單核巨噬細胞極化在慢性活動性乙型肝炎中的表達及意義①

楊江華　林　敏　孫　靜　梁曼曼　王文節(jié)

(皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院感染性疾病科，蕪湖241001)

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單核巨噬細胞極化在慢性活動性乙型肝炎中的表達及意義①

楊江華林敏孫靜梁曼曼王文節(jié)

(皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院感染性疾病科，蕪湖241001)

目的：研究慢性活動性乙型肝炎患者單核巨噬細胞的數(shù)量與功能變化。方法：隨機選擇51例慢性乙型肝炎患者(其中輕中度20例，重度31例)以及正常對照13例。采用Percoll分層液分離PBMCs，以CD14標記單核細胞，流式細胞儀檢測PBMCs表面分子CD80、CD86、HLA-DR、CD163的表達；ELISA檢測血清細胞因子IL-10、IL-12與IL-23的水平；免疫組織化學染色檢測CD68在肝臟的分布。 結果：輕中度慢性乙型肝炎組、重度慢性乙型肝炎組CD80表達水平低于對照組。慢性乙型肝炎患者外周血單核細胞CD86的表達低于對照組，其中重度組與對照組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。慢性乙型肝炎患者HLA-DR的表達低于對照組，其中輕中度組與重度慢性乙型肝炎組間HLA-DR的表達水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。此外，慢性乙型肝炎患者外周血單核細胞CD163的表達明顯高于對照組(P<0.01)。慢性乙型肝炎患者肝臟匯管區(qū)CD68陽性細胞浸潤增加，匯管區(qū)增大(P<0.05)。輕中度慢性乙型肝炎組、重度慢性乙型肝炎組與對照組血清IL-10表達水平之間兩兩比較差異顯著，均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結論：慢性乙型肝炎患者巨噬細胞參與肝臟病變的發(fā)生，外周血中單核細胞存在M1型/M2型平衡失調(diào)，向M2型極化的現(xiàn)象，可能參與其慢性化發(fā)展。

單核細胞；巨噬細胞；極化；乙型肝炎

據(jù)全國人群血清流行病學調(diào)查顯示，我國乙型肝炎表面抗原攜帶者約為9 300萬人，其中慢性乙型肝炎患者高達2 000多萬[1]。此外，每年乙型病毒性肝炎的新發(fā)感染者達10萬之多。慢性乙型肝炎的發(fā)病機制尚未完全明了，研究認為，HBV感染后所造成的機體免疫功能低下是導致感染慢性化的因素之一。慢性乙型肝炎引起的肝細胞病變主要取決于機體的免疫應答，尤其是細胞免疫應答，而細胞免疫應答是由單核巨噬細胞所介導[2]。

單核巨噬細胞在各種微環(huán)境中，經(jīng)不同刺激物的誘導與調(diào)節(jié)可差異性地發(fā)生活化，向M1型或M2型單核巨噬細胞分化的過程稱之為極化(Polarization)[3]。近年來，單核巨噬細胞極化在多種疾病的發(fā)生中受到很大的關注[4]。M1型細胞的特點表現(xiàn)為：激活后自身抗原呈遞能力提高，大量促炎因子如TNF-α、IL-1、IL-12、IL-23、NO的釋放；表達大量的HLA-DR、CD80和CD86分子等； M1型巨噬細胞可作為效應細胞參與Th1型免疫應答，對細胞內(nèi)感染的病原體有殺傷作用[3]。M2 型細胞的特點是：能夠高表達 CD23、CD163等；特征性地高表達 IL-10 和低表達 IL-12[5]；主要是抑制 T 細胞增殖及機體的免疫應答，有助于病原體的免疫逃逸。

