人Cosmc胞外段蛋白在昆蟲細(xì)胞Sf-9中的表達(dá)與純化研究①

謝秋玲　陶　悅　張小秦　莫　茜　金燕樑

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心風(fēng)濕免疫科，上海200127)

?

人Cosmc胞外段蛋白在昆蟲細(xì)胞Sf-9中的表達(dá)與純化研究①

謝秋玲陶悅張小秦莫茜金燕樑

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心風(fēng)濕免疫科，上海200127)

目的：利用昆蟲細(xì)胞Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)人Cosmc 胞外段蛋白，為體外研究Cosmc蛋白的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)，同時也為O-連接糖基化及相關(guān)疾病的研究提供思路。方法：采用Bac-to-Bac系統(tǒng)，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac1-Cosmc extracellular domain(pFastBac1- Cosmc ED)，轉(zhuǎn)化到含穿梭載體Bacmid的感受態(tài)細(xì)胞DH10Bac中，通過藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定，獲得重組轉(zhuǎn)座子rBacmid-Cosmc ED。在脂質(zhì)體介導(dǎo)下，重組病毒感染Sf-9無血清細(xì)胞，在Sf-9中表達(dá)Cosmc 胞外段蛋白，由于Cosmc N端加有昆蟲細(xì)胞信號肽HBM(Honey Bee Melittin)且不含有跨膜段，所以Cosmc胞外段蛋白表達(dá)后分泌到培養(yǎng)基上清中，通過SDS-PAGE和Western blot對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢測，并通過Ni-NTA親和層析柱對其進(jìn)行純化分析。結(jié)果：SDS-PAGE和Western blot分析顯示得到一條分子量約為33 kD的特異性條帶，與目的蛋白大小相符，質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)一步證明所得蛋白為Cosmc胞外段蛋白。結(jié)論：Sf-9細(xì)胞中可成功表達(dá)Cosmc胞外段蛋白，為進(jìn)一步研究Cosmc的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。

人Cosmc 胞外段；昆蟲細(xì)胞；桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)；表達(dá)純化

蛋白質(zhì)的糖基化方式主要有兩種：N-連接和O-連接[1]。其中，黏蛋白型O-聚糖的合成是在高爾基體中由一系列糖基轉(zhuǎn)移酶催化而成[2]。C1GALT1作為O-糖基化的關(guān)鍵酶，可催化半乳糖Gal從UDP-Gal轉(zhuǎn)移到Tn抗原(GalNAc α1-O-Ser/Thr-)上從而形成T抗原(Core 1 Galβ1,3 Gal NAc -α-O-Ser/Thr)。在哺乳動物細(xì)胞中，有活性的C1GALT1的形成需要其分子伴侶Cosmc(即C1GALT1C1)的共表達(dá)[3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是Cosmc發(fā)揮功能的主要場所[4]。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，Cosmc與C1GALT1結(jié)合從而促進(jìn)C1GALT1正確折疊并形成有活性的二聚體，當(dāng)各種原因?qū)е翪osmc缺乏或功能異常時，C1GALT1則由于不能正確折疊而積聚于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，錯誤折疊的C1GALT1會發(fā)生凝集，形成無酶活性的二聚體并與GRP78等蛋白分子形成低聚復(fù)合物而被轉(zhuǎn)運出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在胞漿中進(jìn)入蛋白酶體途徑降解從而失去生理功能[5]。Cosmc在一定程度上可以使已發(fā)生錯誤折疊的C1GALT1蛋白重新正確折疊而恢復(fù)酶的活性。因此，Cosmc作為C1GALT1特異性的分子伴侶，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)發(fā)揮著無可替代的調(diào)控功能[6]。

