中哈邊境艾比湖濕地游離蜱斑點(diǎn)熱群立克次體的分子流行病學(xué)研究

徐軍，王安東，羅丹，徐新龍，戴莉，楊杰，徐建軍，熱依罕古麗，薩尼葉古麗，王麗娜，杜景云，李志遠(yuǎn)，王遠(yuǎn)志

（1.新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局，新疆烏魯木齊832000；2.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子832000；3.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子832000；4.阿拉山口出入境檢驗(yàn)檢疫局，新疆阿拉山口833418；5.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052）

中哈邊境艾比湖濕地游離蜱斑點(diǎn)熱群立克次體的分子流行病學(xué)研究

徐軍1，王安東2，羅丹3，徐新龍4，戴莉4，楊杰4，徐建軍5，熱依罕古麗5，薩尼葉古麗5，王麗娜2，杜景云3，李志遠(yuǎn)2，王遠(yuǎn)志3

（1.新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局，新疆烏魯木齊832000；2.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子832000；3.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子832000；4.阿拉山口出入境檢驗(yàn)檢疫局，新疆阿拉山口833418；5.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052）

了解中哈邊境新疆艾比湖濕地游離蜱中斑點(diǎn)熱群立克次體的感染情況。利用斑點(diǎn)熱群立克次體外膜蛋白A（ompA）基因?qū)Π群竦赜坞x亞洲璃眼蜱、邊緣革蜱、血紅扇頭蜱進(jìn)行PCR檢測(cè)，并對(duì)陽(yáng)性樣本進(jìn)行測(cè)序和BLAST序列分析，并應(yīng)用Mega5.0軟件建立分子系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果中哈邊境地區(qū)艾比湖濕地游離蜱斑點(diǎn)熱群立克次體電泳陽(yáng)性率36.84%（56/152），BLAST分析顯示，艾比湖濕地游離蜱斑點(diǎn)熱群立克次體基因型為Rickettsia raoultii，與從匈牙利患蜱傳染的病人腫大淋巴結(jié)中分離獲得的R.raoultii關(guān)系最近，處于同一分支（GenBank登錄號(hào)為JQ798904）。結(jié)論是新疆艾比湖濕地游離蜱斑點(diǎn)熱立克次體感染較為嚴(yán)重，存在立克次體自然疫源地，應(yīng)盡快制定防制措施，以免危機(jī)動(dòng)物及人類健康。

斑點(diǎn)熱立克次體；游離蜱；ompA基因；分子流行病學(xué)；艾比湖濕地；阿拉山口口岸；中哈邊境

1材料與方法

1.1標(biāo)本采集2014年4-8月在新疆艾比湖濕地（44°43′N～45°12′N，82°35′E～83°11′E）用白布旗法采集游離蜱。

1.2蜱形態(tài)學(xué)鑒定使用體式顯微鏡（LEICA M165 C），以經(jīng)典的形態(tài)學(xué)鑒定為主要依據(jù)，參照鄧國(guó)藩［3］等國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)蜱傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類方法對(duì)蜱蟲進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.3斑點(diǎn)熱立克次體核酸檢測(cè)

1.3.1蜱蟲DNA提取按照TIANamp Genomic DNA Kit說(shuō)明書，進(jìn)行DNA提?。?只/1份），將提取的DNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2PCR擴(kuò)增根據(jù)Anstead Clare A.［4］已經(jīng)報(bào)道的ompA序列進(jìn)行PCR。50 μL PCR反應(yīng)體系包含如下成分：25 μL 2×Taq PCR Master Mix，1 μL 10 mmol/L ompA F，1 μL 10 mmol/l ompA R，2 μL DNA模板，21 μL dd H2O。按照預(yù)變性95℃30 s，循環(huán)95℃30 s，50℃30 s，72℃30 s，35個(gè)循環(huán)，總延伸72℃300 s進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.3.3序列分析及分子遺傳進(jìn)化分析選取PCR陽(yáng)性產(chǎn)物送北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中進(jìn)行BLAST進(jìn)行同源性分析，然后使用Mega6.0軟件進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2結(jié)果

2.1標(biāo)本采集結(jié)果經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，本次調(diào)查顯示，阿拉山口艾比湖濕地游離蜱隸屬1科3屬3種，分別為：血紅扇頭蜱（3.83%，15/392）、亞洲璃眼蜱（45.66%，179/392）、邊緣革蜱（50.51%，198/392）。2.2立克次體核酸檢測(cè)結(jié)果選取152份代表蜱種進(jìn)行PCR檢測(cè)，其中陽(yáng)性56份，陽(yáng)性率為36.84%（56/ 152）。其中：邊緣革蜱66.67%（54/81）；血紅扇頭蜱8.33%（1/12）；亞洲璃眼蜱1.69%（1/59）。

2.3PCR電泳結(jié)果PCR擴(kuò)增斑點(diǎn)熱群立克次體的產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，可得到533 bp左右的核酸片段，與預(yù)期片段大小相符（圖1）。

2.4序列分析BLAST分析顯示，測(cè)序結(jié)果均為Rickettsia raouhii（R.raoultii）基因型。結(jié)合Gen-Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中的其他斑點(diǎn)熱群立克次體種類，運(yùn)用Mega 6.0軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)、構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹顯示：與從匈牙利患蜱傳染的病人腫大的淋巴結(jié)中分離獲得的R.raoultii關(guān)系最近，處于同一分支（GenBank登錄號(hào)為JQ798904）。

