應用PCR-焦磷酸測序技術快速檢測小反芻獸疫病毒

王彩霞，楊貝娜，趙昱林，張永寧，呂繼洲，馮春燕，袁向芬，鄧俊花，吳紹強

（1.中國檢驗檢疫科學研究院動物檢疫研究所，北京朝陽100029；

2.中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京海淀100193；3.清華大學附屬中學，北京海淀100084）

應用PCR-焦磷酸測序技術快速檢測小反芻獸疫病毒

王彩霞1，楊貝娜2，趙昱林3，張永寧1，呂繼洲1，馮春燕1，袁向芬1，鄧俊花1，吳紹強1

（1.中國檢驗檢疫科學研究院動物檢疫研究所，北京朝陽100029；

2.中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京海淀100193；3.清華大學附屬中學，北京海淀100084）

為適應小反芻獸疫快速、準確、高通量診斷的需求，建立一種基于PCR及焦磷酸測序技術平臺的小反芻獸疫病毒鑒定方法。對GenBank中已公布的小反芻獸疫病毒N基因序列進行分析，設計專用引物進行PCR擴增及焦磷酸測序，測得序列經比對分析可以確定是否為小反芻獸疫病毒感染。采用所建立的PCR-焦磷酸測序方法對西藏采集的10份血清樣品進行檢測，檢測結果表明，該方法可以用于小反芻獸疫病毒的檢測，而且該樣品可初步鑒定為疫苗株感染。

小反芻獸疫病毒；聚合酶鏈反應；焦磷酸測序；檢測

小反芻獸疫是由小反芻獸疫病毒引起的一種高度接觸性傳染病，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列入法定報告動物疫病，我國將其列為一類動物疫病，是《國家動物疫病中長期防治規(guī)劃（2012-2020年）》明確規(guī)定重點防范的外來動物疫病之一。小反芻獸疫于1842年在南非的科特迪瓦首次發(fā)生，隨后廣泛流傳于亞非各地，給相關國家及牧民帶來了巨大的經濟損失。2007年，我國西藏地區(qū)首次報告小反芻獸疫疫情，2013年疫情蔓延至新疆地區(qū)，隨后在甘肅、內蒙、遼寧等多地均有報道，至2014年5月底，全國多地發(fā)生小反芻獸疫疫情，給我國畜牧業(yè)造成了巨大的經濟損失，同時給羊及其產品的生產流通帶來嚴重影響。

目前，小反芻獸疫診斷技術主要有中和試驗（VN）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、免疫熒光抗體試驗（IFAT）及逆轉錄聚合酶鏈式反應（RTPCR）等方法［1-3］。焦磷酸測序技術（Pyrosequencing）是近幾年發(fā)展起來的一種能夠進行核酸序列擴增、測定及分析的新技術，具有高通量、快速、敏感等特點，可滿足口岸快檢快放的原則，在提高檢疫質量的同時加快檢疫速度［4］。本研究根據小反芻獸疫病毒N基因的保守區(qū)域設計專用引物進行RT-PCR擴增及焦磷酸測序，建立了小反芻獸疫病毒PCR-焦磷酸測序檢測、鑒定方法，并對從西藏地區(qū)采集的10份羊血清樣品進行檢測，結果表明，該方法可以有效檢測小反芻獸疫病毒，并可對感染毒株情況進行初步推斷，為我國小反芻獸疫病毒的快速檢測提供技術支撐。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品PPRV Nigeria75/1疫苗株，濃度為106.8TCID50/mL，經BEI滅活后，-80℃保存?zhèn)溆茫?0份羊血清病料采自西藏地區(qū)，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2試劑rTaq DNA聚合酶、DL-2 000 Marker、RT-PCR試劑盒One Step RNA PCR Kit（AMV）均為寶生物工程（大連）有限公司產品；PyroMark Gold Q96 SQA Reagents等相關測序試劑，購自凱杰企業(yè)管理（上海）有限公司；TRIZol LS Reagent試劑，購自Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1病毒RNA提取以滅活的PPRV Nigeria75/ 1疫苗株、血清為材料，用TRIZol法提取RNA，溶解于DEPC水中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物設計通過對PPRV N基因序列的對比分析，設計通用的RT-PCR引物、焦磷酸測序引物，疫苗株特異的RT-PCR引物、焦磷酸測序引物。通用型引物序列為：UPPRVF：5′-ACCCTCGTGAGGCTCAAA-3′，UPPRVR：5′-Biotin-CCTCCTGGTCCTCCAGAATC-3′，UPPRVS：5′-ATCGGCTGAG G CACT-3′，擴增產物長度為78 bp。疫苗株特異引物序列為：SPPRVF：5′-ACAGACTGGGGATGAACGAA-3′，SPPRVR：5′-Biotin-GGCTTTCCTGAGCGTGTTC-3′，SPPRVS：5′-AAACAGATGAGGGAGAGT-3′，擴增產物長度為180 bp。引物由上海英維捷基生物技術有限公司合成，滅菌水稀釋至10 μmol/L備用。