近年來，隨著研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)Cosmc與涉及糖基化異常的相關(guān)疾病如Tn綜合征、腫瘤、IgA腎病(IgAN)等的發(fā)生有關(guān)[7]。 Tn綜合征是一種累及血液系統(tǒng)的罕見的自身免疫性疾病，由于Cosmc功能異常導(dǎo)致C1GALT1活性降低，最終導(dǎo)致血細(xì)胞表面Tn抗原的表達(dá)所致。 研究證實，在該病患者中Cosmc基因存在自體突變：c.202C>T、c.393T>A、c.454G>A，其中c.202C>T、c.393T>A兩位點的突變均可導(dǎo)致Cosmc的表達(dá)及功能異常[8]。 此外，Cosmc異常與腫瘤的發(fā)生也有關(guān)系。當(dāng)Cosmc出現(xiàn)基因突變或表觀遺傳學(xué)改變時，Cosmc功能失活，細(xì)胞膜蛋白不能正常糖基化，從而表達(dá)Tn抗原，Tn抗原或唾液酸化的Tn抗原水平升高誘發(fā)腫瘤[9]。在關(guān)于IgAN的研究中發(fā)現(xiàn)外周血B淋巴細(xì)胞中Cosmc的表達(dá)量降低可導(dǎo)致IgA1鉸鏈區(qū)半乳糖基化異常[10]?；钚缘慕档?，進(jìn)而導(dǎo)致IgA1鉸鏈區(qū)半乳糖基化異常[10,11]。糖基化異常的IgA1易于自身聚集或者與相應(yīng)的抗體IgA和IgG結(jié)合形成大分子復(fù)合物而不能通過正常代謝途徑被清除，以致其在血液循環(huán)中的數(shù)量大幅增加，最終沉積于皮膚、胃腸道，以及腎小球毛細(xì)血管等組織臟器，從而出現(xiàn)相應(yīng)的臨床癥狀[11-14]。

總結(jié)以上的研究，我們發(fā)現(xiàn)Cosmc的功能異常與多種涉及O-糖基化的自身免疫性疾病的發(fā)生有關(guān)，但是由于對Cosmc結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)識有限，使其在疾病中的具體機(jī)制仍不清楚。本研究旨在利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在體外單獨表達(dá)Cosmc蛋白，從而為針對Cosmc的結(jié)構(gòu)、功能以及與C1GALT1的相互作用研究奠定基礎(chǔ)，同時也為涉及O-糖基化的相關(guān)自身免疫性疾病的研究以及治療提供新的切入點和策略依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株和質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Cosmc合成于南京金斯瑞生物科技有限公司，E.coliDH5α，E.coliDH10Bac和質(zhì)粒pFastBac1以及Sf-9昆蟲細(xì)胞購自Invitrogen公司。

1.1.2主要試劑構(gòu)建重組病毒主要用酶：BamHⅠ、Xho Ⅰ、T4DNA連接酶、Ex-Taq酶等購自TaKaRa公司；質(zhì)粒小提試劑盒/切膠回收試劑盒/PCR產(chǎn)物回收試劑盒等購自天根生化科技有限公司；轉(zhuǎn)染試劑(Cellfectin? Ⅱreagent)、Grace′s培養(yǎng)基、無血清昆蟲培養(yǎng)基Sf-900ⅡSFM等為Invitrogen公司產(chǎn)品；Anti-HisIgG購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Anti-CosmcIgG購自Abcam公司，X-gal、AmpicilinNa、IPTG為Sigma公司產(chǎn)品；PVDF膜購自GEHealthcare，標(biāo)記HRP的羊抗鼠、羊抗兔二抗購自CellSignalingTechnology公司；Westernblot顯色劑購自Milipore公司；引物CosmcF/CosmcR、M13F/M13R由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.2方法

1.2.1重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-CosmcED的構(gòu)建以購自南京金斯瑞生物科技有限公司的質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Cosmc為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，引物為Cosmc-F/Cosmc-R(引物序列見表1)。上游引物含有BamHⅠ酶切位點(*GGAATTCC*)，下游引物含有XhoⅠ酶切位點(*CCGCTC-GAG*)，其中*標(biāo)記的是保護(hù)堿基和酶切位點，利用該對引物擴(kuò)增出來的PCR產(chǎn)物含有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點。PCR反應(yīng)完成后，電泳鑒定并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，得到的純化產(chǎn)物用BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切， 與同樣經(jīng)雙酶切處理后的pFastBac1質(zhì)粒，在16℃連接2h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，得到轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-CosmcED(Cosmc-ED指Cosmc胞外段序列，堿基序列從第79位堿基C至957位堿基A，長度為879bp；相對應(yīng)的蛋白序列則從第27位氨基酸H(組氨酸)至第318位氨基酸D(天冬氨酸)，大小約33kD，GenBank序列號為NP_689905.1)。

