高效液相色譜法檢測諾麗果漿及其中藥復(fù)方保健品中莨菪亭

陳 晨，劉平懷，羅 寧，李 昂，何沂飛，符 晶（海南大學(xué) 教育部熱帶多糖資源利用工程研究中心，熱帶作物種質(zhì)資源保護與開發(fā)利用教育部重點實驗室，海南 ?？?570228）

高效液相色譜法檢測諾麗果漿及其中藥復(fù)方保健品中莨菪亭

陳 晨，劉平懷*，羅 寧，李 昂，何沂飛，符 晶
（海南大學(xué) 教育部熱帶多糖資源利用工程研究中心，熱帶作物種質(zhì)資源保護與開發(fā)利用教育部重點實驗室，海南 海口 570228）

為研究諾麗果漿及其中藥復(fù)方保健品中莨菪亭的高效液相檢測方法，優(yōu)化色譜條件：依利特SinoChrom ODS-BP色譜柱（4.6 mm×200 mm，5 ?m），流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（30∶70，V/V），流速1 mL/min，柱溫25 ℃，進樣量20 ?L，檢測波長348 nm。結(jié)果表明，莨菪亭在0.5～20 ?g/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與其色譜峰峰面積線性關(guān)系良好，回歸方程Y=73.86X－0.554（R2=0.999），諾麗果漿和保健品中莨菪亭測定結(jié)果的平均回收率分別為104.05%和97.11%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.81%和1.99%。該方法準(zhǔn)確可靠，可用于定性、定量測定諾麗果漿及其保健品中的莨菪亭。

諾麗果漿；保健品；莨菪亭；高效液相色譜

諾麗（Morinda citrifolia Linn.）又稱海巴戟，為巴戟天屬茜草科植物，其果實諾麗果可用來治療多種疾病，如糖尿病、高血壓、心臟不適、疼痛、精神壓抑及消化不良等[1]，其葉則對牙齦炎、牙周炎、喉炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、皮膚病、扭傷等具有一定的療效[2]。生活在南太平洋島國的當(dāng)?shù)厝擞弥Z麗果保健養(yǎng)生已有2 000多年的歷史，并將之譽為“植物之后，上帝的恩賜”[3]。諾麗中主要的微營養(yǎng)成分是酚類物質(zhì)、有機酸和生物堿，其中，酚類物質(zhì)中最重要的是蒽醌[4-5]。其中莨菪亭（又名東莨菪素、東莨菪內(nèi)酯等）是酚類中最重要的組分之一，亦是諾麗果的功效性成分，其具有較強的生物活性，不僅能夠驅(qū)蟲[6]，還有祛風(fēng)、抗炎、止痛、祛痰作用，常見于中藥中治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，防治高尿酸血癥，降血壓血脂以及心肌保護作用等[7-11]。

之前，人們對諾麗的研究主要集中于對其化學(xué)成分[4-5,12-14]、藥理活性[1,2,15-18]、營養(yǎng)成分[19-20]以及組織培養(yǎng)[21-23]等方面的研究，而在將其研發(fā)成保健食品及相關(guān)質(zhì)量控制方面的研究相對較少。世界各國在發(fā)展保健品的過程中，大體都經(jīng)歷了3 個階段。目前，我國的保健品已發(fā)展至第3階段。第3代保健食品，不僅其特定生理調(diào)節(jié)功能需經(jīng)動物或人體實驗，且還需確知其功效性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)及含量。由于諾麗果漿屬于新食品原料，因此，其具有食用安全性[24]，且其功效性成分明確，故本實驗考慮以其為原料制成第3代保健食品。本實驗中先按25∶1的比例添加賦形劑麥芽糊精將諾麗果漿凍干，再混以其他中藥材及輔料制成原料自制諾麗復(fù)方保健品（顆粒沖劑劑型）。

莨菪亭在文獻[25]中“丁公藤”含量測定的參考流動相為：甲醇-水-冰醋酸（32∶68∶0.16，V/V）[25]，經(jīng)實驗證明，該流動相體系無法有效分離測定諾麗果漿及保健品中的莨菪亭。為定性、定量檢測諾麗果漿中的莨菪亭，以及判定粉末狀保健品中莨菪亭的檢測是否受其他原輔料的干擾，探索新的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

