良惡性乳腺腫瘤外周血基因差異表達(dá)研究①

何　浪　魏　娜　郭　政　王　丹

(電子科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,成都610054)

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良惡性乳腺腫瘤外周血基因差異表達(dá)研究①

何浪魏娜②郭政③王丹③

(電子科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,成都610054)

目的：利用基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，探討良惡性乳腺腫瘤患者外周血基因表達(dá)變化。方法：從GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取良性和惡性乳腺腫瘤患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)表達(dá)譜。GEO2R 在線工具篩選差異表達(dá)基因， DAVID 工具富集基因功能和通路。STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建差異表達(dá)基因蛋白產(chǎn)物相互作用的網(wǎng)絡(luò)，篩選核心基因。結(jié)果：良惡性乳腺腫瘤分別篩選到563和237個(gè)差異基因，乳腺癌差異基因涉及白細(xì)胞激活、血管生成等生物學(xué)過(guò)程以及白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移信號(hào)通路。IL8、RHOB、ITGB1等為關(guān)鍵基因。結(jié)論：良惡性乳腺腫瘤患者外周血基因表達(dá)模式存在明顯差異，為將外周血作為替代材料應(yīng)用于乳腺腫瘤的診斷及監(jiān)測(cè)研究開(kāi)辟了新思路。

乳腺腫瘤；外周血單個(gè)核細(xì)胞；差異表達(dá)基因；通路富集分析

乳腺癌是常見(jiàn)的女性惡性腫瘤，已排在肺癌之后，成為女性第二位常見(jiàn)惡性腫瘤[1]。外周血被認(rèn)為是無(wú)創(chuàng)性分子診斷的理想材料。外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)由眾多免疫細(xì)胞組成，是機(jī)體免疫防御體系的基本要素，監(jiān)控機(jī)體生理狀態(tài)，其基因表達(dá)模式的改變是機(jī)體對(duì)病理刺激做出的及時(shí)反應(yīng)[2]，相比于手術(shù)中一次取樣的腫瘤組織，外周血更具有動(dòng)態(tài)性。基因芯片的廣泛應(yīng)用，為疾病診斷、疾病發(fā)展機(jī)制研究提供了大量高通量的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，對(duì)這些數(shù)據(jù)的再分析可以為新的研究提供有價(jià)值的線索[3,4]。本研究比較了健康人群，良性、惡性乳腺腫瘤的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)mRNA基因表達(dá)譜，篩選分別與良惡性乳腺腫瘤表型相關(guān)的差異表達(dá)基因，并分析其涉及的關(guān)鍵通路，為尋找更為準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、實(shí)用的生物標(biāo)記，鑒別診斷和指導(dǎo)個(gè)體化治療提供新思路。

1　材料與方法

1.1材料基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)來(lái)源于基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(GEO，Gene Expression Omnibus， http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)[5]，材料為外周血，分離單個(gè)核細(xì)胞。采用Affymetrix公司出品的Affymet-rix Human Genome U133 Plus 2.0 Array生物芯片。GEO登陸號(hào)為GSE27562[6]，由LaBreche HG等提交，包括57例乳腺癌患者，37例良性乳腺腫瘤和31例乳腺X線攝影診斷為陰性的健康人外周血標(biāo)本。

1.2方法

1.2.1差異表達(dá)基因分析采用GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)的GEO2R在線分析工具進(jìn)行差異表達(dá)基因分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)。該工具基于R程序語(yǔ)言，利用R語(yǔ)言中GEOquery和limma程序包，應(yīng)用t檢驗(yàn)篩選差異表達(dá)基因[7]?；虮磉_(dá)譜數(shù)據(jù)具有高維度(檢測(cè)的基因數(shù)非常多，通常幾千甚至上萬(wàn))和小樣本量的特點(diǎn),需要多重假設(shè)檢驗(yàn)(Multiple test)控制，本研究中多重假設(shè)檢驗(yàn)控制采用Benjamini 和 Hochberg提出的假陽(yáng)性率控制法[8]。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)：P<0.05，校正P值(adjustedP-value) <0.05，基因表達(dá)值倍數(shù)變化(Fold change,FC)≥1.5。