1.2.2重組桿狀病毒穿梭載體rBacmid-CosmcED的構(gòu)建和鑒定將得到的重組質(zhì)粒pFastBac1-CosmcED轉(zhuǎn)化E.coliDH10Bac感受態(tài)細(xì)胞(含有經(jīng)修飾的桿狀病毒Bacmid)，在含有40μg/mlIPTG、100μg/mlX-gal、50μg/ml卡那霉素、7μg/ml慶大霉素及10μg/ml四環(huán)素的平板上培養(yǎng)48h后，挑取發(fā)生轉(zhuǎn)座作用生成的白色菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取重組病毒rBacmid-CosmcEDDNA，以重組病毒DNA為模板，利用Bacmid上的特異性引物M13F/M13R和/或基因特異性的上下游引物CosmcF/CosmcR進(jìn)行PCR鑒定(M13F和M13R為重組病毒上的特異性引物，引物序列見表1)。

1.2.3重組桿狀病毒的獲得蛋白表達(dá)分析從P3代病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞開始，因此需要獲得P3代病毒。用純化的重組病毒rBacmid-CosmcEDDNA轉(zhuǎn)染Sf-9細(xì)胞。在6孔板上每孔種植8×105個Sf-9細(xì)胞，Grace′s培養(yǎng)基2ml，室溫培養(yǎng)15min，使細(xì)胞貼壁，然后利用Cellfectin? Ⅱreagent(8μl)將重組病毒DNA(1μg)轉(zhuǎn)染至Sf-9細(xì)胞中。27℃培養(yǎng)3～5h后，移走轉(zhuǎn)染混合液，在每孔重新加入2ml無血清昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基Sf-900 ⅡSFM，置于27℃繼續(xù)培養(yǎng)，并密切觀察細(xì)胞形態(tài)變化。待細(xì)胞發(fā)生病毒感染變化時(約72h)，500r/min離心5min，P1代病毒主要存在于上清中。 接種病毒液所需體積的計算方法：在6孔板中每孔加入2ml懸浮細(xì)胞(2×106cells/well)，室溫下 貼壁1h；然后假定MOI= 0.1(MOI指每個細(xì)胞中病毒顆粒的數(shù)目，變化范圍為0.05～0.1)且接種病毒的滴度為1×106pfu/ml，需要加入的病毒接種液：病毒接種液(ml)=(MOI× 細(xì)胞數(shù))/接種病毒滴度，即每孔中需加入200μl接種病毒溶液。因此，將200μlP1代病毒接種到Sf-9細(xì)胞后，在27℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞72h；72h后，500r/min離心5min收集上清，即得到P2代擴(kuò)增病毒溶液，用同樣方法得到P3代病毒，病毒于4℃避光保存。

1.2.4重組蛋白CosmcED的Westernblot檢測選擇對數(shù)生長期Sf-9細(xì)胞(活細(xì)胞率 > 90%)，加入無血清培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)至2×106ml-1，取適量上述制備的P3代病毒溶液感染Sf-9細(xì)胞，27℃振蕩培養(yǎng)至細(xì)胞出現(xiàn)病毒感染變化(約72h)時，3 500r/min、4℃離心30min收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，以含有P1、P2、P3代病毒的細(xì)胞培養(yǎng)液上清作對照，進(jìn)行SDS-PAGE電泳；電泳結(jié)束后將凝膠上的蛋白用濕轉(zhuǎn)法(200mA恒流100min)轉(zhuǎn)至PVDF膜上；轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉封閉1h(室溫，輕微振蕩)；然后與一抗(分別使用Anti-HisIgG、Anti-CosmcIgG)稀釋液室溫下孵育1h；洗滌4次，每次5min(洗滌液：1×PBS+ 0.1%Tween-20 )；再分別與標(biāo)記HRP的羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗稀釋液室溫下孵育40min；再洗滌4次，每次間隔5min；最后加顯色液，Biotek酶標(biāo)儀顯色分析。