諾麗果漿 海南萬維生物制藥技術(shù)有限公司；復(fù)方保健品 實驗室自制；莨菪亭對照品（純度98%，批號40575）、磷酸（優(yōu)級純） 阿拉丁試劑（上海）有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 美國Tedia公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（包括230＋二極管陣列檢測器、P230恒流泵和EC-2000色譜工作站） 大連依利特公司；SCIENTZ-10Z冷凍干燥機 寧波新芝公司；RV10數(shù)顯旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國IKA公司；PHS-3G pH計 上海儀電公司；JP-040S超聲波清洗機 深圳市潔盟公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

取新鮮諾麗果漿，過濾后5 ℃冷藏備用。取新制復(fù)方保健品顆粒，置于研缽內(nèi)研碎，50 ℃真空干燥2 h備用。

1.3.2 莨菪亭含量的測定

1.3.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取莨菪亭對照品5 mg，用甲醇超聲輔助溶解后定容至100 mL，0.45 ?m濾膜過濾，取續(xù)濾液備用。

1.3.2.2 供試品溶液的制備

精密移取1 mL諾麗果漿于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，超聲輔助提取，因水溶果漿會存在部分高聚物，因此，過濾之后，收集濾液重新定容至10 mL，再用0.45 ?m濾膜過濾后備用。

精密稱保健品粉末0.1 g，加甲醇超聲輔助溶解后定容至10 mL，0.45 ?m濾膜過濾后備用。

1.3.2.3 色譜條件

色譜柱：依利特SinoChrom ODS-BP（4.6 mm×200 mm，5 ?m）；檢測波長：348 nm；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（30∶70，V/V）；流速：1 mL/min；進樣量：20 ?L；理論塔板數(shù)以莨菪亭計算不低于5 000。

1.3.3 專屬性實驗

1.3.3.1 輔料干擾實驗

分別取供試品諾麗果漿1 mL，諾麗復(fù)方保健品1 g，置于10 mL容量瓶中，在用甲醇超聲輔助溶解后的溶液加入適量輔料，加溶劑稀釋至刻度，搖勻、濾過，取過濾后的液體作為輔料干擾實驗供試品溶液。

1.3.3.2 未破壞實驗

分別取供試品諾麗果漿1 mL，諾麗復(fù)方保健品1 g，置于10 mL容量瓶中，之后分別按照諾麗果漿和諾麗復(fù)方保健品供試品溶液配制對其進行處理。

1.3.3.3 高溫水浴破壞實驗

分別取供試品諾麗果漿1 mL，諾麗復(fù)方保健品1 g，置于10 mL容量瓶中，將用甲醇超聲輔助溶解后的溶液置于70 ℃條件下水浴破壞40 min，冷卻，加溶劑稀釋至刻度，搖勻、濾過，取過濾后的液體作為高溫水浴破壞供試品溶液。

分別取供試品諾麗果漿1 mL，諾麗復(fù)方保健品1 g，置于10 mL容量瓶中，將用甲醇超聲輔助溶解后的溶液置于70 ℃恒溫干燥箱破壞40 min，冷卻，加溶劑稀釋至刻度，搖勻、濾過，取過濾后的液體作為高溫烘箱破壞供試品溶液。

1.3.3.5 強光破壞實驗

分別取供試品諾麗果漿1 mL，諾麗復(fù)方保健品1 g，置于10 mL容量瓶中，將用甲醇超聲輔助溶解后的溶液置于光照強度為（4 500±500） lx的光照箱中48 h，加溶劑稀釋至刻度，搖勻、濾過，取過濾后的液體作為強光破壞供試品溶液。

1.3.3.6 氧化破壞實驗

分別取供試品諾麗果漿1 mL，諾麗復(fù)方保健品1 g，置于10 mL容量瓶中，在用甲醇超聲輔助溶解后的溶液中加入0.3%過氧化氫溶液1 mL，搖勻，于室溫條件下放置15 h后，加溶劑稀釋至刻度，搖勻、濾過，取過濾后的液體作為氧化破壞供試品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察結(jié)果

從圖2可看出，谷索的就位對吊索索力影響很小；脊索就位對不同索的索力影響不同；膜的安裝將提高吊索的索力。

2.1.1 系統(tǒng)適應(yīng)性

圖1 莨菪亭高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatogram of scopoletin

按藥典中的色譜條件所得莨菪亭對照品色譜圖如圖1A所示，莨菪亭對照品峰前沿較嚴(yán)重且出峰時間過久，無法準(zhǔn)確對莨菪亭進行測定。在藥典色譜條件基礎(chǔ)上，用乙腈替換甲醇，同時使用磷酸溶液替換冰醋酸溶液，最終獲得色譜條件如1.3.2.3節(jié)。在此色譜條件下，以莨菪亭含量為指標(biāo)，連續(xù)進樣6 次考察高效液相色譜系統(tǒng)的適用性。如圖1B、C所示，莨菪亭峰與前一雜質(zhì)峰的分離度均大于1.5，其分離度較好，且理論塔板數(shù)均大于5 000，說明系統(tǒng)適應(yīng)性良好。而圖1A所示，按藥典中的色譜條件所得對照品色譜圖前沿較嚴(yán)重，出峰時間過久，無法準(zhǔn)確對莨菪亭進行測定。