為此，本研究分析單核巨噬細胞在慢性乙型肝炎患者中的免疫表型和分泌特點等特性，確定其極化類型，從而了解其在慢性乙型肝炎發(fā)病中的意義。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床資料以皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院2013年11月～2014年11月收治的51例慢性乙型肝炎患者為研究組，其中輕中度慢性乙型肝炎20例，重度慢性乙型肝炎31例，診斷符合中華醫(yī)學會傳染病與寄生蟲病學分會和全國病毒性肝炎學術會議聯(lián)合修訂的病毒性肝炎診斷和分型標準[6]。所有患者住院前6個月內(nèi)均未接受過干擾素、拉米夫定等抗病毒藥物或免疫調(diào)節(jié)劑治療，排除合并其他嗜肝病毒以及EB病毒、巨細胞病毒、艾滋病病毒等其他病毒感染或傳染性疾病，排除其他自身免疫相關的疾病，排除高血壓、冠心病、糖尿病等其他基礎性疾病，并排除3個月內(nèi)輸血史。同時取13例正常人作為對照組。

1.1.2儀器和試劑Percoll為Sigma公司產(chǎn)品。FITC標記的抗CD14、PE-Cy5標記的抗CD80、PE-Cy5標記的抗CD86、APC標記的抗HLA-DR抗體、APC標記的抗CD163抗體以及同型對照抗體為美國eBioscience公司產(chǎn)品。免疫組化抗人CD68抗體為福建邁新公司產(chǎn)品。人血清細胞因子IL-10、IL-12與IL-23檢測試劑由美國Adlitteram Diagnostic Laboratories公司提供。FC500 MPL流式細胞儀為美國BECKMAN COULTER公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1Percoll分離PBMCs所有51例慢性乙型肝炎患者和13例健康體檢者均抽取清晨空腹靜脈血5 ml于肝素抗凝管中，并向離心管內(nèi)加入5 ml 60%的Percoll分層液，在上中層液體交界處可見乳白色混濁的薄薄的白膜層，即PBMCs。分別加入24孔培養(yǎng)板，每孔5×106細胞，37℃，5%CO2培養(yǎng)2 h后吸取培養(yǎng)上清，用RPMI1640輕輕洗滌培養(yǎng)孔3次以去除非貼壁細胞，收集貼壁細胞。

1.2.2CD14陽性單核細胞表面分子的檢測取貼壁細胞，每管1×105-6/100 μl個細胞。分別加入FITC標記的抗CD14、PE-Cy5標記的抗CD80、PE-Cy5標記的抗CD86、APC標記的抗HLA-DR抗體、APC標記的抗CD163抗體以及同型對照抗體各2 μl于標本管中，室溫孵育20～30 min，振蕩混勻、洗滌，重新懸浮細胞，上流式細胞儀檢測。

1.2.3細胞因子檢測血清細胞因子IL-10、IL-12與IL-23均采用ELISA雙抗體夾心法檢測，操作按照說明書。采用美國伯樂550型酶標儀測OD值，結果統(tǒng)計分析。

1.2.4免疫組織化學染色檢測CD68在肝臟的分布對部分病例行超聲引導下肝臟穿刺病理學檢測。取石蠟包埋的肝臟穿刺組織，石蠟切片脫蠟、水化；3%H2O2室溫孵育5～10 min；蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min，山羊血清封閉，室溫孵育10 min；滴加10 μl的抗人CD68抗體，37℃孵育2 h；滴加生物素標記二抗，37℃孵育10～30 min；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素，37℃孵育10～30 min，DAB顯色；在高倍視野(×400) 下，計數(shù)肝臟肝竇區(qū)及匯管區(qū)染色細胞數(shù)。

2　結果

2.1一般資料在檢測的64例標本中，健康對照組13例，其中男性8例，女性5例，平均年齡(44.62±5.58)歲；輕中度慢性乙型肝炎組20例，其中男性13例，女性7例，平均年齡(45.75±6.90)歲；重度慢性乙型肝炎組31例，其中男性21例，女性10例，平均年齡(50.35±6.47)歲。相關實驗室檢查結果見表1。