1.2.2差異表達(dá)基因功能注釋和通路分析采用注釋及可視化整合分析數(shù)據(jù)庫(kù)( The Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery,DAVID)平臺(tái)，對(duì)差異表達(dá)的基因在基因本體(GO，Gene Ontology)中注釋其參與的生物學(xué)過(guò)程[9]，并進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū) (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析[10]。采用改良Fisher精確檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，分析差異表達(dá)基因是否在某個(gè)功能節(jié)點(diǎn)上出現(xiàn)過(guò)，得出有顯著關(guān)聯(lián)的基因功能類(lèi)或通路，按其P值排序后輸出功能類(lèi)表格，對(duì)這些基因進(jìn)行生物學(xué)解釋。P<0.05 ，多重檢驗(yàn)校正P值<0.05，富集到的基因數(shù)count>2為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.3差異表達(dá)基因核心蛋白篩選利用互作基因檢索工具(the Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes，STRING,http://string-db.org/)蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)[11]，分析乳腺癌外周血差異表達(dá)基因所編碼蛋白的相互作用關(guān)系，構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(Protein protein interaction，PPI)，互作評(píng)分combination score>0.4為存在互作的閾值條件。將STRING中所得蛋白互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件[12]，運(yùn)用其網(wǎng)絡(luò)分析(Network Analyzer) 插件計(jì)算節(jié)點(diǎn)的邊(Degree，即互作連線的數(shù)量)篩選網(wǎng)絡(luò)中心節(jié)點(diǎn)(Hub)。中心節(jié)點(diǎn)對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)為具有重要生理調(diào)節(jié)功能的核心蛋白質(zhì) (基因)。

2　結(jié)果

2.1差異表達(dá)基因良性和惡性乳腺腫瘤差異表達(dá)基因中上調(diào)、下調(diào)及其共同差異的基因的數(shù)目見(jiàn)圖1。二者共同的差異基因僅17個(gè)，均為表達(dá)上調(diào)基因。

2.2差異表達(dá)基因生物學(xué)功能注釋及信號(hào)通路分析GO功能注釋顯示，惡性乳腺腫瘤PBMCs差異表達(dá)上調(diào)的基因共富集到生物學(xué)過(guò)程(Biological process，BP)39條，其中免疫相關(guān)的功能22條，按P值排序，見(jiàn)表1。主要涉及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、白細(xì)胞激活、細(xì)胞遷移、創(chuàng)傷應(yīng)答、血管發(fā)育、細(xì)胞因子刺激反應(yīng)、造血細(xì)胞分化等免疫相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程。良性乳腺腫瘤PBMCs差異表達(dá)上調(diào)的基因共富集到4條，涉及淋巴造血器官發(fā)育。兩種表型的乳腺腫瘤PBMCs差異表達(dá)下調(diào)的基因均未富集到符合閾值條件的BP功能類(lèi)。

表1良性和惡性乳腺腫瘤分別相對(duì)于健康對(duì)照的差異表達(dá)基因功能注釋

Tab.1Gene Ontology categories enriched by differentially expressed genes among benign,malignant breast tumor and healthy control (HC)

AnnotationIDBiologicalprocessestermBreastcancerGO:0006928cellmotionGO:0007242intracellularsignalingcascadeGO:0045321leukocyteactivationGO:0001944vasculaturedevelopmentGO:0042127regulationofcellproliferationGO:0016477cellmigrationGO:0009611responsetowoundingGO:0001568bloodvesseldevelopmentGO:0048514bloodvesselmorphogenesisGO:0051674localizationofcellGO:0048870cellmotilityGO:0009991responsetoextracellularstimulusGO:0008285negativeregulationofcellproliferationGO:0032496responsetolipopolysaccharideGO:0034097responsetocytokinestimulusGO:0001525angiogenesisGO:0007243proteinkinasecascadeGO:0002237responsetomoleculeofbacterialoriginGO:0007167enzymelinkedreceptorproteinsignalingpathwayGO:0006916anti-apoptosisGO:0042981regulationofapoptosisGO:0045637regulationofmyeloidcelldifferentiationBenignbreasttumorGO:0020027hemoglobinmetabolicprocessGO:0030097hemopoiesisGO:0048534hemopoieticorlymphoidorgandevelopment