1.2.5重組蛋白CosmcED的Ni-NTA柱純化及鑒定P3代病毒溶液感染Sf-9細(xì)胞72h后，保留適量全細(xì)胞樣品(Wholecell)；4℃、3 500r/min離心30min收集含有目的蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)液上清并留樣(Supernatant)，將收集到的上清與平衡好的Ni-NTA膠在4℃混合30min；將混合液上樣于空的層析柱中(留樣Flowthrough)；用10倍柱體積的低濃度咪唑(40mmol/LIMD，Bindingbuffer) 洗脫非特異性結(jié)合的雜蛋白，保留適量洗脫液(Washing)；最后用3倍柱體積的高濃度咪唑(250mmol/LIMD，Elutionbuffer)洗脫目的蛋白，收集目的蛋白并留樣(Elution)。上述保留樣品加4×LDSloadingbuffer并于95℃煮沸10min后，上樣于10%的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳鑒定蛋白純度，并將純化后的單蛋白條帶切膠并進(jìn)行質(zhì)譜分析。

2　結(jié)果

2.1重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-CosmcED的構(gòu)建以質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Cosmc為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測得到位于750～1 000bp的DNA片段(圖1)， 與預(yù)期目的基因CosmcED片段872bp加保護(hù)堿基和酶切位點的大小吻合。將經(jīng)純化、酶切的基因CosmcED與經(jīng)同樣處理的載體pFastBac1質(zhì)粒連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)宿主E.coliDH5α，挑取PCR鑒定陽性的菌落提取質(zhì)粒，后進(jìn)行測序分析，測序結(jié)果表明CosmcED基因成功插入載體pFastBac1質(zhì)粒中。

2.2 重組穿梭載體rBacmid-CosmcED的構(gòu)建將重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac1-CosmcED轉(zhuǎn)化至E.coliDH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中， 篩選出3個發(fā)生轉(zhuǎn)座的白色菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后提取重組病毒DNA，并以重組病毒DNA為模板，CosmcF/CosmcR、CosmcF/M13R、M13F/Cosmc R 3對引物分別進(jìn)行PCR 擴(kuò)增鑒定(見圖2)，結(jié)果顯示：泳道1為Cosmc陽性對照；泳道、2、3、4使用目的基因特異性上下游引物Cosmc F/Cosmc R，擴(kuò)增得到的片段大小為879 bp，與目的基因大小相符；泳道5、6、7使用引物M13F/Cosmc R，與Cosmc ED片段加Bacmid上的3′序列的大小一致；泳道8、9、10使用Cosmc F/M13R，泳道8 PCR失敗，其余泳道所得片段與Cosmc ED片段加Bacmid上的5′序列的大小一致；證明Cosmc ED 基因片段已轉(zhuǎn)座到Bacmid上。

表1引物序列

Tab.1Primer sequence

primernameprimersequenceCosmcF5'-*CGCGGATCC*CACATTAGGATTGGTCATGGAAATAGAATGCACC-3'CosmcR5'-*CCGCTCGAG*GTCATTGTCAGAACCATTTGGAGGTAAGAAAACC-3'M13F5'-CCCAGTCA-CGACGTTGTAAAACG-3'M13R5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'

Note：M13F/M13R：Specific forward/reverse primer of recombinant Bacmid.

2.3重組桿狀病毒的獲得將重組病毒DNA轉(zhuǎn)染至Sf-9細(xì)胞,可見被轉(zhuǎn)染的Sf-9細(xì)胞出現(xiàn)如下病毒感染現(xiàn)象：轉(zhuǎn)染<24 h，細(xì)胞體積逐漸增大約25%～50% ，尤其是細(xì)胞核增大明顯；轉(zhuǎn)染24～72 h，細(xì)胞停止生長，胞漿內(nèi)出現(xiàn)較多囊泡、顆粒，細(xì)胞從平板上脫落；轉(zhuǎn)染>72 h,細(xì)胞開始溶解、壞死,證明重組病毒DNA成功轉(zhuǎn)染Sf-9(圖3)，并獲得重組桿狀病毒。

圖1　Cosmc ED基因片段的擴(kuò)增Fig.1　Fragment Cosmc ED amplified by PCRNote: M.DL 5 000 DNA marker;1.Amplified Cosmc ED.