2.2慢性乙型肝炎患者肝臟CD68陽性巨噬細胞的數(shù)量免疫組化染色肝臟組織如圖1所示，慢性乙型肝炎患者隨著病情的加重肝臟匯管區(qū)炎癥細胞浸潤增多，匯管區(qū)增大。CD68陽性細胞在重度患者中數(shù)量為(48.0±6.3)個，以匯管區(qū)為主，多于輕中度患者(24.7±5.1)個(P<0.05)以及正常肝臟組織(16.0±5.1)個。由此提示，單核巨噬細胞參與慢性乙型肝炎肝臟病變的發(fā)展，隨著炎癥反應程度加重，局部浸潤增多。

表1各組實驗室檢查數(shù)據(jù)

Tab.1Laboratory data of each group

GroupsnALT(U/L)AST(U/L)TBIL(μmol/L)HBV-DNA(copies/ml)Mildandmoderategroup20212.8±183.5143.4±114.227.0±11.1(5.5±6.7)×106Severegroup31628.8±95.8425.7±90.745.3±20.9(1.8±5.1)×107Controlgroup1327.1±12.823.4±12.410.7±2.9

表2肝炎組和對照組單核細胞表面標記物水平

Tab.2Level of surface markers on mononuclear cells

GroupsnCD80(%)CD86(%)HLA-DR(%)CD163(%)Mildandmoderategroup2054.02±5.659.38±4.5146.19±8.702)26.47±8.08Severegroup3142.32±5.144.06±1.031)34.68±5.5949.01±4.95Controlgroup1366.32±1.5419.92±3.2063.38±7.3814.82±2.233)

Note：Compared with control group，1)P<0.001;compared with severe group，2)P<0.01;compared with mild-moderate group，3)P<0.001.

圖1　CD68陽性細胞在各組肝組織中的表達(×400)Fig.1　Expression of CD68 positive cells in liver tissue of three groups(×400)

表3肝炎組和對照組血清細胞因子水平

Tab.3Level of serum cytokines between hepatitis B group and control group

GroupsnIL-10(pg/ml)IL-12(pg/ml)IL-23(pg/ml)Mildandmoderategroup2068.3±59.613.12±1.633453.5±2431.3Severegroup3197.7±38.414.06±1.373202.3±1744.8Controlgroup1345.8±21.819.92±1.723978.6±1765.7

2.3慢性乙型肝炎患者外周血單核細胞表型的表達特點流式細胞儀檢測外周血CD14陽性單核細胞表面分子表達(表2)，結果顯示輕中度慢性乙型肝炎組、重度慢性乙型肝炎組CD80表達水平低于對照組，但統(tǒng)計學無差異。慢性乙型肝炎患者外周血單核細胞CD86的表達明顯低于健康對照組，其中重度組與對照組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。慢性乙型肝炎患者HLA-DR的表達低于對照組，其中輕中度慢性乙型肝炎組與重度慢性乙型肝炎組間HLA-DR的表達水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。此外，慢性乙型肝炎患者外周血單核細胞CD163的表達明顯高于對照組(P<0.01)。數(shù)據(jù)顯示，慢性乙型肝炎患者外周血M1型單核細胞(CD80、CD86和HLA-DR)的數(shù)量明顯低于對照組；M2型單核細胞(CD163)的數(shù)量增加，隨著乙型肝炎炎癥程度的變化而變化。

2.4慢性乙型肝炎患者血清IL-10、IL-12與IL-23水平比較三組間血清細胞因子IL-10、IL-12與IL-23水平(見表3)，輕中度慢性乙型肝炎組、重度慢性乙型肝炎組與對照組血清IL-10表達水平之間兩兩比較差異顯著，均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。慢性乙型肝炎組IL-12與IL-23均低于正常對照組，但統(tǒng)計學無差異。