表2良性和惡性乳腺腫瘤分別相對(duì)于健康對(duì)照的差異表達(dá)基因KEGG通路分布(P<0.05)

Tab.2KEGG pathways enriched by differentially expressed genes among among benign,malignant breast tumor and healthy control (HC) (P<0.05)

PhenotypeKEGGIDTermGenesymbolBreastcancerhsa05120EpithelialcellsignalinginHelicobacterpyloriinfectionADAM10,IL8,MAPK14,JUN,HBEGF,PTPN11hsa05130PathogenicEscherichiacoliinfectionACTB,YWHAZ,FYN,TLR4,ITGB1hsa04722NeurotrophinsignalingpathwayYWHAZ,MAP3K1,MAPK14,JUN,BAX,YWHAE,PTPN11hsa04310WntsignalingpathwayCSNK1A1,TBL1XR1,CTBP1,JUN,PPP3R1,PPP2R5E,TCF7L2hsa04670LeukocytetransendothelialmigrationACTB,CYBB,CXCR4,MAPK14,ITGB1,PTPN11Benignbreasttumorhsa04722NeurotrophinsignalingpathwayRPS6KA6,BCL2,YWHAB,YWHAQ,ARHGDIA,ARHGDIB,PTPN1

圖1　良性和惡性乳腺腫瘤患者PBMCs較健康人群的差異表達(dá)基因Fig.1　Number of differentially expressed genes among benign,malignant breast tumor and healthy control (HC)Note: Significant differential expression is represented by an absolute FC ≥1.5,P<0.05,adjusted P<0.05.

表3乳腺癌外周血差異表達(dá)上調(diào)核心蛋白

Tab.3Hub genes selected based on up-regulated DEGs

GenesymbolDegreeJUN44MAPK1439FOS36EGR127IL822RHOB19ACTB18YWHAZ17ITGB113

Note：Node degree is topological parameter used for gene prioritization in the network.

良惡性乳腺腫瘤PBMCs差異表達(dá)下調(diào)的基因均沒(méi)有富集到符合顯著性閾值的通路。乳腺癌PBMCs差異表達(dá)上調(diào)的基因擾動(dòng)的通路集中在致病菌感染、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)、幽門(mén)螺桿菌感染上皮細(xì)胞信號(hào)、Wnt信號(hào)及白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移。良性乳腺腫瘤PBMCs差異表達(dá)上調(diào)的基因僅富集到1條KEGG通路，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)，涉及的基因與上述乳腺癌PBMCs涉及該通路的差異基因無(wú)交疊。通路按P值排序，見(jiàn)表2。

2.3乳腺癌外周血差異表達(dá)關(guān)鍵基因篩選以乳腺癌外周血PBMCs差異表達(dá)上調(diào)的203個(gè)基因構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，除去孤立無(wú)互作的蛋白節(jié)點(diǎn)，篩選出157個(gè)上調(diào)基因編碼的蛋白質(zhì)具有相互作用關(guān)系，構(gòu)成了包含有552個(gè)互作邊關(guān)系的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。以節(jié)點(diǎn)的邊Degree>10為標(biāo)準(zhǔn)篩選中心節(jié)點(diǎn)，獲得Hub genes 9個(gè)，見(jiàn)表3。

3　討論

腫瘤被認(rèn)為是系統(tǒng)性疾病[13]，腫瘤組織與宿主之間的相互作用，不僅局限于腫瘤微環(huán)境中，還涉及到遠(yuǎn)處組織器官和系統(tǒng)免疫反應(yīng)。脈管系統(tǒng)作為運(yùn)輸工具，因其貫穿機(jī)體所有器官而成為腫瘤系統(tǒng)效應(yīng)的中樞，其中最主要的是外周血，包含了大量免疫細(xì)胞，是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成。應(yīng)用生物信息學(xué)的方法，本研究分別比較了良性和惡性乳腺腫瘤患者外周血單個(gè)核細(xì)胞與健康人群的差異，評(píng)估兩種表型在外周血細(xì)胞是否存在表達(dá)模式的差異，并進(jìn)一步了解乳腺癌在機(jī)體引發(fā)的系統(tǒng)效應(yīng)，為腫瘤診斷、治療及預(yù)后監(jiān)測(cè)提供新策略[14-17]。