圖2　重組穿梭載體rBacmid-Cosmc ED的鑒定Fig.2　Identification of rBacmid-Cosmc ED Note: M.DL 2000 DNA marker;1.Cosmc positive control;2-4.Products amplified by primers of Cosmc F and Cosmc R;5-7.Products amplified by primers of M13F and Cosmc R;8-10.Products amplified by primers of M13R and Cosmc F.

圖3　rBacmid-Cosmc ED轉(zhuǎn)染前后，Sf-9細(xì)胞的形態(tài)及大小比較Fig.3　Comparison of morphology and size of Sf-9 cells before and after transfection with rBacmid-Cosmc ED Note: A.Normal Sf-9 cells;B.Sf-9 cells transfected with rBacmid-Cosmc ED for 72 h;C.Histogram of the cell diameter of normal Sf-9 cells;D.Histogram of the cell diameter of Sf-9 cells after transfection.

圖4　Cosmc-ED蛋白的Western blot分析Fig.4　Western blot analysis of Cosmc-ED proteinNote: P1-P4.P1/P2/P3/P4 viral stock supernatant;Proteins in the supernatant were separated on a 10% SDS-PAGE gel under both non-reducing (left panel) and reducing (right panel) conditions.After being transferred to the PVDF membrane,the Cosmc-ED protein was probed with anti-His (A) and anti-Cosmc (B) antibody,respectively.

圖5　Cosmc-ED蛋白純化后的SDS-PAGE分析Fig.5　SDS-PAGE analysis of Cosmc-ED protein afterpurificationNote: M.Protein marker;1.Elution;2.Washing;3.Flow through;4.Supernatant;5.Whole cell.

2.4Western blot檢測Cosmc ED蛋白的表達(dá)取適量重組病毒感染無血清培養(yǎng)的Sf-9細(xì)胞，72 h后離心收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清， 以含有P1、P2、P3代病毒的細(xì)胞培養(yǎng)液上清作對照,分別用Anti-His IgG(圖4A)、Anti-Cosmc IgG(圖4B) 的抗體對其進(jìn)行Western blot檢測，結(jié)果顯示，P1中并沒有檢測到目的條帶，P2中條帶微弱，P3、P4代病毒感染細(xì)胞的上清在33 kD處有一條帶，而且大約在2倍分子量的位置處有高聚物的形成。Cosmc 胞外段蛋白是一個分子量約為33 kD的單聚體蛋白，而桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具備蛋白質(zhì)翻譯后加工和修飾能力,因此我們推斷33 kD處為Cosmc 胞外段蛋白，而約2倍分子量位置處的條帶可能是Cosmc 胞外段蛋白隨意折疊形成的二聚體。Western blot的結(jié)果證明我們構(gòu)建的重組病毒正確且目的蛋白在昆蟲細(xì)胞Sf-9中得到了特異性表達(dá)。

2.5Cosmc ED蛋白的Ni-NTA柱純化及鑒定用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)Sf-9細(xì)胞，在對數(shù)生長期(2×106cells/ml) 時進(jìn)行重組病毒的感染， 72 h后收集培養(yǎng)上清，采用Ni-NTA柱純化蛋白,經(jīng)低濃度咪唑洗脫非特異性蛋白，經(jīng)高濃度咪唑洗脫目的蛋白。收集每一步的洗脫液進(jìn)行電泳，可見純化后的蛋白在33 kD處有一條單帶(圖5)，且純化后的目的蛋白純度較高，經(jīng)蛋白定量測得昆蟲細(xì)胞表達(dá)的目的蛋白量約為2.76 g/ml培養(yǎng)上清。將圖5中的單一條帶切膠并進(jìn)行質(zhì)譜分析，質(zhì)譜結(jié)果顯示所測蛋白與Cosmc氨基酸的覆蓋率達(dá)60%以上，進(jìn)一步證明純化后的蛋白為Cosmc 胞外段蛋白。