3　討論

在正常生理情況下，機體外周血中M1型單核細胞與M2型單核細胞處于相互抑制、相互轉化的動態(tài)平衡狀態(tài)。慢性乙型肝炎引起的肝細胞病變主要取決于機體的免疫應答，尤其是細胞免疫應答，一旦上述平衡被打破，M1型單核細胞向M2型單核細胞發(fā)生漂移，機體的細胞免疫功能將受到抑制，導致HBV感染的慢性化[7]。

為觀察慢性乙型肝炎感染過程中，單核巨噬細胞在外周血以及肝臟組織中的數(shù)量以及功能變化，在本實驗中我們對慢性乙型肝炎患者按照輕中度、重度進行了分類，同時選取健康者作為對照，以明確外周血單核細胞M1型與M2型表面標記物表達水平的變化及其在慢性乙型肝炎發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，了解慢性乙肝患者的免疫狀態(tài)及慢性乙型肝炎的發(fā)病機制。研究結果顯示，慢性乙型肝炎患者肝臟匯管區(qū)炎癥細胞浸潤增加， CD68陽性巨噬細胞在重度患者肝細胞中及匯管區(qū)表達數(shù)量為(48.0±6.3)個，多于輕中度患者(24.7±5.1)個(P<0.05)，以及正常匯管區(qū)(16.0±5.1)。由此表明單核巨噬細胞參與慢性乙型肝炎肝臟病變的發(fā)生。

在外周血中，本實驗以CD80、CD86、HLA-DR的表達水平代表M1型單核細胞的功能狀況，以CD163的表達水平代表M2型單核細胞的功能狀況，觀察慢性乙型肝炎患者外周血單核細胞CD80、CD86、HLA-DR、CD163的表達水平。結果顯示，慢性乙型肝炎患者外周血單核細胞CD163的表達明顯高于健康體檢者外周血單核細胞CD163的表達，差異具有統(tǒng)計學意義；且輕中度慢性乙型肝炎、重度慢性乙型肝炎組間差異也具有統(tǒng)計學意義，隨著肝炎在宿主體內(nèi)的發(fā)生發(fā)展，CD163的表達水平逐漸升高。CD80和CD86作為表達在抗原遞呈細胞上重要的協(xié)同刺激分子,兩者既有相似之處又有區(qū)別，各自都在免疫應答過程中起到非常重要的作用。因此，我們用流式細胞儀檢測了慢性乙型肝炎患者及健康體檢者外周血單核細胞CD80和CD86的表達。結果顯示，慢性乙型肝炎患者外周血單核細胞CD80和CD86的表達明顯低于對照組外周血單核細胞CD80和CD86的表達，其中CD86差異具有統(tǒng)計學意義。CD80、CD86表達水平的下降提示了慢性乙型肝炎患者在抗原遞呈功能上存在著異常與缺陷，這可能是引起乙型肝炎病毒慢性感染的重要因素之一[7]。人體外周血單核細胞HLA-DR的表達水平能夠反映出機體的免疫功能狀態(tài)，在機體的免疫應答和調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮了重要作用[8]。目前有許多臨床證據(jù)表明，HLA-DR與乙肝病毒感染有關，在本實驗中，我們用流式細胞儀檢測了慢性乙型肝炎患者及健康體檢者外周血單核細胞HLA-DR的表達，結果顯示，慢性乙型肝炎患者外周血單核細胞HLA-DR的表達明顯低于健康體檢者外周血單核細胞HLA-DR的表達，差異具有統(tǒng)計學意義。HLA-DR作為單核細胞活化標志之一，其表達水平的升高提示單核細胞的活化，從而擁有更強的抗原遞呈能力，如果HLA-DR表達水平降低則提示單核細胞活化不足或缺陷[8]。

本研究測定慢性乙型肝炎患者及正常對照組血清細胞因子，以 IL-12、IL-23水平代表 M1型細胞，以IL-10 的水平代表M2型細胞，結果顯示，慢性乙型肝炎患者IL-12、IL-23 的水平低于正常對照組，其中IL-10在兩組間差異具有統(tǒng)計學意義。由此顯示：慢性乙型肝炎患者體內(nèi)存在 M1/M2失衡，其中M1型細胞功能抑制，M2型細胞功能增強，其與慢性乙型肝炎的發(fā)生、發(fā)展有關。在日本血吸蟲慢性感染過程中，通過自身抗原選擇性誘導M1型巨噬細胞向M2型分化，抑制機體全身及局部免疫應答，參與感染的慢性化及肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展[9,10]。