1.2.3PPRV通用型和疫苗株特異型RT-PCR擴增以滅活PPRV Nigeria75/1疫苗株基因組RNA為模板，按照TaKaRa One Step RNA PCR Kit（AMV）（DRR024A）試劑盒說明書進行RT-PCR擴增。

1.2.4單鏈模板制備及焦磷酸測序取10 μL PCR產物加ddH2O補充至50 μL后按照焦磷酸測序儀PyroMark Q96ID的操作說明上機進行測序反應。

1.2.5樣品檢測以所建立的PPRV焦磷酸測序方法檢測10份采自西藏的血清樣品RNA，同時設立陰陽性對照。

2結果

2.1小反芻獸疫病毒通用和疫苗毒RT-PCR擴增結果小反芻獸疫病毒通用RT-PCR和疫苗毒特異RT-PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，可見與預期大小一致的目的條帶，電泳結果見圖1。

圖1RT-PCR擴增產物電泳檢測結果

2.2焦磷酸測序結果分別對小反芻獸疫病毒通用RT-PCR擴增產物、疫苗毒特異RT-PCR擴增產物進行焦磷酸測序，測序結果見圖2。小反芻獸疫病毒通用焦磷酸測序方法測得序列為：5′-CTTCAGGCTG CAGGCCATGG CCAAGATTCT GGAGGACCAG-3′。將此序列在網上進行Blast分析，結果表明序列一致性為100%的均為小反芻獸疫病毒，此方法可以確定樣品是否為小反芻獸疫病毒感染。小反芻獸疫疫苗毒特異焦磷酸測序方法測得序列為：5′-CGCCTACACC AGCGACCAGAG AAGAAGTCA AAGCTGC-3′，測得序列經過比對分析，匹配一致的序列大部分為已公布的疫苗株序列，根據該比對結果可初步推斷樣品是否為疫苗毒感染。

2.3樣品檢測結果采用本研究所建立的小反芻獸疫病毒通用型和疫苗毒特異型RT-PCR方法檢測西藏采集的血清樣品，電泳結果顯示，小反芻獸疫通用型和疫苗毒特異型RT-PCR擴增產物均有目的條帶（圖略）。對存在目的條帶的RTPCR產物進行焦磷酸測序檢測，得到的序列經Blast分析可初步判斷為疫苗毒序列。由此可以判定，樣品內無PPRV基因IV系流行株，即野毒株感染陰性。

圖2RT-PCR擴增產物的焦磷酸測序結果

3討論

小反芻獸疫病毒（PPRV）基因組是不分節(jié)段的單股負鏈RNA，從3′至5′依次分布著N-P-MF-H-L6個基因，分別編碼6種結構蛋白和2種非結構蛋白［5］。其中N基因編碼的N蛋白是病毒內部含量最豐富的核衣殼蛋白。在感染動物血清中針對N蛋白的抗體占主導地位，基于該基因及蛋白表達而發(fā)展起來的診斷技術能快速區(qū)分鑒定小反芻獸疫和牛瘟的感染［6］。許多學者針對N基因結合新興的分子生物學技術建立了小反芻獸疫病毒的快速檢測方法。吳紹強等［7］以N基因作為靶基因建立了PPRV實時熒光PCR檢測方法并應用于動物及其產品的檢測。袁向芬等［8］針對N基因建立了小反芻獸疫疫苗毒株與強毒株的鑒別性熒光RT-PCR檢測方法。楊卓等［9］建立了小反芻獸疫病毒RT-LAMP快速檢測方法。

本研究采用PCR擴增和焦磷酸測序相結合的方法，進行小反芻獸疫病毒的測序檢測，以達到從基因序列水平上對病毒進行檢測鑒定的目的。根據小反芻獸疫病毒N基因的序列分析找出小反芻獸疫病毒的保守區(qū)域和疫苗毒的特異序列，利用焦磷酸測序儀攜帶的引物設計軟件設計測序專用的擴增引物（生物素標記）和測序引物。首先對PPRV進行RT-PCR擴增，然后以測序引物上機進行測序反應，反應結束儀器自動給出測得序列，通過對測得序列的比對分析可以確定樣品是否為小反芻獸疫病毒感染，并可根據疫苗株特異焦磷酸測序方法測得序列的比對分析結果對樣品的感染情況進行初步推斷，為下一步如何采取防控措施提供思路。