3　討論

Cosmc是2002年由Ju等[3]首先報道的一種蛋白質(zhì)分子，它是一種由318個氨基酸組成的Ⅱ型跨膜蛋白，蛋白相對分子量約為36.4 kD，包括3個區(qū)域，分別為位于胞漿區(qū)的短N(yùn)端，跨膜區(qū)的螺旋結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞質(zhì)外的長C端。Cosmc的跨膜結(jié)構(gòu)域(Transmembrane domain,TMD)中含有18個氨基酸，該結(jié)構(gòu)域為Cosmc定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中所必需，當(dāng)該結(jié)構(gòu)域中一個半胱氨酸殘基發(fā)生突變時可阻止Cosmc同源二聚體中二硫鍵的形成以及其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的定位[4]。Cosmc僅特異性調(diào)節(jié)脊椎動物體內(nèi)的C1GALT1且Cosmc在脊椎動物體內(nèi)高度保守；而非脊椎動物體內(nèi)不存在Cosmc，其體內(nèi)C1GALT1通過Cosmc非依賴的調(diào)節(jié)途徑來正常發(fā)揮活性[15,16]。

Cosmc蛋白本身是一個含有二硫鍵的膜蛋白，含有糖基化等翻譯后修飾。之前我們曾嘗試在大腸桿菌中表達(dá)人Cosmc，但并未得到理想的表達(dá)效果。而桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)因具有宿主范圍廣、表達(dá)量高、加工修飾系統(tǒng)完備、使用安全等優(yōu)點而被人們廣泛應(yīng)用。本研究利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞Sf-9中成功表達(dá)并純化了Cosmc胞外段蛋白。但是，Western blot的結(jié)果顯示在目的蛋白大小2倍的位置處出現(xiàn)類似于二聚體等高聚物的形成，而且實驗中獲得的Cosmc胞外段蛋白很容易沉淀?？赡艿脑蚴荂osmc胞外段蛋白進(jìn)行體外表達(dá)時，由于跨膜區(qū)二硫鍵的缺失，導(dǎo)致其無法定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)而分泌到上清液中，引起其結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定，進(jìn)而出現(xiàn)Cosmc胞外端隨意折疊成雜亂的二聚體結(jié)構(gòu)，這導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)的更不穩(wěn)定，因此容易聚集形成沉淀。此外，研究表明Cosmc與C1GALT1在哺乳動物細(xì)胞中共表達(dá)，表明兩者之間存在物理空間關(guān)聯(lián)性。因此，體外單獨表達(dá)Cosmc 也可能是其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的原因。雖然本研究在體外成功表達(dá)了Cosmc胞外段蛋白，但關(guān)于該胞外段蛋白的穩(wěn)定性及功能還需要進(jìn)一步的探索，這也將成為我們下一步工作的重點，從而為相關(guān)疾病的研究奠定前期基礎(chǔ)。

[1]Surman M,Janik M.cAMP cascade in regulation of protein glycosylation[J].Postepy Biochem,2014,60(3):305-312.

[2]Tran DT,Ten Hagen KG.Mucin-type O-glycosylation during development[J].J Biological Chem,2013,288(10):6921-6929.

[3]Ju T,Cummings RD.A unique molecular chaperone Cosmc required for activity of the mammalian core 1 beta 3-galactosyltransferase[J].Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(26):16613-16618.[4]Sun Q,Ju T,Cummings RD.The transmembrane domain of the molecular chaperone Cosmc directs its localization to the endoplasmic reticulum[J].J Biological Chem,2011,286(13):11529-11542.

[5]Ju T,Aryal RP,Stowell CJ,etal.Regulation of protein O-glycosylation by the endoplasmic reticulum-localized molecular chaperone Cosmc[J].J Cell Biol,2008,182(3):531-542.

[6]Narimatsu Y,Ikehara Y,Iwasaki H,etal.Immunocytochemical analysis for intracellular dynamics of C1GalT associated with molecular chaperone,Cosmc[J].Biochemical Biophysical Res Communications,2008,366(1):199-205.

[7]Ju T,Wang Y,Aryal RP,etal.Tn and sialyl-Tn antigens,aberrant O-glycomics as human disease markers[J].Proteomics Clin Applications,2013,7(9-10):618-631.