2.1.2 專屬性實驗

根據(jù)1.3.3節(jié)實驗方法，專屬性實驗結(jié)果均有較強烈破壞，但專屬性好，在上述色譜條件下，能夠很好地檢測出破壞實驗后的莨菪亭含量及破壞實驗所產(chǎn)生的莨菪亭降解產(chǎn)物，因此可用上述色譜條件來測定本品中莨菪亭。

2.1.3 檢測限和定量限測定

將莨菪亭對照品溶液反復(fù)稀釋進樣，根據(jù)基線噪聲的3 倍確定檢測限，10 倍確定定量限[25]。結(jié)果確定在該色譜條件下莨菪亭的檢測限為0.011 ?g/mL，定量限為0.023 ?g/mL。定量限溶液重復(fù)進針6 次，峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.05%，說明檢測結(jié)果合理。

2.1.4 穩(wěn)定性實驗

取供試品溶液20 ?L注入色譜儀，分別于0、2、4、6、8 h和12 h測定莨菪亭峰面積，計算RSD值。如表1所示，果漿中莨菪亭的平均峰面積為252.26 μV?s，RSD為1.60%，保健品中莨菪亭的平均峰面積為129.60 μV?s，RSD為3.01%。結(jié)果表明諾麗果漿和保健品中莨菪亭在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表1 莨菪亭穩(wěn)定性實驗結(jié)果Table 1 Results of stability test

2.1.5 精密度實驗

取同一供試品溶液重復(fù)進樣6次，分別測定峰面積，計算RSD值。如表2所示，果漿中莨菪亭的平均峰面積為233.40 μV?s，RSD為0.89%，保健品中莨菪亭的平均峰面積為132.92 μV?s，RSD為2.07%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

表2 莨菪亭精密度實驗結(jié)果Table 2 Results of scopoletin precision test

2.1.6 重復(fù)性實驗

平行制備6 份供試品溶液，進樣后分別測定峰面積，計算RSD值。如表3所示，果漿中莨菪亭的平均峰面積為254.00 μV?s，RSD為1.44%，保健品中莨菪亭的平均峰面積為131.38 μV?s，RSD為2.43%。結(jié)果表明此方法重復(fù)性良好。

表3 莨菪亭重復(fù)性實驗結(jié)果Table 3 Results of reproducibility test

2.1.7 回收率實驗

精密稱取已知含量的果漿供試品3 份，每份分別精密稱取對照品按50%、100%、150%的對照品溶液質(zhì)量濃度配制成低、中、高3 份回收率溶液。將上述溶液過濾、定容并各進樣2 次分析，根據(jù)峰面積結(jié)果計算平均回收率和RSD值。如表4所示，其平均回收率為104.05%，RSD為0.81%，保健品中莨菪亭回收率實驗結(jié)果如表5所示，其平均回收率為97.11%，RSD為1.99%。結(jié)果說明本色譜條件的準(zhǔn)確性良好，能滿足諾麗果漿及諾麗復(fù)方保健品中莨菪亭含量的檢測。

表4 果漿中莨菪亭回收率實驗結(jié)果Table 4 Recovery of scopoletin spiked into noni juice

表5 保健品中莨菪亭回收率實驗結(jié)果Table 5 Recovery of scopoletin spiked into the health product

2.1.8 線性關(guān)系

分別吸取2.0、1.0、0.5、0.1、0.05 mL對照品溶液于5 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得20、10、5、1、0.5 ?g/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，0.45 ?m濾膜過濾，取續(xù)濾液備用。進樣，以色譜峰峰面積Y（μV?s）為縱坐標(biāo)，對照品質(zhì)量濃度X（?g/mL）為橫坐標(biāo)，得線性回歸方程為：Y=73.86X－0.554，R2=0.999 （n=5）。結(jié)果表明莨菪亭在0.5～20 ?g/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與其色譜峰峰面積線性關(guān)系良好。

