EGF或EtOH誘導(dǎo)蛋白剪切效應(yīng)均可被阻斷，提示EtOH誘導(dǎo)的周期蛋白E/FAK蛋白剪切與其激活CANP有關(guān)，且EtOH和EGF可通過(guò)CANP發(fā)生串話。以EGFR抑制劑EGFR-I預(yù)處理模型細(xì)胞，可見(jiàn)EtOH誘導(dǎo)的周期蛋白E/FAK及CANP1大亞基（CANP激活的直接標(biāo)志［11］）蛋白剪切均可被其阻斷，同時(shí)EtOH誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移效應(yīng)也可被EGFR-I所阻斷，說(shuō)明EtOH誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞CANP激活和細(xì)胞遷移效應(yīng)與EGFR有關(guān)。EtOH對(duì)雌激素敏感性MCF-10A細(xì)胞遷移無(wú)明顯影響，這可能與正常乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)CANP活性較低有關(guān)［13］。

總之，本研究表明EtOH可通過(guò)EGFR激活乳腺癌細(xì)胞CANP信號(hào)活動(dòng)并促進(jìn)細(xì)胞遷移，而EGFR下游的CANP-周期蛋白E/FAK信號(hào)活動(dòng)可能參與促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移［14-15］，提示EGFR-CANP信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子可能成為防治乳腺癌轉(zhuǎn)移的潛在藥物靶點(diǎn)，值得深入研究。

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Impacts of ethanol on the epidermal growth factor receptor （EGFR） -calpain signaling and migration

in breast cancer cells

LI Yongjie1， YU Qinglong1， PAN Jigang，1WANG Hongjian1， WAN Lei2， WANG Xudong1
（1.Department of Physiology， Guizhou Medical University School of Basic Medicine， Guiyang 550025， Guizhou Province， China； 2 Department of Pharmacology， Guizhou Medical University School of Basic Medicine， Guiyang 550025， Guizhou Province， China）
Correspondence to: Wang Xudong E-mail: 1157102188@qq.com

Background and purpose: Ethanol has been reported to stimulate progression of breast cancer， yet the underlying mechanism is not fully understood. This study aimed to investigate effects of ethyl alcohol （EtOH） on the calcium-activated neutral protease （CANP）-cyclin E/focal adhesion kinase （FAK） signaling and cell migration in breast cancer cells， as well as the role of epidermal growth factor receptor （EGFR） in the EtOH-stimulated effects， in order to assess the signaling mechanism（s） underlying how EtOH enhances cancer progression. Methods: Human breast cancer cell line MCF-7 was employed as a model system， with MCF-10A mammary epithelial cells as control. In vitro wound healing assay was carried out to evaluate EtOH-induced cell migration. The effects of EtOH or epidermal growth factor on the proteolysis of cyclin E/FAK were detected by Western blot. EGFR inhibitor （EGFR-I） and a specific inhibitorfor CANP， Calpeptin， were applied to pretreat cultured cells to explore their influences on the cell migration and cyclin E/FAK proteolysis triggered by EtOH. Results: Treatment of model cells with EtOH （0.3%） stimulated significant proteolysis of cyclin E/FAK in a dose-/time-dependent manner and increased migration （+47.30%， P＜0.05） in MCF-7 breast cancer cells， but had no significant effect on migration in MCF-10A cells. Pretreatment with Calpeptin （10 μmol/L）significantly reduced EtOH （0.3%）- or EGFR （10 ng/mL）-induced cyclin E/FAK truncation. EGFR-I （3 μmol/L） profoundly reduced EtOH-indcued CANP dependent proteolysis of CANP1 and cyclin E/FAK as well as cell migration（-53.00%， P＜0.01）. Conclusion: EtOH significantly stimulates activation of CANP via EGFR pathway， resulting in proteolysis of cyclin E/FAK and migration in MCF-7 breast cancer cells， suggesting EGFR-CANP signaling to be a potential target for suppression of metastasis in breast cancer.

Ethanol； Epidermal growth factor receptor； Calcium-activated neutral protease； Migration； Breast cancer

10.19401/j.cnki.1007-3639.2016.10.003

R737.9

A

1007-3639（2016）10-0820-06

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31360252）。

王旭東 E-mail: 1157102188@qq.com

（2016-01-05

2016-03-26）