[8]Ju T,Cummings RD.Protein glycosylation:chaperone mutation in Tn syndrome[J].Nature,2005,437(7063):1252.

[9]Ju T,Aryal RP,Kudelka MR,etal.The Cosmc connection to the Tn antigen in cancer[J].Cancer biomarkers :section A of Disease markers,2014,14(1):63-81.

[10]Qin W,Zhou Q,Yang LC,etal.Peripheral B lymphocyte beta1,3-galactosyltransferase and chaperone expression in immunoglobulin A nephropathy[J].J Int Med,2005,258(5):467-477.

[11]Kokubo T,Hiki Y,Iwase H,etal.Evidence for involvement of IgA1 hinge glycopeptide in the IgA1-IgA1 interaction in IgA nephropathy[J].J Am Soc Nephrol,1997,8(6):915-919.

[12]Novak J,Moldoveanu Z,Renfrow MB,etal.IgA nephropathy and henoch-schoenlein purpura nephritis:aberrant glycosylation of IgA1,formation of IgA1-containing immune complexes,and activation of mesangial cells[J].Contrib Nephrol,2007,157:134-138.

[13]Berthoux F,Suzuki H,Thibaudin L,etal.Autoantibodies targeting galactose-deficient IgA1 associate with progression of IgA nephropathy[J].J Am Society Nephrol,2012,23(9):1579-1587.

[14]Trnka P.Henoch-schonlein purpura in children[J].J Paediatr Child Health,2013,49(12):995-1003.

[15]Ju T,Zheng Q,Cummings RD.Identification of core 1 O-glycan T-synthase from Caenorhabditis elegans[J].Glycobiology,2006,16(10):947-958.

[16]Staudacher E.Mucin-Type O-Glycosylation in Invertebrates[J].Molecules,2015,20(6):10622-10640.

[收稿2016-02-03]

(編輯許四平)

Expression and purification of recombinant human Cosmc extracellular domain in Sf-9 insect cells

XIE Qiu-Ling,TAO Yue,ZHANG Xiao-Qin,MO Xi,JIN Yan-Liang.

Department of Rheumatology,Shanghai Children′s Medical Center Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200127,China

Objective:In the present study,Bac-to-Bac baculovirus expression system was used to obtain recombinant human Cosmc extracellular domain protein,which can lay the foundation for the research about the structure and function of Cosmc protein in vitro,and simultaneously provide ideas for the research of O-glycosylation and related diseases.Methods: The Cosmc extracellular domain (Cosmc-ED) gene was cloned into a transfer vector pFastBac1 to form the recombinant donor plasmid pFastBac1-Cosmc ED,which was transformed into competent cells DH10Bac.By using blue-white selection and PCR analysis,we could obtain recombinant shuttle vector rBacmid-Cosmc ED.Then,the recombinant gene DNA of rBacmid-Cosmc ED was used to transfect Sf-9 mediated by cationic lipid formulation,and the recombinant baculovirus bacmid was obtained,which was further used to infect the serum-free cell Sf-9 to express Cosmc-ED in the supernatant.Then the protein of interest was detected by SDS-PAGE and Western blot and purified with Ni-NTA affinity column.Results: SDS-PAGE and Western blot analysis showed a specific band about 33 kD,consistent with the interest protein.Mass spectrometry results further prove that the protein was Cosmc extracellular domain protein.Conclusion: Human Cosmc-ED protein can be successfully expressed in Sf-9 insect cells and laid basis for subsequent studies.

Human Cosmc extracellular domain;Insect cells;Baculovirus expression system (BEVS);Expression and purification

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.10.021

①本文受上海市浦東新區(qū)科技發(fā)展基金創(chuàng)新資金資助(No. PKJ2012-Y51)。

謝秋玲(1990年-)，女，碩士，主要從事過敏性紫癜發(fā)病機(jī)制的研究。

及指導(dǎo)教師：金燕樑(1964年-)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事兒童風(fēng)濕性疾病的研究，E-mail：jinyanliang2000@163.com。

R392.11

A

1000-484X(2016)10-1507-06