研究中發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是良性還是惡性乳腺腫瘤，患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中基因表達(dá)改變主要為表達(dá)上調(diào)，其中良性乳腺腫瘤PBMCs基因差異表達(dá)范圍更為廣泛，表明乳腺腫瘤組織在體內(nèi)的存在，刺激了機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)答，在外周血中表現(xiàn)明顯。差異表達(dá)基因的功能及通路分析表明，盡管良性乳腺腫瘤PBMCs差異表達(dá)基因數(shù)量較多，但其差異表達(dá)過(guò)于寬泛，缺乏針對(duì)性，涉及的功能較少，僅富集到血紅蛋白代謝相關(guān)的3條功能類(lèi)，而乳腺癌PBMCs差異表達(dá)基因從功能上看更多涉及免疫反應(yīng)。腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中產(chǎn)生腫瘤特異性抗原，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)，良惡性乳腺腫瘤在免疫原性上的差異，可能是外周血產(chǎn)生應(yīng)答差異的主要原因。進(jìn)一步地，本研究通過(guò)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，得到乳腺癌PBMCs差異表達(dá)上調(diào)的關(guān)鍵基因9個(gè)。

關(guān)鍵基因c-jun和c-fos均屬于早期反應(yīng)基因(Immediate early genes,IEGs)，針對(duì)各種刺激迅速做出反應(yīng)[18]。前炎癥轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子在乳腺癌PBMCs差異表達(dá)基因中顯著上調(diào)，并處于核心位置，表明宿主免疫系統(tǒng)狀態(tài)傾向于固有免疫激活?；罨拿庖呒?xì)胞由外周血招募至腫瘤局部，穿越血管內(nèi)皮進(jìn)入腫瘤間質(zhì)，成為腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的同時(shí)也為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供了生長(zhǎng)因子、基質(zhì)重塑因子和新生血管。免疫細(xì)胞招募及其趨化作用與乳腺癌進(jìn)展和預(yù)后之間的相關(guān)性以及在治療方面的應(yīng)用也日益成為研究的熱點(diǎn)[19,20]。

關(guān)鍵基因中IL-8、RHOB參與了血管生成(Angiogenesis)生物學(xué)過(guò)程。異常的血管增生是實(shí)體腫瘤的固有特征之一，促血管因子可來(lái)自于腫瘤細(xì)胞，也可來(lái)自于激活的免疫細(xì)胞。例如，參與固有免疫的細(xì)胞，尤其是巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞以及骨髓造血祖細(xì)胞均在血管生成轉(zhuǎn)換(Angiogenic switch)中扮演重要的角色[21]。IL-8，可直接促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、管腔形成及遷移，不依賴(lài)于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子途徑[22]，降低IL-8表達(dá)可削弱腫瘤性血管生長(zhǎng)[23]。RHOB屬于GTP酶Ras超家族，可激活血管內(nèi)皮細(xì)胞Akt信號(hào)通路，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞存活和生長(zhǎng)，介導(dǎo)腫瘤血管生成[24]。IL-8,RHOB在乳腺癌外周血細(xì)胞差異表達(dá)基因中處于關(guān)鍵位置，可能介導(dǎo)了免疫細(xì)胞促血管生成作用，進(jìn)而影響乳腺癌的預(yù)后。