在持續(xù)性HBV慢性感染的過程中，慢性乙型肝炎患者外周血單核細胞CD80、CD86、HLA-DR、CD163的表達水平以及分泌細胞因子均發(fā)生了變化，同時肝臟巨噬細胞數(shù)量增加，參與肝臟炎癥病變。本實驗以CD80、CD86、HLA-DR的表達水平代表M1型單核細胞的功能狀況，以CD163的表達水平代表M2型單核細胞的功能狀況，從而直觀地反映出慢性乙型肝炎患者外周血中存在著單核細胞極化，為我們進一步了解慢性乙型肝炎的發(fā)生、發(fā)展，免疫病理狀態(tài)提供了理論基礎和實驗依據(jù)。此外，本研究提示我們可以通過適當干預單核細胞極化中的某些關鍵步驟，扭轉單核細胞已經(jīng)偏移的極化失衡，將有可能恢復單核細胞的免疫活性和功能，為從免疫學角度來預防和治療慢性肝炎開辟一條新的道路[11]。

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[收稿2015-12-02修回2016-02-19]

(編輯張曉舟)

Expression and significance of monocyte-macrophage polarization in chronic active hepatitis B patients

YANG Jiang-Hua,LIN Ming,SUN Jing,LIANG Man-Man,WANG Wen-Jie.

Department of Infectious Diseases,Yijishan Hospital,Wannan Medical College,Wuhu 241001,China

Objective:To research the number and function of monocyte-macrophages in patients with chronic active hepatitis B.Methods: The 51 chronic viral hepatitis B(CHB) patients were selected randomly,which consisted of 20 cases of mild-moderate,31 cases of severe group and 13 cases of healthy controls.PBMCs were separated by percoll.Monocytes were tagged by CD14,the molecules CD80,CD86,HLA-DR and CD163 were detected by flow cytometry which expressed on the surface of PBMCs.Serum cytokine were detected for IL-10,IL-12 and IL-23 by ELISA.The distribution of CD68 was detected in the liver by immunohistochemical staining.Results: The expressions of CD80 for all chronic hepatitis B patients were lower than the controls respectively,no matter mild-moderate or even severe group.Similarly,the HBV patients expressed lower level of CD86 in the peripheral blood mononuclear cells when compared with the control group.Furthermore,there was statistically difference between the levels of CD86 in severe group compared with control group (P<0.01).As the expression of CD80 and CD86,the levels of HLA-DR in the patents had also declined when compared with controls.While the HLA-DR levels in both the mild-moderate HBV hepatitis groups were statistically significant higher than the severe group (P<0.01).Different from the above all,the expression of CD163 in all chronic HBV hepatitis was higher than the control group.The CD68 positive cells in chronic HBV patients were observed and infiltrated increasingly in portal area and hepatic lobules (P<0.05).There were statistically significant differences of IL-10 levels between the mild-moderate group,severe group and the control group,respectively (P<0.01).Conclusion: Macrophages have participated in the pathological lesions of liver in CHB patients,among peripheral blood mononuclear cells,the phenomena of imbalance between type M1/M2 and polarization to type M2 have been observed,which participated in the development of the chronicity of CHB.

Mononuclear cell;Macrophages cell;Polarization;Viral hepatitis B

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.10.020

①本文為國家自然科學基金主任基金(81141083)和安徽省高校省級自然科學研究項目(KJ2014A271)。

楊江華(1972年-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事病原體慢性感染的免疫學機制研究，E-mail:yjhpath@163.com。

R39.3

A

1000-484X(2016)10-1503-04