表1艾比湖濕地蜱類及斑點(diǎn)熱群立克次體病原體檢測(cè)結(jié)果

圖1PCR擴(kuò)增ompA基因

圖2基于立克次體ompA基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3討論

本研究發(fā)現(xiàn)，阿拉山口地區(qū)斑點(diǎn)熱群立克次體陽(yáng)性率36.84%（56/152），高于疆內(nèi)夏爾西里森林革蜱陽(yáng)性率20%（14/70）［5］和博樂(lè)、塔城地區(qū)邊緣革蜱陽(yáng)性率16.22%（12/74）［6］，及東北地區(qū)森林革蟬中檢出的陽(yáng)性率3.7%（25/676）［7］和哈薩克斯坦邊緣革蜱陽(yáng)性率33.3%（6/18）［8］?？梢?jiàn)，阿拉山口艾比湖濕地游離蜱斑點(diǎn)熱立克次體具有高感染率，因此應(yīng)當(dāng)提醒當(dāng)?shù)芈糜?、工作人員做好防護(hù)，謹(jǐn)防立克次體感染。

本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，艾比湖立克次體基因?yàn)镽ickettsia raoultii，與新疆哈巴、和碩、博樂(lè)和塔城地區(qū)斑點(diǎn)熱群立克次體基因型相同［5-6］，進(jìn)一步說(shuō)明Rickettsia raoultii是新疆廣布種。文獻(xiàn)記載曾在哈薩克斯坦網(wǎng)紋革蜱、邊緣革蜱、草原革蜱中分離到Rickettsia raoultii［9］。阿拉山口作為面向中亞的重要口岸，隨著人員交流的日益頻繁和貨物的運(yùn)輸，增加了媒介生物隨著人員和貨物進(jìn)出境的風(fēng)險(xiǎn)。加之阿拉山口境內(nèi)的艾比湖濕地自然保護(hù)區(qū)，是新疆境內(nèi)3條候鳥遷徙路線（南亞路線、印巴路線、北非路線）的樞紐位置，是候鳥遷徙的主要驛站［10］，為蜱和蜱傳染原的傳播提供了非常便利的自然條件。因此該基因型為邊境地區(qū)長(zhǎng)期“盤踞”還是外來(lái)入侵？這有待進(jìn)一步調(diào)查和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。隨著“一路一帶”經(jīng)濟(jì)帶的推進(jìn)，新疆對(duì)外貿(mào)易將日益增大，因此應(yīng)增加邊境地區(qū)媒介生物監(jiān)測(cè)點(diǎn)，對(duì)立克次體隨著貨物、人員、野生動(dòng)物和候鳥遷徙流動(dòng)造成的疫病傳播具有重要意義。

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Molecular epidemiological study of thespotted fever group Rickettsia in free-living ticks in thewetlands of Aibi Lake，China-Kazakhstan border

XU Jun1，WANG An-dong2，LUO Dan3，XU Xin-long4，DAI Li4，YANG Jie4，XU Jian-jun5，REYihanguli5，SANiyeguli5，WANG Li-na2，DU Jing-yun3，LI Zhi-yuan2，WANG Yuan-zhi3
（1.Xinjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Authority of the PRC，Urumqi 830000，China；2.College of Animal Science and Technology，Shihezi University，Shihezhi 832000，China；3.College of Medicine，Shihezi University，Shihezi 832000，China；4.Alashankou Entry-Exit Inspection and Quarantine Authority of the PRC，Alashankou 833418，China；5.College of Veterinary Medicine，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China）

To investigate the prevalence of tick-borne spotted fever group Rickettsia（SFGR）in the wetlands of Aibi Lake，China-Kazakhstan border and to provide a scientific basis for the prevention and control of tick-borne SFGR.The OmpA gene ampliflcation was carried out for DNA samples extracted from Hyalomma asiaticum，Dermacentor marginatus，and Rhipicephalus sanguineus collected in the wetlands of Aibi Lake，China-Kazakhstan border and the positive samples were subjected to sequencing and sequence analysis to establish the molecular phylogenetic tree.56（36.84%）of the 152 DNA samples were positive for SFGR. The phylogenetic analysis based on nucleotide sequence showed that all detected SFGR strains were clustered together with（accessionnumbers：JQ798904）；These strains had the highest homology with Rickettsia raoultii（99.02%）.Tick-borne SFGR is prevalent in the wetlands of Aibi Lake on China-Kazakhstan border.Preventive measures should be taken in time to protect humans and animals from this disease.

Spotted Fever Rickettsia；free ticks；ompA gene；Molecular epidemiological；Aibi Lake；Ala-shankou Port；China-Kazakhstan border種立克次體［1-2］。新疆地域遼闊，生境多樣，蜱種豐富，但對(duì)其立克次體研究報(bào)道相對(duì)較少。本研究利用分子生物學(xué)方法，對(duì)新疆艾比湖濕地游離蜱斑點(diǎn)熱立克次體進(jìn)行核酸檢測(cè)和序列分析。

R 384.4

A

0529-6005（2016）08-0018-02

2015-11-05

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金（201442137-1）；國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014IK239）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201103008）

徐軍（1969-），男，高級(jí)獸醫(yī)師，碩士，從事動(dòng)物檢驗(yàn)工作，E-mail：alskxj@sina.com

王安東（1990-），男，碩士生，研究方向?yàn)楂F醫(yī)衛(wèi)生監(jiān)督與管理，E-mail：wadshzu@163.com

注：王安東與徐軍對(duì)本文具有同等貢獻(xiàn)