關(guān)鍵基因中ACTB、MAPK14、ITGB1參與了白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移通路(hsa04670:Leukocyte transendothelial migration)。外周血管中的白細(xì)胞穿越血管內(nèi)皮細(xì)胞，向組織趨化的過(guò)程為跨內(nèi)皮遷移(Transendothelial migration，TEM)，是免疫監(jiān)視和炎癥反應(yīng)中的第一步。TEM全過(guò)程依賴(lài)于白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的識(shí)別、黏附和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，涉及大量的分子相互作用[25,26]。ITGB1基因編碼整合素β1，是整合素家族的跨膜受體。整合素在多數(shù)白細(xì)胞表達(dá)，包括T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞等，通過(guò)與纖連接蛋白(Fibronectin)相互作用，介導(dǎo)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞識(shí)別、黏附及白細(xì)胞溢出循環(huán)系統(tǒng)。Integrin α4 和β1結(jié)合形成異二聚體VLA-4(Very Late Antigen-4),介導(dǎo)免疫細(xì)胞向炎癥部位的趨化。最近的研究表明，骨髓來(lái)源的造血祖細(xì)胞通過(guò)VLA-4，經(jīng)外周血循環(huán)向Fibronectin較豐富的部位趨化，協(xié)助形成適于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的前轉(zhuǎn)移微環(huán)境[27]。ITGB1在上調(diào)基因中的中心位置，表明其可能是協(xié)助乳腺癌外周血免疫細(xì)胞進(jìn)入腫瘤局部微環(huán)境的主要分子，對(duì)其深入研究將有可能明確乳腺癌外周血與腫瘤組織局部免疫微環(huán)境之間的相互聯(lián)系。

綜上，本研究利用生物信息學(xué)工具，分析了良性和惡性乳腺腫瘤外周血單個(gè)核細(xì)胞的基因表達(dá)變化。結(jié)果顯示，良惡性乳腺腫瘤患者的外周血基因表達(dá)變化模式存在明顯的差異，乳腺癌患者外周血表現(xiàn)出免疫炎癥反應(yīng)，外周血可能作為替代材料，用于評(píng)估乳腺癌患者的免疫狀態(tài)。篩選得到的關(guān)鍵基因，如IL-8、RHOB、ITGB1等，調(diào)節(jié)白細(xì)胞活化，血管生成及白細(xì)胞跨內(nèi)膜遷移，在乳腺癌引發(fā)的系統(tǒng)免疫效應(yīng)中可能起了重要作用，其在乳腺癌外周血細(xì)胞向腫瘤局部趨化過(guò)程中的作用值得深入研究，為乳腺癌的診斷、患者個(gè)體化治療方案制定、監(jiān)測(cè)等提供新的思路。

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[收稿2016-03-02修回2016-04-13]

(編輯許四平)

Gene expression profiles analysis identifies key genes of PBMCs in patients with benign and malignant breast tumor

HE Lang,WEI Na,GUO Zheng,WANG Dan.

School of Life Science and Technology,University of Electronic Science and Technology of China,Chengdu 610054,China

Objective:To observe the changes of gene expression in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) of benign and malignant breast tumor based on gene expression profiling. Methods: Datasets of gene expression profiling were downloaded from the GEO database,including PBMCs profilings of benign breast tumor,breast cancer and healthy controls.GEO2R tool was used to analyze the data to identify the differentially expressed genes (DEGs).Function of DEGs were annotated by DAVID.Protein interaction analysis and hub gene select were then performed using STRING database. Results: 563 and 237 DEGs respectively were identified.DEGs in breast cancer involved in biological process of leukocyte activation,angiogenesis and leukocyte transendothelial migration.The hub genes are IL8，RHOB，ITGB1. Conclusion: The data suggests that gene expression patterns of these two profilings are different at a certain degree.PBMCs maybe a better noninvasive material for biomarker detection of benign and malignant breast tumor.

Breast tumor;PBMCs;Differentially expressed gene;Pathway enrichment analysis

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.10.004

①本文為國(guó)家自然科學(xué)基金(81201702)和四川省衛(wèi)計(jì)委科研項(xiàng)目(No.120491;No.130295)。

，同時(shí)就職于福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，福州350108，E-mail：gz0163@yeah.net；E-mail：helle@cmc.edu.cn。

何浪(1979年-), 女,博士，副教授，主要從事腫瘤免疫，抗腫瘤藥物篩選，同時(shí)就職于成都醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)系，E-mail：helang79@sohu.com。

R730.3

A

1000-484X(2016)10-1424-05

②四川省腫瘤醫(yī)院，成都 610041。