利用本研究所建立的方法對西藏采集的血清樣品進行檢測，結果顯示，樣品均存在小反芻獸疫病毒感染，但經特異性焦磷酸測序檢測，可初步推斷樣品均為疫苗免疫血清，不存在PPRV基因IV系流行株，即野毒株感染陰性。本研究所建立的檢測方法輔以目的片段特異堿基序列的焦磷酸測序方法進行病毒鑒定，使結果具有更強的可靠性和說服力，并且減少了由于PCR敏感性高而出現(xiàn)的假陽性結果，提高了檢測特異性，可對感染狀態(tài)進行準確鑒定。由此可見，本研究所建立的PCR-焦磷酸測序鑒定方法可以達到小反芻獸疫病毒基因序列水平上的快速鑒定，并可對樣品的毒株感染情況進行初步的推斷，在小反芻獸疫疫情的快速鑒定工作中具有一定的意義。

志謝：感謝西藏出入境檢驗檢疫局劉忠清研究員為本研究提供了來自西藏地區(qū)的羊血清樣品。

［1］Couacy-Hymann E，Bodjo S C，Koffi M Y，et al.The early detection of peste des petits ruminants（PPR）virus antigens and nucleic acid from experimentally infected goats using RT-PCR and immunocapture ELISA techniques［J］.Res Vet Sci，2009，87（2）：332-335.

［2］Bao J，Li L，Wang Z，et al.Development of one-step real-time RTPCR assay for detection and quantitation of peste des petits ruminants virus［J］.J Virological Methods，2008，148（1/2）：232-236.

［3］Sumption K J，Aradom G，Libeau G，et al.Detection of peste des petits ruminants virus antigen in conjunctival smears of goats by indirect immunofluorescence［J］.Vet Rec，1998，142（16）：421-424.

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［5］楊前平，李曉峰，索效軍，等.小反芻獸疫流行趨勢及防控研究進展［J］.湖北畜牧獸醫(yī)，2014，35（9）：73-75.

［6］龍云鳳，祝賀，楊建明，等.小反芻獸疫病毒N基因在昆蟲細胞中的表達［J］.動物醫(yī)學進展，2011，32（12）：1-5.

［7］吳紹強，林祥梅，劉忠清，等.小反芻獸疫實時熒光PCR檢測方法的建立及應用［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2009（5）：18-20.

［8］袁向芬，吳紹強，林祥梅.小反芻獸疫疫苗毒株與強毒株的鑒別性熒光RT-PCR檢測方法的建立［J］.中國動物檢疫，2012，29（7）：30-34.

［9］楊卓，于漢勛，李巍.小反芻獸疫病毒RT-LAMP快速檢測和鑒別方法的建立［J］.中國獸醫(yī)科學，2015，45（9）：930-936.

Application of PCR-Pyrosequencing Technology for Rapid Detection of Pestedes petits ruminants virus

WANG Cai-xia1，YANG Bei-na2，ZHAO Yu-lin3，ZHANG Yong-ning1，LV Ji-zhou1，
FENG Chun-yan1，YUAN Xiang-fen1，DENG Jun-hua1，WU Shao-qiang1
（1.The Institute of Animal Quarantine，Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100029，China；2.College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China；3.The High school Attached to Tisghua university，Beijing 100084，China）

To meet the needs for rapid，accurate and high-throughput diagnosis of Peste des petits ruminants virus（PPRV）infection，the PPRV detection assay combining with PCR amplification and pyrosequencing analysis was developed.Through comparison of the N gene sequences of PPRV isolates from different countries and areas in GenBank，two pairs of specific primers respectively targeting the conserved region and the specific region of the N gene sequence were designed for PCR amplification and pyrosequencing.The resulted sequences could be used to identify PPRV infection by Blast online.Ten sheep serum samples collected from Tibet areas were detected using the developed assay.Our results showed that the developed can be used for the detection of PPRV，and the 10 serum samples were identified as PPRV vaccine strain infection by the assay.

Peste des petits ruminants virus（PPRV）；Polymerase Chain Reaction（PCR）；pyrosequencing；detection

WU Shao-qiang

S852.65+9.5

A

0529-6005（2016）08-0003-03

2016-04-20

“十二五”國家科技支撐計劃課題（2013BAD12B01）

王彩霞（1982-），女，助理研究員，碩士，從事動物檢疫工作，E-mail：friday128@sina.com

吳紹強，E-mail：sqwu@sina.com