2.1.9 耐用性實驗

改變檢測波長±5 nm，進樣后分別測定峰面積并計算莨菪亭含量，測得果漿RSD為0.428%，保健品RSD為1.72%；改變流速±0.1 mL/min，進樣后分別測定峰面積并計算莨菪亭含量，測得果漿RSD為0.33%，保健品RSD為0.67%。說明在波長、流速有小的變動時，主峰仍能得到較好的分離，所測定的有關(guān)物質(zhì)結(jié)果基本不變，說明此色譜條件的耐用性良好，能滿足本品中莨菪亭測定的要求。

2.2 樣品測定結(jié)果

準(zhǔn)確取3 批果漿及保健品樣品，注入高效液相色譜儀，分別平行測定3 次，取平均值，得果漿莨菪亭含量為29.8 μg/mL，保健品中莨菪亭含量為17.0 μg/g。

3 結(jié) 論

與文獻[25]“丁公藤”莨菪亭含量測定方法相比，本實驗建立的色譜方法能在相對合理的保留時間內(nèi)出峰（約6 min），且峰形、分離度和拖尾因子良好，能在較短的時間內(nèi)出峰完畢，減少雜質(zhì)的干擾，供試品的主峰分離良好，基線平整，可作為諾麗果漿中莨菪亭含量檢測的參考方法。

在專屬性實驗中，因莨菪亭含有酚羥基，具有弱酸性，故在對其進行堿性破壞時，破壞程度較大，主峰嚴(yán)重拖尾，難以準(zhǔn)確定量測定。故在實驗中流動相選擇加入少量磷酸的酸性溶液，保持峰形穩(wěn)定良好，利于莨菪亭的檢測。

本實驗建立的色譜條件下，測得保健品中莨菪亭的含量為17.0 μg/g，經(jīng)換算，還原成諾麗果漿中的莨菪亭含量與實際添加量偏差為－1.25%，故本保健品中的原輔料添加對莨菪亭含量測定無明顯干擾。

本實驗建立了一種高效液相色譜方法，能對諾麗果漿及其中藥復(fù)方保健品中莨菪亭含量進行有效地測定，此方法對新資源食品諾麗果漿的開發(fā)、檢測以及藥品的質(zhì)量控制具有一定的現(xiàn)實意義。

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Determination of Scopoletin in Noni Juice and Traditional Chinese Medicinal Compound Health Product Containing Noni Juice by HPLC

CHEN Chen, LIU Pinghuai*, LUO Ning, LI Ang, HE Yifei, FU Jing
(Key Laboratory of Protection and Development Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources, Ministry of Education, Key Study Center of the National Ministry of Education for Tropical Resources Utilization, Hainan University, Haikou 570228, China)

A high performance liquid chromatography (HPLC) method was established for the determination of scopoletin in noni juice and a traditional Chinese medicinal compound health product containing noni juice. The chromatographic separation was performed on an Elite SinoChrom ODS-BP column (4.6 mm × 200 mm, 5 ?m) using acetonitrile-0.1% phosphoric acid aqueous solution (30:70, V/V) as the mobile phase at a flow rate of 1 mL/min. The column temperature was 25 ℃, and the detection wavelength was set at 348 nm. The results showed a good linear relationship between peak area and scopoletin concentration in the range of 0.5–20 μg/mL. The average recoveries for noni juice and the health product containing noni juice were 104.05% and 97.11%, with relative standard deviations (RSDs) of 0.81% and 1.99%, respectively. This method proved to be accurate and reliable and could be used to qualitatively and quantitatively determine scopoletin in noni juice and the compound health product containing noni juice.

noni juice; health product; scopoletin; high performance liquid chromatography (HPLC)

10.7506/spkx1002-6630-201604015

R284.2

A

1002-6630（2016）04-0083-05

陳晨, 劉平懷, 羅寧, 等. 高效液相色譜法檢測諾麗果漿及其中藥復(fù)方保健品中莨菪亭[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(4): 83-87. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604015. http://www.spkx.net.cn

CHEN Chen, LIU Ping huai, LUO Ning, et a l. Determination of scopoletin in noni juice and its traditional Chinese medicine compound health care products by HPLC[J]. Food Science, 2016, 37(4): 83-87. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604015. http://www.spkx.net.cn

2015-05-15

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2011BAD14B01）；海南省中藥現(xiàn)代化科技專項（ZY201327）；

國家科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金項目（13C26244604892）；海南省產(chǎn)學(xué)研一體化項目（CXY20150034）

陳晨（1990—），男，碩士研究生，主要從事南藥研究與開發(fā)。E-mail：276676255@qq.com

*通信作者：劉平懷（1967—），男，教授，碩士，主要從事微藻生物能源及生物制藥研究。E-mail：twlph@163.com